《植物细胞融合实验》PPT课件.ppt

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1、第六章第六章 植物细胞融合（实验）植物细胞融合（实验）一、细胞融合的目的和意义一、细胞融合的目的和意义 细胞融合能实现远缘杂交。其意义在细胞融合能实现远缘杂交。其意义在于打破了仅仅依赖有性杂交重组基因创造于打破了仅仅依赖有性杂交重组基因创造新种的界限，有可能形成有性杂交方法无新种的界限，有可能形成有性杂交方法无法获得的新型杂种植物，广泛组合各种基法获得的新型杂种植物，广泛组合各种基因型，扩大了遗传物质的重组范围。因型，扩大了遗传物质的重组范围。二、细胞融合二、细胞融合（cell fusion)cell fusion)概念概念 在外力（诱导剂或促融合剂）作用下，两个或两在外力（诱导剂或促融合剂）

2、作用下，两个或两个以上的异源细胞或原生质体相互接触，从而发生个以上的异源细胞或原生质体相互接触，从而发生膜融合、胞质融合和核融合并形成杂种细胞的现象。膜融合、胞质融合和核融合并形成杂种细胞的现象。通过细胞培养技术，这个细胞有可能发育成完整的生物个体，这个杂种后代有可能兼有两个上代的一些优良性状。细胞在融合过程中发生的主要变化：细胞在融合过程中发生的主要变化：呈致密状态的体细胞在促融合剂的作用呈致密状态的体细胞在促融合剂的作用下，细胞膜的性质发生变化。下，细胞膜的性质发生变化。首先出现首先出现细胞凝集现象；然后部分凝集细胞之间的细胞凝集现象；然后部分凝集细胞之间的膜发生粘连；继而融合形成多核细胞

3、；在膜发生粘连；继而融合形成多核细胞；在培养过程中多核细胞又进行核的融合而成培养过程中多核细胞又进行核的融合而成为单核的杂种细胞，而那些不能形成单核为单核的杂种细胞，而那些不能形成单核的融合细胞在培养过程中逐渐死亡。的融合细胞在培养过程中逐渐死亡。三、细胞融合技术原理和方法三、细胞融合技术原理和方法 由于体外培养的细胞很少会发生自发由于体外培养的细胞很少会发生自发融合（融合频率大约在融合（融合频率大约在10-410-6之间），之间），因此要采用生物、化学或物理的方法人为因此要采用生物、化学或物理的方法人为地促使细胞融合。地促使细胞融合。促细胞融合的方法有：促细胞融合的方法有：（一）病毒促进细胞

4、融合（一）病毒促进细胞融合 其中仙台病毒（其中仙台病毒（HVJ）是最早用于动物细胞融）是最早用于动物细胞融合的融合剂。合的融合剂。（二）化学融合剂促进细胞融合（二）化学融合剂促进细胞融合 主要包括盐类融合剂、聚乙二醇（主要包括盐类融合剂、聚乙二醇（PEG）、）、二甲亚砜（二甲亚砜（DMSO）、甘油）、甘油-醋酸酯、油酸盐、脂醋酸酯、油酸盐、脂质、质、Ca2+配合物等。配合物等。（三）电处理融合法（三）电处理融合法聚乙二醇聚乙二醇（polyethylene glycol,PEG)polyethylene glycol,PEG)融合融合 在众多的化学试剂中，在众多的化学试剂中，PEG应用最为应用最

5、为广泛，因广泛，因PEG液比病毒更易制备和控制、液比病毒更易制备和控制、活性稳定、使用方便、而且促进细胞融合活性稳定、使用方便、而且促进细胞融合的能力更强。的能力更强。PEG是一种多聚化合物。是一种多聚化合物。PEG诱导原生质体融合的机理：诱导原生质体融合的机理：带有大量负电荷的带有大量负电荷的PEG与水之间的氢与水之间的氢键结合，使溶液中自由水消失，由于高度键结合，使溶液中自由水消失，由于高度脱水引起原生质体凝集，形成大小程度不脱水引起原生质体凝集，形成大小程度不同的凝集物。原生质体发生皱缩并大大扭同的凝集物。原生质体发生皱缩并大大扭曲变形，邻近原生质体之间紧密接触。曲变形，邻近原生质体之间

6、紧密接触。在原生质体细胞膜与膜紧密接触的部在原生质体细胞膜与膜紧密接触的部位，膜内蛋白质颗粒易位并凝聚。接着可位，膜内蛋白质颗粒易位并凝聚。接着可能是相邻的剥去蛋白质的细胞膜间的类脂能是相邻的剥去蛋白质的细胞膜间的类脂质与类脂质反应。继之，类脂质分子的扰质与类脂质反应。继之，类脂质分子的扰动和重排导致接触的细胞膜局部发生融合，动和重排导致接触的细胞膜局部发生融合，形成很小的细胞质桥，之后它逐渐扩大，形成很小的细胞质桥，之后它逐渐扩大，两个原生质体最终融合。两个原生质体最终融合。使用化学促融剂时，使用化学促融剂时，Ca2+是必需的。是必需的。关于关于Ca2+的作用机理，有的认为是的作用机理，有的

7、认为是Ca2+和和PO43-形成不溶于水的配合物，成为细胞间形成不溶于水的配合物，成为细胞间的钙桥，由此引起融合。也有解释为的钙桥，由此引起融合。也有解释为Ca2+结合到带负电磷脂的电离基上，使磷脂分结合到带负电磷脂的电离基上，使磷脂分子在膜上相互分离，由此引起融合。子在膜上相互分离，由此引起融合。电融合电融合（electrofusion technique)electrofusion technique)法法：电处理融合法是电处理融合法是20世纪世纪80年代发展起年代发展起来的细胞融合技术，使融合率大为提高。来的细胞融合技术，使融合率大为提高。Electroporator 2510 from

8、 BrinkmannModel ECM830 from BTX电融合过程的分子机制：电融合过程的分子机制：是以电降解及双向电泳的联合作用为是以电降解及双向电泳的联合作用为基础。通过电泳，两细胞膜紧密接触，且基础。通过电泳，两细胞膜紧密接触，且膜表面的蛋白质分子分离，产生了无蛋白膜表面的蛋白质分子分离，产生了无蛋白的类脂区。的类脂区。电脉冲作用时引起膜结构局部扰乱，电脉冲作用时引起膜结构局部扰乱，出现小孔洞。而相对的脂双层间分子在范出现小孔洞。而相对的脂双层间分子在范德华力作用下，形成脂分子桥。由于连接德华力作用下，形成脂分子桥。由于连接处的细胞膜表面曲率大，处于高张力状态，处的细胞膜表面曲率大

9、，处于高张力状态，在热力学上是不稳定的，所以最终导致两在热力学上是不稳定的，所以最终导致两细胞逐渐融合成一个圆形的大球状细胞。细胞逐渐融合成一个圆形的大球状细胞。A Alignment:Cells are brought into close contact by means of dielectrophoresis.B Fusion pulse:A squarewave pulse of a mere 15 microseconds is applied in order to permeate the membrane.The membranes then fuse.C Heterokar

10、yon phase:The cell membranes are fused completely and the cytoplasm has mixed together.Only the nuclei remain separate.D Entire fusion product:The nuclei are now fused as well.As a rule,the number of chromosomes is reduced.Fusion phases of oat protoplasts(Avena sativa)实际操作：实际操作：先把待融合的细胞或原生质体混合，取先把待融

11、合的细胞或原生质体混合，取样置于样置于100V/cm的高频交流电场中，在非的高频交流电场中，在非均匀交流电场中形成项链状排列；均匀交流电场中形成项链状排列；完整烟草原生质体完整烟草原生质体完整烟草原生质体完整烟草原生质体（4040）原生质体成串原生质体成串原生质体成串原生质体成串（4040）再用再用15V/cm直流电脉冲直流电脉冲/微秒冲击细微秒冲击细胞或原生质体的粘接点，细胞膜降解造成胞或原生质体的粘接点，细胞膜降解造成若干微孔，于是在膜之间形成通道，使细若干微孔，于是在膜之间形成通道，使细胞质得以交换；最后导致新的球状细胞的胞质得以交换；最后导致新的球状细胞的形成。形成。电融合法优点电融合

12、法优点（与（与（与（与PEGPEG法比较）法比较）法比较）法比较）：1、融合率高；、融合率高；2、重复性强；、重复性强；3、诱导仅发生在质膜接触部位，对细胞、诱导仅发生在质膜接触部位，对细胞 或原生质或原生质体伤害小；体伤害小；4、融合是在同步状态下进行，活细胞数目多；、融合是在同步状态下进行，活细胞数目多；5、装置精巧，方法简单，可在显微镜下观察或录、装置精巧，方法简单，可在显微镜下观察或录像融合过程；像融合过程；6、免去、免去PEG诱导后的洗涤过程，诱导过程可控制诱导后的洗涤过程，诱导过程可控制性强。性强。Electrofusion四、实验材料、试剂和仪器四、实验材料、试剂和仪器1.材料材

13、料 无菌烟草叶片、洋葱根尖无菌烟草叶片、洋葱根尖2.试剂试剂1）酶混合液）酶混合液 配制分两部进行：配制分两部进行：（1）将）将CaCl2.2H2O 7 mmol/L NaH2PO4.2H2O 0.7mmol/L MES 3 mmol/L 甘露醇甘露醇 0.5 mmol/L 用重蒸馏水溶解，调，定容为酶储备用重蒸馏水溶解，调，定容为酶储备液，灭菌备用。液，灭菌备用。（2）使用时再加入：）使用时再加入：纤维素酶纤维素酶 R-10 0.8%果胶酶果胶酶 R-10 1%因酶制剂经过高压灭菌处理后会失活，因酶制剂经过高压灭菌处理后会失活，故先将酶储液灭菌，待用时再将酶制剂按故先将酶储液灭菌，待用时再将

14、酶制剂按比例加入到第一步已灭菌的酶液内。比例加入到第一步已灭菌的酶液内。2）配制）配制CaCl2.2H2O 0.16mol/L （pH5.8-6.2 用于悬浮原生质体）用于悬浮原生质体）3)PEG液：液：30%（w/v)PEG(MW=6000)CaCl2.2H2O 0.01mol/L kH2PO4 0.00074mol/L 山梨醇山梨醇 0.1 mol/L 调调pH 5.8-6.2 ；用时现配！；用时现配！4）电融合液：）电融合液：甘露醇甘露醇 M CaCl2.2H23.仪器仪器 1）大型仪器：）大型仪器：高压灭菌锅，超净工作台，离心机，倒置显微高压灭菌锅，超净工作台，离心机，倒置显微镜，电融

15、合仪。镜，电融合仪。2）一般实验用品）一般实验用品 大小培养皿，小烧杯，小滴管，刻度离大小培养皿，小烧杯，小滴管，刻度离心管，小漏斗，不锈钢网心管，小漏斗，不锈钢网300目目五五.实验步骤实验步骤实验路线：实验路线：烟草叶肉及洋葱根尖烟草叶肉及洋葱根尖原生质体酶解分离原生质体酶解分离 提纯原生质体并调提纯原生质体并调整原生质体密度整原生质体密度a.调整融合仪参数，电击调整融合仪参数，电击使原生质体融合使原生质体融合法使原生质体融合法使原生质体融合倒置显微镜观察并照相倒置显微镜观察并照相实验步骤：实验步骤：1.取酶储液取酶储液10ml，分别加入纤维素酶和果胶酶，分别加入纤维素酶和果胶酶，制备酶液

16、。制备酶液。2.取材：烟草、洋葱根尖各取材：烟草、洋葱根尖各g 取洋葱根尖，并将其切成取洋葱根尖，并将其切成cm长短大小放入小平长短大小放入小平皿中；取烟草叶片将其剪成皿中；取烟草叶片将其剪成cm2 大小放入小平皿大小放入小平皿中。中。3.酶解：将酶液等量加入到存有实验材料的平皿酶解：将酶液等量加入到存有实验材料的平皿中，放入中，放入250c培养箱酶解。洋葱约培养箱酶解。洋葱约4h，烟草约，烟草约3h。4.观察酶解效果观察酶解效果5.原生质体的分离和纯化原生质体的分离和纯化 1）酶解后，用）酶解后，用300目铜网过滤酶液，去除未酶目铜网过滤酶液，去除未酶解的杂质，将滤液收集在解的杂质，将滤液收

17、集在10ml离心管中。离心管中。2）1000转转/分离心分离心3分钟，用吸管或移液枪弃上分钟，用吸管或移液枪弃上清（注意不要把收集的原生质体吸走）。清（注意不要把收集的原生质体吸走）。3）用）用CaCl2.2H2O（约（约1ml）悬浮下面的原生质）悬浮下面的原生质体（体（PEG法）；电融合法则用电融合液悬浮。法）；电融合法则用电融合液悬浮。4）显微镜观察提纯后的原生质体，若杂质较多）显微镜观察提纯后的原生质体，若杂质较多可重复可重复1）3）操作。）操作。纯化的原生质体图示纯化的原生质体图示完整洋葱原生质体（完整洋葱原生质体（40）完整烟草原生质体（完整烟草原生质体（40）6.原生质体的密度测定

18、原生质体的密度测定 用血细胞记数板记数。每一样品测定用血细胞记数板记数。每一样品测定3次，根次，根据测定结果，将悬浮原生质体密度调整至据测定结果，将悬浮原生质体密度调整至5*105个个/ml。7.原生质体的融合原生质体的融合（一）（一）PEG法法 1）配制）配制PEG液（液（5ml）30%（w/v)PEG(MW=6000)1.5 g CaCl2.2H2O 0.0074g kH2PO4 g 山梨醇山梨醇 g 调调6.2 2）将两种原生质体悬液等量混合）将两种原生质体悬液等量混合3）用刻度吸管将混合的原生质体悬液滴在直径）用刻度吸管将混合的原生质体悬液滴在直径为为60mm的平皿中，每皿的平皿中，每

19、皿78滴，每滴约滴，每滴约ml。然后静置然后静置10分钟，使原生质体贴在皿底上，分钟，使原生质体贴在皿底上，形成一薄层（应有形成一薄层（应有35个平皿的重复）。个平皿的重复）。4）用吸管将等量的）用吸管将等量的PEG溶液缓慢地加在原生质溶液缓慢地加在原生质体液滴上，再静置体液滴上，再静置1015分钟。此时可取一个分钟。此时可取一个平皿在倒置显微镜上观察原生质体间的粘连。平皿在倒置显微镜上观察原生质体间的粘连。PEG法原生质体的融合图示法原生质体的融合图示1 1、烟草叶肉和洋葱根尖细胞、烟草叶肉和洋葱根尖细胞原生质体融合（原生质体融合（40）2 2、烟草叶肉和洋葱根尖细、烟草叶肉和洋葱根尖细胞原

20、生质体的异源融合胞原生质体的异源融合（二）电融合法（二）电融合法 1）融合仪参数设置：融合仪参数设置：成串电流频率成串电流频率MHz,电压电压30V,成串时间成串时间1min,融合脉冲幅融合脉冲幅宽宽40S,融合电压融合电压150v,融合槽间距融合槽间距1mm 2）在融合小室中加入约）在融合小室中加入约100ul的原生质体悬浮液，将融的原生质体悬浮液，将融合小室接好电极后至于倒置显微镜下，静置约合小室接好电极后至于倒置显微镜下，静置约3min，使悬浮的原生质体沉降到平板底部，同时打开成串脉使悬浮的原生质体沉降到平板底部，同时打开成串脉冲输出开关及融合脉冲输出开关，使高压脉冲发生电冲输出开关及融

21、合脉冲输出开关，使高压脉冲发生电路与融合小室接通。然后轻触脉冲触发开关，施加路与融合小室接通。然后轻触脉冲触发开关，施加3次次融合脉冲，每次间隔融合脉冲，每次间隔1s。融合脉冲后成串脉冲再保持。融合脉冲后成串脉冲再保持1min。静置融合小室。静置融合小室2030min，在显微镜下观察融，在显微镜下观察融合过程。合过程。电融合法原生质体的融合结果电融合法原生质体的融合结果原生质体成串（原生质体成串（40）原生质体融合（图原生质体融合（图1）电融合法原生质体的融合结果电融合法原生质体的融合结果 原生质体融合（图原生质体融合（图2）原生质体融合（图原生质体融合（图3）Overall aims of

22、researchlTo“capture”disease resistance from wild potato specieslTo use segregating populations to identify plant disease resistance genes and transfer resistance into potato cultivarsSOMATIC HYBRIDIZATION IN SOLANUMSomatic hybridization using protoplast fusionlIsolate protoplasts(typically leaf meso

23、phyll)from two parental lineslFuse protoplasts either chemically(PEG)or using electrofusionlCell membranes fuse forming one cell containing 2 nucleilOn cell division nuclear material condenses together and hybrids cells are formed that contain DNA from both parental lines.Potato plants growing in a

24、test tubeFreshly isolated potato protoplastsTwo protoplasts ready to fuse together Fusion products begin to divide on nutrient mediumIf the conditions are right,small shoots emerge from the green calliPutative somatic hybrid plants A fertile somatic hybrid Phenotype of somatic hybrids clearly shows

25、characteristics of both parents S.brevidens somatic hybrid S.tuberosumPhenotype of intraspecific diploids of S.tuberosum Somatic hybrids have ALL of the chromosomes from each parent plant Verticillium wilt resistance test field at Hancock,Wisconsin Late blight resistance in backcross plant derived f

26、rom somatic hybrids between S.bulbocastanum and potatoLine J101K6-A22 at Hancock Expt.Station 植物体细胞杂交植物体细胞杂交用两个来自不同植物的体细胞融合成用两个来自不同植物的体细胞融合成一个杂种细胞，且把杂种细胞培育成新的一个杂种细胞，且把杂种细胞培育成新的植物体的方法。打破了不同种生物间的生植物体的方法。打破了不同种生物间的生殖隔离限制，大大扩展了可用于杂交的亲殖隔离限制，大大扩展了可用于杂交的亲本组合范围。本组合范围。(1)(1)(2)(3)(4)(5)植物体细胞杂交过程示意图植物体细胞杂交过程示意图Protoplast FusionHETEROKARYONLOSS OF ONE NUCLEUSNUCLEAR FUSIONCYTOPLASMIC HYBRIDS(CYBRIDS)SYNKARYON