《核医学分子核医学》PPT课件.ppt

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1、分子核医学分子核医学进展进展定义：分子生物学与实验核医学结合定义：分子生物学与实验核医学结合。内内涵涵：利利用用示示踪踪技技术术观观察察体体内内的的生生化化过过程程并并与与相相关关基基因因联联系系起起来来的的一一门门分分支支学学科科，分分子识别子识别是其重要理论基础。是其重要理论基础。研究领域：受体显像研究领域：受体显像基因显像基因显像重重组组单单抗抗片片段段、肽肽类类放放射射性性药药物物及微型抗体。及微型抗体。特点：特点：1）深深入入分分子子水水平平认认识识疾疾病病，通通过过细细胞胞信信息息传传导导、基基因因表表达达、生生化化代代谢谢等等多多个个方方面面，在在解解剖剖学学和和功功能能症症状状

2、出出现现之之前前发发现现病病变变信信息。息。2）通通过过特特定定示示踪踪剂剂，将将疾疾病病与与基基因因表表达达的的改变联系起来，提高疾病诊治的层次。改变联系起来，提高疾病诊治的层次。3）当代分子生物学研究成果是其理论源泉。）当代分子生物学研究成果是其理论源泉。4）分子识别是分子核医学的理论基石。）分子识别是分子核医学的理论基石。5）生化代谢的评价是其理论重要组成部分。）生化代谢的评价是其理论重要组成部分。二、当前的几个热门研究领域（六个领域）二、当前的几个热门研究领域（六个领域）1、受体显像：举例、受体显像：举例a、b、c2、受体介导的放射配体治疗、受体介导的放射配体治疗3、放免显像（、放免显

3、像（RII）4、放免治疗（、放免治疗（RIT）5、基因显像和基因放射治疗、基因显像和基因放射治疗原原理理：将将放放素素标标记记的的反反义义寡寡核核苷苷酸酸注注入入受受试试者者体体内内，由由于于体体内内癌癌基基因因等等有有过过度度表表达达，通通过过体体内内核核酸酸分分子子杂杂交交而而与与相相应应靶靶基基因因结结合合，以以定定位位、定定量量显显示示特特异异靶靶基基因因，从从而而进进行行基基因因诊诊断以及破坏相应致病基因而达到治疗的目的。断以及破坏相应致病基因而达到治疗的目的。反义寡核苷酸基因显像剂的特点：反义寡核苷酸基因显像剂的特点：1）分子量小）分子量小4）无免疫原性）无免疫原性2）穿透力强）穿

4、透力强5）与靶结合快）与靶结合快3）特异性高）特异性高6）靶）靶/非靶比值高非靶比值高反义寡核酸的基本要求：反义寡核酸的基本要求：P303基因显像必备条件：基因显像必备条件：1）胞浆中必须有足够的）胞浆中必须有足够的mRNA基因产物基因产物标记反义探针必须与靶细胞特异选择性结合并保持稳定。标记反义探针必须与靶细胞特异选择性结合并保持稳定。6、代谢显像：主要指、代谢显像：主要指PET显显像像原原理理：+衰衰变变的的放放素素与与体体内内靶靶物物质质作作用用而而损损失失能能量量被被吸吸收收、转转化化为为二二个个方方向向相相反反的的高高能能r光光子子。它它提提供供了了很很好好的的空空间间定定位位信信息

5、息，经经计计算算机机处处理理重重新新购购成成清清晰晰的的三三维维图像。图像。+核素特点：核素特点：1)大部分为人体基本元素，全部为人工生产大部分为人体基本元素，全部为人工生产2)湮灭辐射可获得三维图像湮灭辐射可获得三维图像3)T1/2短，一次可给较大剂量，图像清晰短，一次可给较大剂量，图像清晰4)重复给药，动态观察。重复给药，动态观察。5)临床应用举例：临床应用举例：6)18F-萄萄糖糖研研究究脑脑功功能能状状况况，老老年年痴痴呆呆时时摄摄取取18F-萄萄，测脑部放射性下降。，测脑部放射性下降。7)脑瘤区脑瘤区18F-萄萄。三、分子生物学中的示踪技术及应用三、分子生物学中的示踪技术及应用P27

6、1（一一）核核酸酸标标记记：标标记记上上放放射射性性核核素素的的又又叫叫探探针针，或叫基因探针。或叫基因探针。1、探针分类：基因组、探针分类：基因组DNA探针探针CDNA探针探针以以mRNA为模板为模板CRNA探针探针反向合成的反向合成的DNA片段片段人工合成寡核人工合成寡核探针的标记物分类探针的标记物分类放素：放素：32P33P35S3H14C125I等等非放：生物素、地高辛等。非放：生物素、地高辛等。两类探针的比较：两类探针的比较：放素探针放素探针非放探针非放探针灵敏度高、应用广灵敏度高、应用广对对人人体体有有害害、寿寿命命短短灵灵敏敏度度低低，对对核核酸酸分分子子有有修修饰饰作作用用，但

7、但无无放射危害，寿命长放射危害，寿命长六种常用的放素的性质、特点六种常用的放素的性质、特点P273表表1112、核酸探针的具体标记方法：、核酸探针的具体标记方法：体体内内标标记记：将将32P磷磷酸酸盐盐加加到到细细胞胞或或细细菌菌培培养养体系中，使体系中，使32P参入新合成的核酸分子上。参入新合成的核酸分子上。酶酶促促法法体体外外标标记记：很很常常用用，先先将将核核素素预预先先标标记记在在核核苷苷酸酸上上，然然后后利利用用多多种种核核酸酸聚聚合合酶酶将将核核苷苷酸酸参入到探针分子中或交换到探针分子中去。参入到探针分子中或交换到探针分子中去。常见的几种外标记方法：常见的几种外标记方法：1）DNA

8、缺缺口口平平移移法法：已已有有试试剂剂盒盒提提供供如如Amashema,promega,BR2等公司。等公司。2）随机引物法：也有试剂盒上市。）随机引物法：也有试剂盒上市。两种方法注意点：两种方法注意点：模板越小，产物的比活度越高；模板越小，产物的比活度越高；产物的长度与加入寡核苷酸引物的量成正比；产物的长度与加入寡核苷酸引物的量成正比；有有5种原因常引起标记碍障：种原因常引起标记碍障：a、DNA双链未充分变性；双链未充分变性；b、DNA纯度不佳；纯度不佳；c、Klenow酶效价不够；酶效价不够；d、DNA片段太少，片段太少，G50分离时丢失；分离时丢失；e、DNA用量过大或过少。用量过大或过

9、少。3）单单链链DNA探探针针标标记记：在在M13噬噬菌菌体体的的环环状状单单链上合成互补链上合成互补DNA链时参入放素。链时参入放素。4）CDNA探探针针标标记记：以以mRNA为为模模板板，在在引引物物和和四四种种脱脱氧氧核核糖糖核核苷苷三三磷磷酸酸（dNTP，其其中中一一种种为为标标记记物物）存存在在下下，经经酶酶促促聚聚合合反反应应合合成成互互补标记补标记CDNA。5）RNA探针标记：探针标记：P2756）DNA探针的探针的5端标记：端标记：P2757）DNA探针的探针的3端标记：端标记：P2768）PCR-DNA标标记记：PCR扩扩增增时时通通过过合合成成DNA将将32P-dNTP参入

10、到参入到DNA分子中达到标记作用。分子中达到标记作用。将将32PdNTP参参入入到到DNA分分子子中中达达到到标标记记作作用。用。3、核酸标记的检测、核酸标记的检测核核酸酸标标记记方方法法很很多多，虽虽已已大大部部分分商商品品化化和和标标准准化化，但但环环节节繁繁杂杂，试试剂剂质质量量及及操操作作等等影影响响因因素素多，标记完成后应定性、定量检测。多，标记完成后应定性、定量检测。参入核酸中的参入核酸中的cpm主要两个指标：参入比主要两个指标：参入比=-100%加入的标记品总加入的标记品总cpm比活性：指每微克核酸中的放射性计数比活性：指每微克核酸中的放射性计数cpm/gDNA(RNA)4、核酸

11、标记注意事项：、核酸标记注意事项：1）同位素的安全防护）同位素的安全防护2）核核酸酸原原料料一一般般用用50-150ng，越越少少，产产品品比比活活度越高。度越高。3）标记前体）标记前体32P-dNTP，用时须真空抽干，用时须真空抽干4）使使用用的的Ependoff管管和和吸吸头头需需先先硅硅化化、防防止止吸吸附。附。5）标记物应及时用，）标记物应及时用，-20可保存可保存13天天6）严格按厂家说明书操作，最好做预实验。）严格按厂家说明书操作，最好做预实验。7）个别标记方法标记前需做）个别标记方法标记前需做DNA变性处理。变性处理。（二）核酸分子杂交技术（二）核酸分子杂交技术定定义义：具具有有

12、一一定定同同源源性性的的核核酸酸单单链链在在一一定定条条件下按硷基互补原则形成异源双链的过程。件下按硷基互补原则形成异源双链的过程。杂杂交交步步骤骤：核核酸酸探探针针与与核核酸酸样样品品（处处理理好好的的）混合混合反应反应漂洗漂洗ARGor测量测量分析。分析。固相杂交：固相杂交：1）Southern印印迹迹杂杂交交：P277、查查DNA序序列列，分析基因结构、并进行定性、定量研究。分析基因结构、并进行定性、定量研究。步步骤骤：提提取取DNA酶酶解解DNA琼琼脂脂糖糖电电泳泳转移硝酸纤维膜上并固定转移硝酸纤维膜上并固定杂交杂交ARG2）Nothern印印迹迹杂杂交交法法：主主要要查查RNA序序列

13、列，步骤大致同上。步骤大致同上。3）斑斑点点杂杂交交：将将变变性性的的DNAorRN点点样样在在硝硝酸酸纤纤维膜上，然后杂交，维膜上，然后杂交，ARG。4）反反向向斑斑点点杂杂交交：将将多多种种未未标标记记的的已已知知序序列列寡寡核核苷苷酸酸探探针针点点样样于于纤纤维维膜膜，再再将将待待分分析析的的DNA用用放放素素标标记后与其杂交，记后与其杂交，ARG根据杂交点判断根据杂交点判断DNA序列。序列。P2785）菌菌落落、噬噬菌菌斑斑原原位位杂杂交交：将将微微生生物物点点于于纤纤维维素素膜膜或或贴贴印印方方式式转转移移微微生生物物，曝曝露露细细胞胞DNA，硷硷化化DNA变性，并固定，再进行斑点杂

14、交过程。变性，并固定，再进行斑点杂交过程。6）组组织织、细细胞胞原原位位杂杂交交：将将组组织织切切片片或或细细胞胞固固定定在玻片上，用已知的标记核酸探针进行杂交。在玻片上，用已知的标记核酸探针进行杂交。特点；不需以细胞中提取特点；不需以细胞中提取DNAorRNA，通过，通过ARG在显微镜下观察银颗粒，进行定位、定性研究，定位在显微镜下观察银颗粒，进行定位、定性研究，定位准。敏感性高，对含量极低的靶序列也可检测。准。敏感性高，对含量极低的靶序列也可检测。注：如原位杂交采用非放探针，可染色显微观察。液相杂交：将变性的单链核酸与探针在溶液中自由杂交，适当方法分离获得杂交分子、测放了解其特定序列的信息

15、。特点：1）受检的目标核酸与示踪的标记核酸均不在支持相上。2）主要用于基因筛选和将基因组中重复的序列与单一序列分离出来。（三）（三）DNA序列分析序列分析DNA序列分析的两个基本步骤序列分析的两个基本步骤DNA片段的制备的扩增片段的制备的扩增测定测定DNA序列序列PCR测测序序分分析析：利利用用一一对对高高特特异异性性引引物物，可可以以直直接接从从基基因因文文库库中中原原始始克克隆隆或或从从极极复复杂杂的的基基因因组组DNA中中，通通过过不不对对称称PCR反反应应制制备备特特定定基基因因片片段段为为测测序序模模板板（单单链链DNA），然然后后用用双双脱脱氧氧法法完完成序列分析。成序列分析。双双

16、脱脱氧氧法法 指指当当有有双双脱脱氧氧核核糖糖核核苷苷三三磷磷酸酸ddNTP参参入入时时，链链的的延延长长就就终终止止，可可以以得得到到一一系系列列长长度度不不同同的的核核酸酸片片段段，由由于于4种种原原料料dNTP中中有有一一种种是是标标记记的的，所所以以可可通通过过ARG，从从图图上上读读出出被被测测DNA的硷基排列序列。的硷基排列序列。常用方法：未端终止法常用方法：未端终止法化学法化学法P280（四）重组（四）重组DNA和基因工程和基因工程重重组组DNA基基因因克克隆隆（基基因因工工程程）：指指采采用用分分子子生生物物学学技技术术在在试试管管内内有有目目的的地地切切割割分分离离纯纯化化或

17、或人人工工合合成成的的DNA分分子子和和相相应应的的载载体体，并并将将其其拼拼接接成成重重组组DNA后后导导入入合合适适的的宿宿主主细细胞胞中中，使使之之大大量量扩增形成克隆，并表达基因产物。扩增形成克隆，并表达基因产物。基因工程的基本步骤：基因工程的基本步骤：P282了解了解与与核核医医学学相相关关技技术术基基因因诊诊断断：核核酸酸分分子子杂杂交交技技术术中中用用的的放放素素，主主要要包包括括遗遗传传性性疾疾病病、癌癌基基因因与抗癌基因的研究。与抗癌基因的研究。（五）聚合酶链反应（五）聚合酶链反应PCRP284了解了解（六）蛋白质合成中的核技术应用（六）蛋白质合成中的核技术应用P287了解了

18、解（七）半抗原标记及其应用：（七）半抗原标记及其应用：P215半抗原：定义不能诱导产抗体，但能反应半抗原：定义不能诱导产抗体，但能反应。应应用用原原理理：将将半半抗抗原原看看作作为为放放素素去去标标记记核核酸酸或或抗抗体体，激激素素等等分分子子（方方法法已已趋趋成成熟熟）。然然后后把把能能与与半半抗抗原原结结合合的的相相应应抗抗体体用用荧荧光光素素、酶酶或或胶胶体体金金标标记记上上，然然后后作作示示踪踪研研究究，通通过过测测荧荧光光素素或或显显色色反反应应进进行定位和定性研究。行定位和定性研究。举例：举例：（1）地高率半抗原标记：将地高率通过一）地高率半抗原标记：将地高率通过一个个“联结臂联结

19、臂”结在结在duTP上，再用随机引物法或上，再用随机引物法或其它酶反应方法将其它酶反应方法将DIGduTP掺入到核酸上，掺入到核酸上，反应完后用碱性磷酸酶标记的抗反应完后用碱性磷酸酶标记的抗DIG抗体去结合，抗体去结合，而该酶可显色反应。而该酶可显色反应。*）而胶体金即为氯化金分子呈胶体）而胶体金即为氯化金分子呈胶体态粉红色，具有高电子密度和能与大分子物质态粉红色，具有高电子密度和能与大分子物质结合的特征，可在电镜，光镜下进行定性，定结合的特征，可在电镜，光镜下进行定性，定位研究。位研究。2）二硝基苯或三硝基苯（）二硝基苯或三硝基苯（DNP或或TNP）半抗原标记：它可标蛋白、激素、抗体）半抗原

20、标记：它可标蛋白、激素、抗体等。示踪过程酶显色。等。示踪过程酶显色。（八）免疫（八）免疫PCR技术：技术：P216定义：定义：PCR+Ag-Ab结合反应的新技术。结合反应的新技术。原原理理：DNA作作为为标标记记物物（看看做做放放素素），最最后后可可用用PCR将将DNA扩扩增增，通通过过测测定定DNA的的量量进进行行定性研究的一种方法。定性研究的一种方法。基本反应：基本反应：1）将待测抗原固化试管底部）将待测抗原固化试管底部2）加入生物素标记的特异抗体）加入生物素标记的特异抗体Ab-b3）加入亲和素）加入亲和素A作为连接分子作为连接分子Ag+Ab-b+AAgAb-b-A4）每加入生物素标记的）每加入生物素标记的DNA-b得得Ag+Ab-b-A+DNA-bAgAb-b-A-b-DNA引物引物PCR扩增扩增染色染色记录记录PCR扩增的扩增的DNA量。量。特点（优点）：特点（优点）：1）特异性强（与）特异性强（与RIA相同）相同）2）灵敏度高（比酶标高）灵敏度高（比酶标高1000倍，也高于倍，也高于RIA）3）操作简单）操作简单缺点：缺点：1）假阳性高）假阳性高2）影响实验的因素多）影响实验的因素多3）未商品化。）未商品化。