核酸化学-理化性质.ppt

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1、目目 录录第八章第八章 核酸化学核酸化学目目 录录第一节第一节.核酸概述核酸概述第二节第二节.核酸的结构核酸的结构第三节第三节.核酸的物理化学性质核酸的物理化学性质第四节第四节.核酸的研究方法核酸的研究方法核核 酸酸 的的 理理 化化 性性 质质第第 三三 节节目目 录录P503一、核酸的一般性质(了解)核酸和核苷酸既有磷酸基，又有碱性基团，所以是两性电解质，由于磷酸酸性较强常表现酸性。晶形-DNA为白色纤维状固体，RNA为白色粉末。粘度大多数DNA为线性分子，分子极不对称，长度可达几厘米，而直径只有几纳米，所以即使是极稀的DNA溶液，也有极大的粘度，RNA溶液的粘度要小得多。溶解性：微溶于水

2、(溶液呈酸性)，不溶于一般有机溶剂，在70%乙醇中形成沉淀=用70-95%乙醇提纯核酸。核苷酸无色、溶于水。RNA易溶于低盐(0.14MNaCl)，DNA易溶于高盐浓度(1M NaCl)。室温下，稀碱能水解RNA，而DNA稳定。稀酸可水解DNA，而浓酸可水解RNA。旋光性-均很强二、核酸的水解(P503,掌握)l核酸碱基与戊糖形成的N-糖苷键。磷酸基与两种糖分别形成核糖磷酸酯和脱氧核糖磷酸酯。这些糖苷键和磷酸酯键都能被酸酸或碱碱和酶酶水解。l糖苷键和磷酸酯键都能发生酸水解，但糖苷键比磷酸糖苷键比磷酸酯键更易被酸水解酯键更易被酸水解。l嘌呤碱的糖苷键比嘧啶碱的糖苷键对酸更不稳定嘌呤碱的糖苷键比嘧

3、啶碱的糖苷键对酸更不稳定。对酸最不稳定的是嘌呤与脱氧核糖之间的糖苷键。lDNA在于37对水透析即可完全除去嘌呤碱。在于100加热1h，也可完全除去嘌呤碱。l水解嘧啶碱需要较高的温度水解嘧啶碱需要较高的温度。用甲酸（98-100）密封加热至1752h，无论RNA还是DNA都可以完全水解，产生嘌呤和嘧啶碱，缺点是尿嘧啶的回收率较低。改用三氟乙酸在155加热60min（水解DNA）或80min（水解RNA），嘧啶碱的回收率显著提高。1 1酸水解酸水解lRNARNA的磷酸酯键易被碱水解，产生核苷酸的磷酸酯键易被碱水解，产生核苷酸；用于水解RNA的碱有NaOH和KOH，以KON较好，碱浓度一般为，在室温

4、至37下水解1824h即可水解完全。lDNADNA的磷酸酯键则不易被碱水解。的磷酸酯键则不易被碱水解。DNADNA一般对碱一般对碱稳定稳定，在1mol/LNaOH中加热至1004h，可以得到小分子的寡聚脱氧核苷酸。2 2碱水解碱水解总结酸或碱的水解总结酸或碱的水解l核酸分子中的核酸分子中的磷酸二酯键磷酸二酯键可在酸或碱性条件下可在酸或碱性条件下水解切断。水解切断。lDNADNA和和RNARNA对对酸或碱的耐受程度有很大差别酸或碱的耐受程度有很大差别。l例如，在例如，在0.1 mol/L NaOH0.1 mol/L NaOH溶液中，溶液中，RNARNA几乎可几乎可以完全水解，生成以完全水解，生成

5、2-2-或或3-3-磷酸核苷；磷酸核苷；DNADNA在同样条件下则不受影响。在同样条件下则不受影响。这种水解性能上的这种水解性能上的差别？差别？与与RNARNA核糖基上核糖基上2-OH2-OH的邻基参与作用的邻基参与作用有很大的关系。在有很大的关系。在RNARNA水解时，水解时，2-OH2-OH首先进首先进攻磷酸基，在断开磷酯键的同时形成环状磷酸攻磷酸基，在断开磷酯键的同时形成环状磷酸二酯，再在碱的作用形成水解产物。二酯，再在碱的作用形成水解产物。l 水解核酸的酶类很多。l非特异性水解磷酸二酯键的酶称为磷酸二酯酶，如蛇毒磷酸二酯酶和牛脾磷酸二酯酶。l专一水解核酸的磷酸二酯酶称为核酸酶。3.3.

6、酶水解酶水解l按底物专一性分类按底物专一性分类 两类：以DNA为底物的DNADNA水解酶水解酶（DNases）和以RNA为底物的RNARNA水解酶水解酶（RNases）。l根据作用方式分根据作用方式分 两类：核酸外切酶和核酸内切酶核酸外切酶和核酸内切酶。作用位点在多核苷酸链内部的为核酸内切酶。从多核苷酸链的末端开始，逐个的将核苷酸切下，从而使核酸进行降解的酶称为外切酶。l按磷酸二酯键断裂的方式分按磷酸二酯键断裂的方式分 两类：一种是在3-OH 与磷酸基之间断裂，其产物是5-核苷酸或寡聚核苷酸。另一种是在5-OH与磷酸基之间断裂，其产物是3-核苷酸或寡聚核苷酸。l其它分类标准还有其它分类标准还有

7、 对底物二级结构的专一性，作用于双链核酸的叫双链酶，作用于单链的叫单链酶。核酸外切酶作用的方向性，35或53。对磷酸二酯键两侧的碱基有无选择性等。（1 1）核酸酶的分类）核酸酶的分类l牛胰核糖核酸酶（牛胰核糖核酸酶（RNaseIRNaseI）只作用于只作用于RNARNA，不作用于，不作用于DNADNA。且具有极高专一性的酶，其作用位点是嘧啶核苷嘧啶核苷-3-3-磷酸与其他核苷磷酸与其他核苷酸之间的键（酸之间的键（5 5-磷酸酯键）。磷酸酯键）。产生3-嘧啶核苷酸或以3-嘧啶核苷酸结尾的寡核苷酸。(P503)l核糖核酸酶核糖核酸酶T1T1 具有比RnaseI更高的专一性。他作用的位点是3-鸟苷酸

8、与其相邻核苷酸的5-OH之间的连键。产生3-鸟苷酸或以3-鸟苷酸结尾的寡核苷酸。l核糖核酸酶核糖核酸酶T2T2 主要作用点为Ap残基，可以将tRNA完全降解成3-腺苷酸结尾的寡核苷酸。（2 2）核糖核酸酶类（）核糖核酸酶类（RNaseRNase）l牛胰脱氧核糖核酸酶（牛胰脱氧核糖核酸酶（DNase IDNase I）切断双链DNA或单链DNA成为以5-磷酸为末端的寡核苷酸，平均长度为4核苷酸。l牛脾脱氧核糖核酸酶（牛脾脱氧核糖核酸酶（Dnase IIDnase II）降解DNA成为3-磷酸为末端的寡核苷酸，平均长度为6核苷酸。l链球菌脱氧核糖核酸酶链球菌脱氧核糖核酸酶 核酸内切酶，作用于DNA

9、，产物为5-磷酸为末端长度不同的碎片。l限制性内切酶限制性内切酶 在细菌中发现，主要降解外源DNA。具有严格的碱基序列专一性。它能专一识别并切割DNA上特定碱基序列，产物仍为双链DNA片段。限制内切酶的识别和切割位点通常是4-6bp组成的回文结构。切开后的产物具有粘性末端。限制性内切酶在基因工程中得到广泛应用。l（4 4）N-N-糖苷酶糖苷酶水解糖苷键。（3 3）脱氧核糖核酸酶（）脱氧核糖核酸酶（DNaseDNase）l注：注：生物体内存在多种核酸水解酶。这些酶可生物体内存在多种核酸水解酶。这些酶可以催化水解多聚核苷酸链中的磷酸二酯键。以催化水解多聚核苷酸链中的磷酸二酯键。l以以DNADNA为

10、底物的为底物的DNADNA水解酶水解酶（DNasesDNases）和以）和以RNARNA为为底物的底物的RNARNA水解酶水解酶（RNasesRNases）。）。l根据作用方式又分作两类：核酸外切酶和核酸根据作用方式又分作两类：核酸外切酶和核酸内切酶。内切酶。l核酸外切酶的作用方式是从多聚核苷酸链的一核酸外切酶的作用方式是从多聚核苷酸链的一端（端（3-3-端或端或5-5-端）开始，逐个水解切除核端）开始，逐个水解切除核苷酸；核酸内切酶的作用方式刚好和外切酶相苷酸；核酸内切酶的作用方式刚好和外切酶相反，它从多聚核苷酸链中间开始，在某个位点反，它从多聚核苷酸链中间开始，在某个位点切断磷酸二酯键。切

11、断磷酸二酯键。l在在分分子子生生物物学学研研究究中中最最有有应应用用价价值值的的是是限限制制性性核核酸酸内内切切酶酶。这这种种酶酶可可以以特特异异性性的的水水解解核核酸酸中中某些特定碱基顺序部位。某些特定碱基顺序部位。l核酸的两性性质及等电点核酸的两性性质及等电点l与蛋白质相似，核酸分子中既含有酸性基团（磷酸基）也含有碱性基团（氨基），因而核酸也具有两性性质。l由于核酸分子中的磷酸是一个中等强度的酸，而碱性（氨基）是一个弱碱，所以核酸的等电点比较低。如DNA的等电点为4；lRNA的等电点为2。RNA的等电点比DNA低的原因，是RNA分子中核糖基2-OH通过氢键促进了磷酸基上质子的解离。DNA没

12、有这种作用。三、核酸的酸碱性质三、核酸的酸碱性质(P504,(P504,了解了解)目目 录录碱基的碱性碱基的碱性 l嘌呤碱基和嘧啶碱基都具有弱碱性。嘌呤碱基和嘧啶碱基都具有弱碱性。l环内氨基的环内氨基的p pK Ka a值约为。值约为。l碱基环外的氨基（存在于碱基环外的氨基（存在于A A、G G和和C C）的碱性很）的碱性很弱，在生理弱，在生理pHpH条件下不能被质子化。这种情况条件下不能被质子化。这种情况与苯胺分子中的氨基相似。与苯胺分子中的氨基相似。l因此嘌呤和嘧啶碱基的碱性主要是环内氨基的因此嘌呤和嘧啶碱基的碱性主要是环内氨基的贡献。贡献。四四.核酸的紫外吸收核酸的紫外吸收(P507(P

13、507，了解，了解)l在核酸分子中，由于嘌呤碱在核酸分子中，由于嘌呤碱和嘧啶碱具有和嘧啶碱具有共轭双键共轭双键体系，体系，使使DNADNA和和RNARNA在在240240290nm290nm处处有强烈紫外吸收，有强烈紫外吸收，最大吸收最大吸收峰峰在在260nm260nm左右，可以作为左右，可以作为核酸及其组份定性和定量测核酸及其组份定性和定量测定的依据。定的依据。l以以A A260260/A/A280280进行定性、定量进行定性、定量lDNADNA和和RNARNA溶液中加入溴化乙溶液中加入溴化乙锭（锭（EBEB），在紫外下发出荧），在紫外下发出荧光光1.1.用用A260/A280A260/A2

14、80判判断核酸样品的纯度：断核酸样品的纯度：由于核酸的紫外吸收最大吸收值在260nm处。蛋白质最大吸收值在280nm处。利用这一特性，可以鉴别核酸样品中的蛋白质杂质，还可以对核酸进行定量测定。用ODOD260260/OD/OD280280比值来判断样品纯度。一般纯DNA比值，纯RNA比值应达到，若含杂蛋白及苯酚，比值会明显下降。2.2.对于纯的对于纯的DNADNA或或RNARNA样品，可用该法作定量测定样品，可用该法作定量测定 50g/ml双链DNA通常当相当于：40g/ml单链DNA（或RNA）20g/ml寡核苷酸优点：快速、准确、所需样品量少ODOD260260的应用的应用目目 录录五核酸

15、的变性、复性与杂交五核酸的变性、复性与杂交l问：核酸变性与核酸降解的区别？问：核酸变性与核酸降解的区别？l核酸的变性只涉及双螺旋区的氢键断裂，并不涉及磷酸二酯键的断裂，所以它的一级结构(碱基顺序)保持不变。l问：核酸变性后物化性质也会发生问：核酸变性后物化性质也会发生哪些变化呢？哪些变化呢？l答案：粘度下降；紫外吸收值A急剧增加；浮力密度升高；酸碱滴定曲线改变；生物活性丧失等。(1)(1)核酸的变性核酸的变性(P508,(P508,掌握掌握)1.1.定义：定义：指高温、酸碱以及某些变性剂能破坏核酸中指高温、酸碱以及某些变性剂能破坏核酸中的氢键，使有规律的双螺旋型结构变成单链的、无规的氢键，使有

16、规律的双螺旋型结构变成单链的、无规律的律的“线团线团”，这种作用就称为，这种作用就称为核酸的变性核酸的变性。DNADNA变性的本质是双链间氢键的断裂变性的本质是双链间氢键的断裂l2.2.引起核酸变性的因素：引起核酸变性的因素：l 很多很多l由温度升高引起的变性称为由温度升高引起的变性称为热变性热变性；l由酸碱度改变引起的变性称由酸碱度改变引起的变性称酸碱变性酸碱变性；l变性试剂如尿素、甲醛、胍类、酰胺以变性试剂如尿素、甲醛、胍类、酰胺以及某些有机溶剂如乙醇、丙酮等均可引及某些有机溶剂如乙醇、丙酮等均可引起核酸的变性。起核酸的变性。DNADNA的熔点的熔点l其中其中DNADNA的热变性一般在较窄

17、的温度范围的热变性一般在较窄的温度范围内发生，很像固体结晶物质在其熔点突内发生，很像固体结晶物质在其熔点突然熔化的情况。因此通常把加热变性使然熔化的情况。因此通常把加热变性使DNADNA双螺旋结构失去一半时的温度称为双螺旋结构失去一半时的温度称为熔熔点或溶解温度点或溶解温度，用，用T Tm m表示。表示。l一般一般DNADNA的的T Tm m值在值在82-9582-95 C C之间。之间。DNA变性是个突变过程，类似结晶的熔解。的温度称熔解温度熔解温度。通常将紫外吸收的增加量达到最大增量一半（即加热变性使DNA双螺旋结构失去一半）时的温度称为该DNA的熔点或熔解熔解温度温度(melting t

18、emperature,Tm)。TmTm热变性热变性解解链链曲曲线线：如如果果在在连连续续加加热热DNADNA的的过过程程中中以以温温度度对对A260A260（absorbanceabsorbance，A A，A260A260代代表表溶溶液液在在260nm260nm处处的的吸吸光光率率）值值作作图图，所所得得的的曲曲线线称称为为解解链曲线链曲线。目目 录录目目 录录 Tm：变变性性是是在在一一个个相相当当窄窄的的温温度度范范围围内内完完成成，在在这这一一范范围围内内，紫紫外外光光吸吸收收值值达达到到最最大大值值的的50%时时的的温温度度称称为为DNA的的解解链链温温度度，又又称称融融解解温温度度

19、(melting temperature,Tm)。其其大大小小与与G+C含量成正比。含量成正比。目目 录录lDNADNA的均一性的均一性 均一性越高，DNA的解链温度越窄。均质DNA熔解过程发生在一个较小的温度范围内；异质DNA的熔解过程发生在一个较宽的温度范围内。Tm值可作为衡量DNA样品均一性的标准。lG-CG-C的相对的相对含量含量 越多，Tm值越高。G和C的含量高，Tm值高。因而测定Tm值，可反映DNA分子中G,C含量，可通过经验公式推算Tm值或G-C含量：（G+C)%=（）2.44 问：问：DNADNA的的TmTm值与哪些因素有关呢？值与哪些因素有关呢？目目 录录l介质中的离子强度介

20、质中的离子强度 离子强度较低，DNA溶解温度较低，且溶解温度范围较宽。离子强度较高，DNA溶解温度较高，且溶解温度范围较窄。故DNA不应保存在极烯的溶液中。lpH值的影响值的影响 高pH下碱基广泛去质子而丧失形成氢键的能力。l 变性剂的影响变性剂的影响 如甲酰胺、尿素、甲醛等破坏氢键，妨碍碱基堆积，使Tm下降。l由于由于RNARNA本身只有局部的双螺旋区，所以变性本身只有局部的双螺旋区，所以变性行为所引起的性质变化没有行为所引起的性质变化没有DNADNA那样明显。那样明显。l具体：变性曲线不那么陡，具体：变性曲线不那么陡，TmTm值也较低。值也较低。l利用紫外吸收的变化，可以检测核酸变性的情利

21、用紫外吸收的变化，可以检测核酸变性的情况。况。l例如，天然状态的例如，天然状态的DNADNA在完全变性后，紫外吸在完全变性后，紫外吸收收(260 nm)(260 nm)值增加值增加252540%.40%.l而而RNARNA变性后，约增加变性后，约增加1.1%1.1%。这种现象称为增。这种现象称为增色效应色效应.的变性的变性l变性后的核酸在260nm处的紫外吸收明显升高，称增色效应。核酸复性后，光吸收值又回复到原有水平（减色效应）。l这是检测核酸变性的一个最简便的方法。l思考：增色效应的原因？l当核苷酸摩尔数相同时，A260值大小如下关系：单核苷酸单链DNA双链DNA4.4.增色效应的原因增色效

22、应的原因(P508)(P508)DNADNA复性的定义复性的定义 在适当条件下，变性在适当条件下，变性DNADNA的两条互补链可恢复天的两条互补链可恢复天然的双螺旋构象，这一现象称为然的双螺旋构象，这一现象称为复性复性。减色效应：减色效应：DNADNA复性时，其溶液复性时，其溶液ODOD260260降低。降低。热变性的热变性的DNADNA经缓慢冷却后即可复性，这一过经缓慢冷却后即可复性，这一过程称为程称为退火退火(annealing)(annealing)。退火温度。退火温度TmTm2525目目 录录(2)(2)核酸的复性核酸的复性(P508,(P508,掌握掌握)lDNADNA复性的程度、速

23、率与复性过程的条件有复性的程度、速率与复性过程的条件有关。关。l将热变性的将热变性的DNADNA骤然冷却至低温时，骤然冷却至低温时，DNADNA不不可能复性。但是将变性的可能复性。但是将变性的DNADNA缓慢冷却时，缓慢冷却时，可以复性。可以复性。l复性影响因素：分子量越大复性越难。浓复性影响因素：分子量越大复性越难。浓度越大，复性越容易。此外，度越大，复性越容易。此外，DNADNA的复性也的复性也与它本身的组成和结构有关。与它本身的组成和结构有关。影响复性速度的因素：l（1）溶液温度的高低 （Tm 25）l（2）单链片段的大小l（3）单链片段浓度l（4）片段内重复序列的多少l（5）溶液离子强

24、度的大小l附：DNA的复性一般只适用于均一的病毒和细菌的DNA，至于哺乳动物细胞中的非均一DNA，很难恢复到原来的结构状态。这是因为各片断之间只要有一定数量的碱基彼此互补，就可以重新组合成双螺旋结构，碱基不互补的区域则形成突环。l复性速度的因素影响：顺序简单的DNA分子比复杂的分子复性要快；DNA浓度越高，越易复性；此外，DNA片断大小、溶液的离子强度等对复性速度都有影响。l复性后DNA的表现：物理化学性质能得到恢复，如紫外光吸收值下降，粘度增高，比旋增加，生物活性也得到部分恢复。DNADNA复性复性A.A.概概念念:在在DNADNA变变性性后后的的复复性性过过程程中中，如如果果将将不不同同种

25、种类类的的DNADNA单单链链分分子子或或RNARNA分分子子放放在在同同一一溶溶液液中中，只只要要两两种种单单链链分分子子之之间间存存在在着着一一定定程程度度的的碱碱基基配配对对关关系系，在在适适宜宜的的条条件件（温温度度及及离离子子强强度度）下，就可以在不同的分子间形成下，就可以在不同的分子间形成杂化双链杂化双链(heteroduplex)(heteroduplex)这这种种杂杂化化双双链链可可以以在在不不同同的的DNADNA与与DNADNA之之间间形形成成，也也可可以以在在DNADNA和和RNARNA分子间或分子间或RNARNA与与RNARNA分子间形成。这种现象称为分子间形成。这种现象

26、称为核酸分子杂交核酸分子杂交1.1.核酸分子杂交的概念和原理核酸分子杂交的概念和原理(了解了解)(3)(3)核酸的分子杂交核酸的分子杂交(hybridization)简单来说：简单来说：在退火条件下，不同来源的在退火条件下，不同来源的DNADNA互补区形成氢键，互补区形成氢键，或或DNADNA单链和单链和RNARNA链的互补区形成链的互补区形成DNA-RNADNA-RNA杂合双链的过程。杂合双链的过程。可形成可形成DNADNADNADNA双链分子；双链分子；DNADNARNARNA双链分子；双链分子；RNARNARNARNA双链分子。双链分子。lB.B.原理原理:是只要两种单链分子之间存在着是

27、只要两种单链分子之间存在着一定程度的同源性，在适宜的条件（温一定程度的同源性，在适宜的条件（温度及离子强度）下，就可以按照碱基互度及离子强度）下，就可以按照碱基互补配对原则，在不同的分子间退火形成补配对原则，在不同的分子间退火形成杂化双链。杂化双链。DNA-DNA杂交双链分子杂交双链分子变性变性 复性复性 不同来源的不同来源的DNA分子分子目目 录录核核酸酸的的杂杂交交 探针：如果杂交的一条链是人工特定（已知核苷酸顺序）的DNA或RNA的序列，并经放射性同位素或其它方法标记，称为探针（probe)。探针：用放射性同位素标记的DNA或RNA片段。利用杂交方法，使“探针”与特定未知的序列发生“退火

28、”形成杂合体，即可达到寻找和鉴定特定序列的目的。用“探针”来寻找某些DNA或RNA片断，已成为目前基因克隆、鉴定分析中十分重要的手段。核酸的杂交在分子生物学和遗传学的研究中具有重要意义。目目 录录l杂交可以在液相或固相上进行。l固相杂交lSouthern Southern 杂交（杂交（Southern boltingSouthern bolting）lNorthern Northern 杂交（杂交（Northern boltingNorthern bolting）lWestern Western 杂交杂交 （Western boltingWestern bolting）原位杂交技术原位杂交技术：直接用探针与菌落或组织细胞中的核酸杂交，未改变核酸所在的位置。Southern印迹法印迹法：将电泳分离后的DNA片段从凝胶转移到硝酸纤维素膜上，再进行杂交。Northern印迹法印迹法：将电泳分离后的RNA（变性后）吸印到纤维素膜上再进行分子杂交。核酸分子杂交的应用核酸分子杂交的应用研究研究DNA分子中某一种基因的位置分子中某一种基因的位置定两种核酸分子间的序列相似性定两种核酸分子间的序列相似性检测某些专一序列在待检样品中存在与否检测某些专一序列在待检样品中存在与否是基因芯片技术的基础是基因芯片技术的基础 目目 录录B40KDa PoPRMT1Actin