实验二SDSPAGE凝胶电泳.ppt

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1、SDS-PAGE凝胶电泳凝胶电泳实实验验二二SDS-PAGE凝胶电泳凝胶电泳实验原理实验原理实验步骤实验步骤注意事项注意事项SDS-PAGE的优点的优点SDS-PAGE的缺点的缺点实验常见问题及处理实验常见问题及处理小技巧小技巧实验原理实验原理l源起源起l基本原理基本原理l分类分类l分离范围分离范围源起源起l1967年由Shapiro建立。l1969年由Weber和Osborn进一步完善。他们发现样品介质和丙烯酰胺凝胶中加入离子去污剂（SDS）以后,蛋白质亚基的电泳迁移率主要取决于亚基分子量的大小,电荷因素可以忽视.丙丙烯烯酰胺酰胺N,N-亚甲基双亚甲基双丙烯酰胺丙烯酰胺聚丙烯酰胺聚丙烯酰胺四

2、甲基乙二胺四甲基乙二胺(TEMED)过硫酸胺过硫酸胺(AP)激活作用激活作用激活作用激活作用共聚合共聚合基本原理之一基本原理之一l阴离子去污剂阴离子去污剂SDS破坏蛋白质分子之间破坏蛋白质分子之间及与其它物质分子之间的非共价键，使蛋白质及与其它物质分子之间的非共价键，使蛋白质变性而改变其原有的构象，并同蛋白质分子充变性而改变其原有的构象，并同蛋白质分子充分结合形成带负电荷的蛋白质分结合形成带负电荷的蛋白质-SDS复合物。复合物。l强还原剂巯基乙醇强还原剂巯基乙醇打开蛋白质分子内的打开蛋白质分子内的二硫键使这种结合更加充分。二硫键使这种结合更加充分。基本原理之二基本原理之二l结合了结合了SDS的

3、蛋白质在水溶液中的形状类似于长椭的蛋白质在水溶液中的形状类似于长椭圆棒，不同的蛋白质圆棒，不同的蛋白质-SDS复合物其椭圆棒的短轴复合物其椭圆棒的短轴长度恒定，而长轴的长度则与长度恒定，而长轴的长度则与蛋白质分子量蛋白质分子量的大的大小成正比。小成正比。l这样的蛋白质这样的蛋白质-SDS复合物在电场作用下，其迁移复合物在电场作用下，其迁移率便不再受蛋白质原有的净电荷及形状等因素的率便不再受蛋白质原有的净电荷及形状等因素的影响，而主要取决于其分子量大小这一因素。根影响，而主要取决于其分子量大小这一因素。根据这一特点，就可以将各蛋白组分按分子量大小据这一特点，就可以将各蛋白组分按分子量大小分开。分

4、开。分类分类 PAGE根据其有无浓缩效应根据其有无浓缩效应，分为连连续系统续系统和不连续系统不连续系统两大类.连续系统电泳体系中连续系统电泳体系中,缓冲液缓冲液pH值及凝值及凝胶浓度相同，带电颗粒在电场作用下，主要胶浓度相同，带电颗粒在电场作用下，主要靠电荷和分子筛效应靠电荷和分子筛效应。电泳槽电泳槽电泳槽电泳槽不连续系统不连续系统l不连续系统中由于缓冲液离子成分，不连续系统中由于缓冲液离子成分，pH，凝胶浓度及电位梯度的不连续性，带电颗凝胶浓度及电位梯度的不连续性，带电颗粒在电场中泳动不仅有粒在电场中泳动不仅有电荷效应，分子筛电荷效应，分子筛效应，还具有浓缩效应效应，还具有浓缩效应，因而其分

5、离条带，因而其分离条带清晰度及分辨率均较前者佳。清晰度及分辨率均较前者佳。浓缩胶浓缩胶l浓缩胶的作用是有堆积作用，凝胶浓度较小，浓缩胶的作用是有堆积作用，凝胶浓度较小，孔径较大，把较稀的样品加在浓缩胶上，经过孔径较大，把较稀的样品加在浓缩胶上，经过大孔径凝胶的迁移作用而被浓缩至一个狭窄的大孔径凝胶的迁移作用而被浓缩至一个狭窄的区带。区带。分离胶分离胶l孔径较小孔径较小,通过选择合适的凝胶浓度通过选择合适的凝胶浓度,可可以使样品很好的分离以使样品很好的分离.凝胶由两种不同的凝胶层组成。上层为浓缩胶，下层为分凝胶由两种不同的凝胶层组成。上层为浓缩胶，下层为分离胶。在上下电泳槽内充以离胶。在上下电泳

6、槽内充以Tris-甘氨酸缓冲液甘氨酸缓冲液(pH8.3)，这样便形成了凝胶孔径和缓冲液这样便形成了凝胶孔径和缓冲液pH值的不连续性。在浓值的不连续性。在浓缩胶中缩胶中HCl几乎全部解离为几乎全部解离为Cl-，但只有极少部分甘氨酸，但只有极少部分甘氨酸解离为解离为H2NCH2COO-。蛋白质的等电点一般在。蛋白质的等电点一般在pH5左右，左右，在此条件下其解离度在在此条件下其解离度在HCl和甘氨酸之间。当电泳系统通和甘氨酸之间。当电泳系统通电后，这电后，这3种离子同向阳极移动。其有效泳动率依次为种离子同向阳极移动。其有效泳动率依次为Cl-蛋白质蛋白质H2NCH2COO-，故，故C1-称为快离子，

7、而称为快离子，而H2NCH2COO-称为慢离子。称为慢离子。浓缩效应之一浓缩效应之一浓缩效应之二浓缩效应之二电泳开始后，快离子在前，在它后面形成离子浓度电泳开始后，快离子在前，在它后面形成离子浓度低的区域即低电导区。电导与电压梯度成反比，所低的区域即低电导区。电导与电压梯度成反比，所以低电导区有较高的电压梯度。这种高电压梯度使以低电导区有较高的电压梯度。这种高电压梯度使蛋白质和慢离子在快离子后面加速移动。在快离子蛋白质和慢离子在快离子后面加速移动。在快离子和慢离子之间形成一个稳定而不断向阳极移动的界和慢离子之间形成一个稳定而不断向阳极移动的界面。由于蛋白质的有效移动率恰好介于快慢离子之面。由于

8、蛋白质的有效移动率恰好介于快慢离子之间，因此蛋白质离子就集聚在快慢离子之间被浓缩间，因此蛋白质离子就集聚在快慢离子之间被浓缩成一条狭窄带。这种浓缩效应可使蛋白质浓缩数百成一条狭窄带。这种浓缩效应可使蛋白质浓缩数百倍。倍。样品进入分离胶后，慢离子甘氨酸全部解样品进入分离胶后，慢离子甘氨酸全部解离为负离子，泳动速率加快，很快超过蛋白质，离为负离子，泳动速率加快，很快超过蛋白质，高电压梯度随即消失。此时蛋白质在均一的外高电压梯度随即消失。此时蛋白质在均一的外加电场下泳动，但由于蛋白质分子所带的有效加电场下泳动，但由于蛋白质分子所带的有效电荷不同，使得各种蛋白质的泳动速率不同而电荷不同，使得各种蛋白质

9、的泳动速率不同而形成一条条区带。形成一条条区带。电荷效应之一电荷效应之一电荷效应之二电荷效应之二 与与SDS结合的蛋白质的构型也发生变化，在结合的蛋白质的构型也发生变化，在水溶液中水溶液中SDS-蛋白质复合物都具有相似的形状，蛋白质复合物都具有相似的形状，使得使得SDS-PAGE电泳的泳动率不再受蛋白质原有电泳的泳动率不再受蛋白质原有电荷与形状的影响。因此，各种电荷与形状的影响。因此，各种SDS-蛋白质复合蛋白质复合物在电泳中不同的泳动率只反映了蛋白质分子量物在电泳中不同的泳动率只反映了蛋白质分子量的不同。的不同。电荷效应之三电荷效应之三 在在SDS-PAGE电泳中，由于电泳中，由于SDS这种

10、阴离这种阴离子表面活性剂以一定比例和蛋白质结合成复合子表面活性剂以一定比例和蛋白质结合成复合物，使蛋白质分子带负电荷，这种负电荷远远物，使蛋白质分子带负电荷，这种负电荷远远超过了蛋白质分子原有的电荷差别，从而降低超过了蛋白质分子原有的电荷差别，从而降低或消除了蛋白质天然电荷的差别；此外，由多或消除了蛋白质天然电荷的差别；此外，由多亚基组成的蛋白质和亚基组成的蛋白质和SDS结合后都解离成亚单结合后都解离成亚单位，这是因为位，这是因为SDS破坏了蛋白质氢键、疏水键破坏了蛋白质氢键、疏水键等非共价键。等非共价键。lSDS聚聚丙丙烯烯酰酰胺胺凝凝胶胶的的有有效效分分离离范范围围取取决决于于用用于于灌灌

11、胶胶的的聚聚丙丙烯烯酰酰胺胺的的浓浓度度和和交交联联度度。在在没没有有交交联联剂剂的的情情况况下下聚聚合合的的丙丙烯烯酰酰胺胺形形成成毫毫无无价价值值的的粘粘稠稠溶溶液液，而而经经双双丙丙烯烯酰酰胺胺交交联联后后凝凝胶胶的的刚刚性性和和抗抗张张强强度度都都有有所所增增加加，并并形形成成SDS-蛋蛋白白质质复复合合物物必必须须通通过过的的小小孔孔。这这些些小小孔孔的的孔孔径径随随“双双丙丙烯烯酰酰胺胺丙丙烯烯酰酰胺胺”比比率率的的增增加加而而变变小小，比比率率接接近近1：20时时孔孔径径达达到到最最小小值值。SDS聚聚丙丙烯烯酰酰胺胺凝凝胶胶大大多多按按“双双丙丙烯烯酰酰胺胺丙丙烯烯酰酰胺胺”为

12、为1：29配配制制，试试验验表表明明它它能能分分离离大大小小相相差差只只有有3%的蛋白质。的蛋白质。分离范围分离范围l凝凝胶胶的的筛筛分分特特性性取取决决于于它它的的孔孔径径，而而孔孔径径又又是是灌灌胶胶时时所所用用丙丙烯烯酰酰胺胺和和双双丙丙烯烯酰酰胺胺绝绝对对浓浓度度的的函函数数。用用515%的的丙丙烯烯酰酰胺胺所所灌灌制制凝凝胶胶的的线线性性分分离离范范围围如下表：如下表：丙丙烯酰胺胺浓度度（%）线性分离范性分离范围（kD）1512431016687.536945.057212双丙烯酰胺丙烯酰胺摩尔比为双丙烯酰胺丙烯酰胺摩尔比为1：29。上样缓冲液之一上样缓冲液之一上样缓冲液上样缓冲液(

13、SDS-PAGEloadingbuffer)是一种以是一种以溴酚蓝溴酚蓝为染料，为染料，5倍浓缩的倍浓缩的SDS-PAGE凝胶电泳上样凝胶电泳上样缓冲液，用于常规的缓冲液，用于常规的SDS-PAGE蛋白电泳样品上样。蛋白电泳样品上样。本产品分为本产品分为还原型和非还原型还原型和非还原型两种，还原型上样两种，还原型上样缓冲液中的巯基可使蛋白分子的链内二硫键和链间二缓冲液中的巯基可使蛋白分子的链内二硫键和链间二硫键断裂，使通过二硫键连接的各亚单位彼此分离，硫键断裂，使通过二硫键连接的各亚单位彼此分离，在电泳凝胶上显现多个蛋白条带，选购和使用时请务在电泳凝胶上显现多个蛋白条带，选购和使用时请务必注明

14、，仔细区分。必注明，仔细区分。上样缓冲液上样缓冲液之二之二l注意事项注意事项 还原型上样缓冲液中含一定量的还原型上样缓冲液中含一定量的DTT（二（二硫苏糖醇）硫苏糖醇）或巯基乙醇，有轻微刺激性气味，或巯基乙醇，有轻微刺激性气味，较易区分；较易区分；含巯基的试剂有一定的毒性，为了安全含巯基的试剂有一定的毒性，为了安全和健康，应穿和健康，应穿实验服并戴一次性手套操作实验服并戴一次性手套操作。上样缓冲液上样缓冲液之三之三使用说明使用说明1.1.按每按每4l蛋白样品加入蛋白样品加入1l蛋白上样缓冲液的比蛋白上样缓冲液的比例，混合蛋白样品和蛋白上样缓冲液例，混合蛋白样品和蛋白上样缓冲液(5X)。2.10

15、0或沸水浴加热或沸水浴加热35min，以充分变性蛋，以充分变性蛋白。白。3.冷却到室温后取上清直接上样到冷却到室温后取上清直接上样到SDS-PAGE胶胶加样孔内即可。加样孔内即可。4.通常电泳时染料到达胶的底端附近（通常电泳时染料到达胶的底端附近（0.51cm)即可停止电泳。即可停止电泳。增加样品密度以保证蛋白质沉入加样孔增加样品密度以保证蛋白质沉入加样孔内，一般上样缓冲液中加入一定浓度的内，一般上样缓冲液中加入一定浓度的甘油甘油或蔗糖或蔗糖，这样可以增加样品的比重。，这样可以增加样品的比重。上样缓冲液中的甘油非常重要，起增加上样缓冲液中的甘油非常重要，起增加粘度的作用，这可以阻止样品从梳样孔

16、中扩粘度的作用，这可以阻止样品从梳样孔中扩散出来到电泳缓冲液中。散出来到电泳缓冲液中。指示剂检测电泳的行进过程指示剂检测电泳的行进过程，一般加入，一般加入泳动速率较快的溴酚蓝指示电泳的前沿泳动速率较快的溴酚蓝指示电泳的前沿。上样缓冲液上样缓冲液之四之四 单纯的固定液一般难以达到这些要求，因此在实单纯的固定液一般难以达到这些要求，因此在实验中使用两种混和的固定液。验中使用两种混和的固定液。Carnoy固定液（甲醇固定液（甲醇:冰乙酸冰乙酸=3:l）每次使用前需临时配制每次使用前需临时配制，长时间放置影，长时间放置影响固定效果，固定时间响固定效果，固定时间15min至至24h，冰箱、室温均，冰箱、

17、室温均可。可。甲醇甲醇/冰醋酸固定液冰醋酸固定液甲醇甲醇/冰醋酸固定液冰醋酸固定液甲醇甲醇：有固定、硬化和脱水的作用。可以固定白蛋白、球蛋白、核蛋白，但对核蛋白固定效果较差(亲和力小且易自溶)。甲醇固定的特点是杀死快，渗透力强，对组织收缩较大(可收缩20左右)，可使材料变硬。冰醋酸冰醋酸：纯醋酸在温度稍变低时即形成冰晶，所以又称为冰醋酸。常用的浓度作为固定液。冰醋酸对材料有膨胀作用，对核蛋白固定好，可与水、酒精、氯仿混合。染色剂染色剂 考马斯亮蓝染色考马斯亮蓝染色常用染色方法常用染色方法 银染法银染法 金属离子染色法金属离子染色法以考马斯亮蓝染色为例以考马斯亮蓝染色为例 考马斯亮蓝法测定蛋白质

18、浓度，是利用蛋白质染料结合的原理，定量的测定微量蛋白浓度的快速、灵敏的方法。考马斯亮蓝考马斯亮蓝考马斯亮蓝考马斯亮蓝 考马斯亮蓝最大光吸收在488nm；当它与蛋白质结合后变为青色，蛋白质-色素结合物在595nm波长下有最大光吸收。其光吸收值与蛋白质含量成正比，因此可用于蛋白质的定量测定。蛋白质与考马斯亮蓝G-250结合在2min左右的时间内达到平衡，完成反应十分迅速；其结合物在室温下1h内保持稳定。该法是1976年Bradford建立，试剂配制简单，操作简便快捷，反应非常灵敏，可测定微克级蛋白质含量，测定蛋白质浓度范围为01000gmL，是一种常用的微量蛋白质快速测定方法。实验步骤实验步骤试剂

19、配制试剂配制(1)30%丙烯酰胺（丙烯酰胺（Acr）：）：称Acr30g，甲叉双丙烯酰胺（Bis），加蒸馏水至100ml，过滤后置棕色瓶中。4，12月（2）10%SDS（十二烷基磺酸钠）（3）Tris-HCl缓冲液缓冲液(pH8.9)：称取Tris 18.2g,加入50ml水,用1mol/L盐酸调pH8.8,最后用蒸馏水定容至100ml。（4）缓冲液缓冲液(pH6.8):称取Tris12.1g,加入50ml水，用1mol/L盐酸调pH6.8,最后用蒸馏水定容至100ml（5）缓冲液）缓冲液(pH8.0)：称取Tris0.6g,加入50ml水，用1mol/L盐酸调pH8.0,最后用蒸馏水定容至1

20、00ml（）TEMED（四甲基乙二胺）（）样品溶解液（）样品溶解液：SDS（100mg）+巯基乙醇（）+溴酚蓝（2mg）+甘油（2g）（2ml），最后定容至10ml（）固定液：（）固定液：50%甲醇454ml，冰乙酸46ml混匀（）染色液：染色液：称取考马斯亮蓝，加上述固定液250ml，过滤后备用（1）脱色液：）脱色液：冰乙酸75ml，甲醇50ml，加蒸馏水定容至1000ml（1）电极缓冲液）电极缓冲液 （内含0.1%SDS，甘氨酸缓冲液）：称，甘氨酸，加入SDS1g，加蒸馏水使其溶解后定容至1000ml（1212）高分子量标准蛋白试剂盒）高分子量标准蛋白试剂盒:兔磷酸化酶兔磷酸化酶B MW=

21、97,400 B MW=97,400 牛血清白蛋白牛血清白蛋白 MW=66,200 MW=66,200兔肌动蛋白兔肌动蛋白 MW=43,000 MW=43,000牛碳酸酐酶牛碳酸酐酶 MW=31,000 MW=31,000 胰蛋白酶抑制剂胰蛋白酶抑制剂 MW=20,100 MW=20,100鸡蛋清溶菌酶鸡蛋清溶菌酶 MW=14,400 MW=14,400 置置-20-20保存，使用前室温融化，沸水浴中加热保存，使用前室温融化，沸水浴中加热3-3-5 5分钟后上样。分钟后上样。（1313）样品：兔血清）样品：兔血清.聚胶前准备聚胶前准备 (1)配制配制10过硫酸铵溶液过硫酸铵溶液(需每天新鲜配需

22、每天新鲜配制制)。(2)将单体储存液、缓冲液、水按照一定比将单体储存液、缓冲液、水按照一定比例配制成凝胶溶液。例配制成凝胶溶液。(3)将灌胶装置准备好。将灌胶装置准备好。(4)待凝胶溶液平衡至室温待凝胶溶液平衡至室温(2325)后，后，真空脱气真空脱气15min。l1）.安装膜具 l将玻璃板用蒸馏水洗净晾干将玻璃板用蒸馏水洗净晾干,将凡士林将凡士林均匀的涂在两侧的封条上，用封条将玻璃均匀的涂在两侧的封条上，用封条将玻璃板封好。板封好。称取称取2g2g琼脂糖加琼脂糖加100ml100ml蒸馏水，慢慢的煮蒸馏水，慢慢的煮开（煮的过程中要不断搅拌），将煮好的开（煮的过程中要不断搅拌），将煮好的(无气

23、泡无气泡)琼脂糖倒入支胶架三分之二高度，琼脂糖倒入支胶架三分之二高度，快速将两侧封好的玻璃板插入琼脂糖中，快速将两侧封好的玻璃板插入琼脂糖中，注意注意凹槽朝外凹槽朝外，用夹子固定好，用夹子固定好，待凝固待凝固后后灌胶。灌胶。l2）制备SDS聚丙烯酰胺凝胶 制备分离胶制备分离胶 30%30%丙烯酰胺丙烯酰胺5ml+5ml+分离胶缓冲液分离胶缓冲液 5ml5ml+10%SDS 0.2ml+10%+10%SDS 0.2ml+10%过硫酸铵过硫酸铵 0.2ml+0.2ml+蒸蒸馏水馏水 9.6 ml 9.6 ml；混匀后加入；混匀后加入8ul TEMED,8ul TEMED,立即混匀立即混匀（不能有气

24、泡），灌入安装好的垂直板中，灌胶（不能有气泡），灌入安装好的垂直板中，灌胶时要匀速贴壁流入，防止气泡产生。灌至离槽沿时要匀速贴壁流入，防止气泡产生。灌至离槽沿3cm3cm处，处，立即立即在胶面上用移液管加入在胶面上用移液管加入1-2cm1-2cm的蒸馏的蒸馏水，静置，待凝胶聚合后（约水，静置，待凝胶聚合后（约30min30min），去除水），去除水相，然后用相，然后用吸水纸吸干残余的水吸水纸吸干残余的水。l制备浓缩胶制备浓缩胶 l30%30%丙烯酰胺丙烯酰胺 1.32ml+1.32ml+浓缩胶缓冲液浓缩胶缓冲液 1ml 1ml +10%SDS 0.08ml+10%AP 0.08ml+10%SD

25、S 0.08ml+10%AP 0.08ml+蒸馏水蒸馏水 5.6 5.6 mlml；混匀后加入；混匀后加入8ul TEMED,8ul TEMED,立即混匀（不能有气立即混匀（不能有气泡），灌入垂直板至离槽沿处，插入梳子（不能泡），灌入垂直板至离槽沿处，插入梳子（不能混入气泡），静置，待凝胶聚合后，加入电泳缓混入气泡），静置，待凝胶聚合后，加入电泳缓冲液，拔去梳子。冲液，拔去梳子。l先用刀片先用刀片将琼脂糖剥离开，再将玻璃板从架子将琼脂糖剥离开，再将玻璃板从架子上取出，再用夹子固定在电泳槽内（注意凹槽朝上取出，再用夹子固定在电泳槽内（注意凹槽朝内），将电泳缓冲液倒入电泳槽内。内），将电泳缓冲液倒

26、入电泳槽内。3)3).样品预处理样品预处理 取样品加入上样缓冲液，置沸水中煮取样品加入上样缓冲液，置沸水中煮5 5分钟。分钟。4)4).上样上样 第一个孔内加第一个孔内加20ul20ul标准蛋白质溶液标准蛋白质溶液其他每孔加入其他每孔加入20ul20ul样品。上样时要将移液枪头样品。上样时要将移液枪头垂直插入孔内且要缓慢匀速推入样品。垂直插入孔内且要缓慢匀速推入样品。垂直板垂直板电泳装置电泳装置加样加样样品迁样品迁移方向移方向l5)5).电泳电泳 接通电源，将电压调至接通电源，将电压调至80V80V、50mA50mA。当溴酚兰进入分离。当溴酚兰进入分离胶后，把电压提高到胶后，把电压提高到150

27、V150V、80mA80mA，电泳至溴酚兰距离胶底，电泳至溴酚兰距离胶底部部1-2cm1-2cm处，停止电泳。处，停止电泳。6)6).固定固定 取下凝胶，置于培养皿中的固定液中，轻轻振摇取下凝胶，置于培养皿中的固定液中，轻轻振摇1010分分钟，倒去固定液。钟，倒去固定液。7)7).染色脱色染色脱色 培养皿中倒入培养皿中倒入50-6050-60度预热的染色液浸没凝胶，约度预热的染色液浸没凝胶，约4040分钟后回收染色液，用清水冲洗掉胶上多余的染色液。倒分钟后回收染色液，用清水冲洗掉胶上多余的染色液。倒入脱色液，脱色入脱色液，脱色2 2小时，期间换脱色液小时，期间换脱色液2-32-3次。次。电泳过

28、程中分子迁移的规律，小分子走在前头，电泳过程中分子迁移的规律，小分子走在前头，大分子滞后。电泳凝胶相当于凝胶过滤中的一大分子滞后。电泳凝胶相当于凝胶过滤中的一个带孔胶粒。个带孔胶粒。混合样品混合样品带孔胶带孔胶按分子按分子大小分离大小分离电泳方向电泳方向电泳电泳小分子小分子大分子大分子夹在两块玻璃夹在两块玻璃板之间的凝胶板之间的凝胶电泳电泳缓冲液缓冲液电泳电泳缓冲液缓冲液加在槽中的经加在槽中的经SDS处理的样品处理的样品分子量小分子量小分子量大分子量大电源电源电泳后的凝胶经考马斯亮蓝染色、电泳后的凝胶经考马斯亮蓝染色、脱色后的凝胶照片脱色后的凝胶照片图1 标准蛋白质与待测样品电泳图谱 94 0

29、0062 00043 00031 00020 10014 400注：胶槽1 标准蛋白；胶槽2、3 样品蛋白.结果处理结果处理 标准蛋白分子量标准蛋白分子量未未知知蛋蛋白白在一定的凝胶浓度下，在一定的凝胶浓度下，多肽链分子量的对数与多肽链分子量的对数与多肽链的相对迁移率成多肽链的相对迁移率成线性关系，所以可以通线性关系，所以可以通过标准曲线求未知多肽过标准曲线求未知多肽链分子量链分子量。相对迁移率相对迁移率实验注意事项实验注意事项 1.1.形成凝胶的试剂要有足够的形成凝胶的试剂要有足够的纯度纯度：丙烯酰胺是：丙烯酰胺是形成凝胶溶液中的最主要成份，其纯度的好坏将形成凝胶溶液中的最主要成份，其纯度的

30、好坏将直接影响凝胶的质量，丙烯酰胺可能混有的影响直接影响凝胶的质量，丙烯酰胺可能混有的影响凝胶形成的杂质有：线性多聚丙烯酰胺、金属离凝胶形成的杂质有：线性多聚丙烯酰胺、金属离子等。子等。2.2.注意不能随便倾倒注意不能随便倾倒单体溶液单体溶液，应加入过量的催，应加入过量的催化剂使其完全聚合成无毒性的聚丙烯酰胺后再弃化剂使其完全聚合成无毒性的聚丙烯酰胺后再弃置。置。l3.TEMED中混有氧化试剂后其自身极中混有氧化试剂后其自身极易被氧化而失去催化能力，另外易被氧化而失去催化能力，另外TEMED的氧化产物的氧化产物呈黄色呈黄色，以此可以鉴定，以此可以鉴定TEMED的质量。如果无法获得无色透明的质量

31、。如果无法获得无色透明的的TEMED，只能适当增加用量以保证聚，只能适当增加用量以保证聚胶速度。胶速度。l4.过硫酸铵过硫酸铵容易吸潮，由于它溶解于水后很容易吸潮，由于它溶解于水后很快降解失去催化能力，因此潮解后的过硫酸铵快降解失去催化能力，因此潮解后的过硫酸铵会渐渐失去活性。保存固体过硫酸铵应密闭干会渐渐失去活性。保存固体过硫酸铵应密闭干燥。过硫酸铵溶液宜制胶当天配制。另外在配燥。过硫酸铵溶液宜制胶当天配制。另外在配制凝胶溶液时过硫酸铵不易过量，否则会使蛋制凝胶溶液时过硫酸铵不易过量，否则会使蛋白质在电泳过程中被氧化白质在电泳过程中被氧化(主要指天然无变性剂主要指天然无变性剂凝胶凝胶)。l5

32、.激活剂的用量激活剂的用量:激活剂的浓度适当与激活剂的浓度适当与否不仅可以决定凝胶聚合的速度，也将影响凝否不仅可以决定凝胶聚合的速度，也将影响凝胶的质量。增加过硫酸铵或胶的质量。增加过硫酸铵或TEMED的用量，的用量，将使丙烯酰胺聚合链长度缩短，凝胶会变得脆将使丙烯酰胺聚合链长度缩短，凝胶会变得脆弱而失去应有的柔性。二者多至一定程度时，弱而失去应有的柔性。二者多至一定程度时，聚合链长度过短，将不会形成肉眼可见的凝胶，聚合链长度过短，将不会形成肉眼可见的凝胶，这些短链多聚物呈溶液状，只是其粘度较聚合这些短链多聚物呈溶液状，只是其粘度较聚合前高一些。前高一些。6.温度的影响温度的影响聚胶的最佳温度

33、为聚胶的最佳温度为2325，需要注意灌胶前单体溶液，需要注意灌胶前单体溶液(通常置于通常置于4冰箱冰箱)及玻璃板或管及玻璃板或管(有时从烘箱取出有时从烘箱取出)也要平衡至也要平衡至此温度。由于溶液在抽真空时仍维持较低温度，此温度。由于溶液在抽真空时仍维持较低温度，需待其升至室温后再脱气，另外升温后脱去氧需待其升至室温后再脱气，另外升温后脱去氧气的速度较低温时快。气的速度较低温时快。7.氧气的影响氧气的影响氧气会与被激活的单体自由基氧气会与被激活的单体自由基作用抑制聚合过程，因此需在加激活剂前对单体作用抑制聚合过程，因此需在加激活剂前对单体溶液脱气。如果省去这一步骤，凝胶仍能聚合但溶液脱气。如果

34、省去这一步骤，凝胶仍能聚合但需更多的激活剂，并且不能保证很好的重复性，需更多的激活剂，并且不能保证很好的重复性，充分去除氧气可以用尽量少的激活剂得到最佳聚充分去除氧气可以用尽量少的激活剂得到最佳聚合效果。通常在较好的真空度脱气至少合效果。通常在较好的真空度脱气至少15min。8.凝胶添加剂：凝胶添加剂：凝胶中常常加入凝胶中常常加入SDS、尿素、尿素、TritonX-100等添加剂。等添加剂。SDS加加入后不会对凝胶的聚合产生影响，但尿入后不会对凝胶的聚合产生影响，但尿素会使凝胶孔径变小，这一特性可用来素会使凝胶孔径变小，这一特性可用来分离小分子蛋白质或多肽。分离小分子蛋白质或多肽。9.聚胶时间

35、：聚胶时间：虽然应用过硫酸铵虽然应用过硫酸铵TEMED催化后灌胶催化后灌胶1520min即可观察即可观察到凝胶的形成，但至少需到凝胶的形成，但至少需90min才能保证才能保证95以上的单链聚合成长短以及具有合适以上的单链聚合成长短以及具有合适的孔径大小。采用核黄素时聚胶时间需更的孔径大小。采用核黄素时聚胶时间需更长，但它一般用于等电聚焦即根据蛋白质长，但它一般用于等电聚焦即根据蛋白质的电荷性质进行分离，对孔径大小要求不的电荷性质进行分离，对孔径大小要求不高，因此不必等很长时间高，因此不必等很长时间(完全聚合需完全聚合需8h)。10.单体的浓度单体的浓度：是指单体总重量是指单体总重量(丙烯酰丙烯

36、酰胺胺+bis)在溶液中的百分比在溶液中的百分比(wv)，可选择的范，可选择的范围为围为330，单体浓度增加后聚合速度将加，单体浓度增加后聚合速度将加快，因此可适当减少催化剂的用量。快，因此可适当减少催化剂的用量。11.SDS与蛋白质的结合按质量成比例与蛋白质的结合按质量成比例（即：（即：1.4gSDS/g蛋白质），蛋白质含量不可以超标，蛋白质），蛋白质含量不可以超标，否则否则SDS结合量不足。结合量不足。l12.用用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法测定蛋白质聚丙烯酰胺凝胶电泳法测定蛋白质相对分子量时，必须同时作标准曲线。不能利用相对分子量时，必须同时作标准曲线。不能利用这次的标准曲线作为下次用。

37、并且这次的标准曲线作为下次用。并且SDS-PAGE测测定分子量有定分子量有10误差，不可完全信任。误差，不可完全信任。l13.有的蛋白质（如：电荷异常或结构异常的蛋有的蛋白质（如：电荷异常或结构异常的蛋白质；带有较大辅基的蛋白质）不能采用该法测白质；带有较大辅基的蛋白质）不能采用该法测相对分子量。相对分子量。14.有些蛋白质由亚基（如血红蛋白）或两条以上有些蛋白质由亚基（如血红蛋白）或两条以上肽链（肽链（-胰凝乳蛋白酶）组成的，它们在巯基乙胰凝乳蛋白酶）组成的，它们在巯基乙醇和醇和SDS的作用下解离成亚基或多条单肽链。因的作用下解离成亚基或多条单肽链。因此，对于这一类蛋白质，此，对于这一类蛋白

38、质，SDS-聚丙烯酰胺凝胶聚丙烯酰胺凝胶电泳法测定的只是它们的亚基或是单条肽链的相电泳法测定的只是它们的亚基或是单条肽链的相对分子量。对分子量。15.如果该电泳中出现拖尾、染色带的背景不清如果该电泳中出现拖尾、染色带的背景不清晰等现象，可能是晰等现象，可能是SDS不纯引起不纯引起。常见问题及处理办法常见问题及处理办法 纹理和拖尾现象纹理和拖尾现象 由于样品溶解不佳引起的，克服的方法可以由于样品溶解不佳引起的，克服的方法可以在加样前离心，增加一些增溶辅助试剂如尿素。在加样前离心，增加一些增溶辅助试剂如尿素。蛋白带过宽蛋白带过宽，与邻近泳道的蛋白带相连是与邻近泳道的蛋白带相连是由于加样量太多，可以

39、减少上样量。由于加样量太多，可以减少上样量。电泳时间比正常要长电泳时间比正常要长可能由于凝胶缓冲系统和电极缓冲系统的可能由于凝胶缓冲系统和电极缓冲系统的pH选择错误。选择错误。指示剂成微笑符号指示剂成微笑符号（指示剂前沿呈现向上的（指示剂前沿呈现向上的曲线形）：说明凝胶的不均匀冷却，中间部分曲线形）：说明凝胶的不均匀冷却，中间部分冷却不好，导致分子有不同的迁移率冷却不好，导致分子有不同的迁移率。.指示剂成微笑符号指示剂成微笑符号（指示剂前沿呈现（指示剂前沿呈现向下向下的曲的曲线形），由于电泳槽的装置不合适，尤其是凝胶线形），由于电泳槽的装置不合适，尤其是凝胶和玻璃板组成的和玻璃板组成的“三明治

40、三明治”底部有气泡或靠近隔底部有气泡或靠近隔片的凝胶聚合不完全片的凝胶聚合不完全 .凝胶时间不对凝胶时间不对 通常胶在通常胶在30min内凝聚如果凝聚得太慢，可内凝聚如果凝聚得太慢，可能是能是TEMED，APS剂不够或者失效剂不够或者失效l7.出现出现“皱眉皱眉”（两边向下中间鼓起）（两边向下中间鼓起）主要出现在蛋白质垂直电泳槽中，一般是主要出现在蛋白质垂直电泳槽中，一般是两板之间的底部间隙气泡未排除干净。处理办两板之间的底部间隙气泡未排除干净。处理办法：可在两板间加入适量缓冲液，以排除气泡法：可在两板间加入适量缓冲液，以排除气泡。l8.8.出现出现“鬼带鬼带”如何处理？如何处理？“鬼带鬼带”

41、就是在跑大分子构象复杂的蛋白质就是在跑大分子构象复杂的蛋白质分子时，常会出现在泳道顶端（有时在浓缩胶中）分子时，常会出现在泳道顶端（有时在浓缩胶中）的一些大分子未知条带或加样孔底部有沉淀，主的一些大分子未知条带或加样孔底部有沉淀，主要由于还原剂在加热的过程中被氧化而失去活性，要由于还原剂在加热的过程中被氧化而失去活性，致使原来被解离的蛋白质分子重新折叠结合和亚致使原来被解离的蛋白质分子重新折叠结合和亚基重新缔合，聚合成大分子，其分子量要比目标基重新缔合，聚合成大分子，其分子量要比目标条带大，有时不能进入分离胶。但它却于目标条条带大，有时不能进入分离胶。但它却于目标条带有相同的免疫学活性，在带有

42、相同的免疫学活性，在WB反应中可见其能反应中可见其能与目标条带对应的抗体作用。处理办法：在加热与目标条带对应的抗体作用。处理办法：在加热煮沸后，再添加适量的煮沸后，再添加适量的DTT或或Beta巯基乙醇，以巯基乙醇，以补充不足的还原剂；或可加适量补充不足的还原剂；或可加适量EDTA来阻止还来阻止还原剂的氧化。原剂的氧化。l 9.9.为什么溴酚蓝不能起到指示作用？为什么溴酚蓝不能起到指示作用？我们在实验中常会遇到溴酚蓝已跑出板底，我们在实验中常会遇到溴酚蓝已跑出板底，但蛋白质却还未跑下来的现象。主要与缓冲液但蛋白质却还未跑下来的现象。主要与缓冲液和分离胶的浓度有关。处理办法：更换正确和分离胶的浓

43、度有关。处理办法：更换正确pH值的值的Buffer；降低分离胶的浓度；降低分离胶的浓度。SDS-PAGE的优点的优点l设备简单设备简单l快速快速l分辨率和灵敏度高分辨率和灵敏度高 l特别适用于寡聚蛋白及其亚基的分析鉴定特别适用于寡聚蛋白及其亚基的分析鉴定和分子量的测定和分子量的测定 SDS-PAGE的缺点的缺点 1.有许多蛋白质是由亚基或两条以上肽链有许多蛋白质是由亚基或两条以上肽链组成的（如血红蛋白、胰凝乳蛋白酶等），他组成的（如血红蛋白、胰凝乳蛋白酶等），他们在变性剂和强还原剂的作用下，解离成亚基们在变性剂和强还原剂的作用下，解离成亚基或单条肽链。因此，对于这一类的蛋白质，或单条肽链。因此

44、，对于这一类的蛋白质，SDS-PAGE测定的只是它们的亚基或单条肽链测定的只是它们的亚基或单条肽链的分子量，而不是完整蛋白质的分子量的分子量，而不是完整蛋白质的分子量。SDS-PAGE的缺点的缺点l2.还有一些电荷异常和构象特殊的蛋白质还有一些电荷异常和构象特殊的蛋白质（如组蛋白（如组蛋白F1），含有较大辅基的糖蛋白和含），含有较大辅基的糖蛋白和含有二硫键较多的蛋白质，以及一些结构蛋白有二硫键较多的蛋白质，以及一些结构蛋白（如胶原蛋白）等，它们在（如胶原蛋白）等，它们在SDS-凝胶系统中，凝胶系统中，电泳的迁移率与分子量的对数不呈线性关系。电泳的迁移率与分子量的对数不呈线性关系。因此，为了测得

45、真实和完整的蛋白质分子量，因此，为了测得真实和完整的蛋白质分子量，通常可采用多种方法进行测定和相互验证。通常可采用多种方法进行测定和相互验证。小技巧小技巧l1 1：电泳缓冲液的使用：电泳缓冲液的使用：电泳缓冲液是完全可以回收再用的，但前电泳缓冲液是完全可以回收再用的，但前提是每次的内层缓冲液必须是新配的。每次在提是每次的内层缓冲液必须是新配的。每次在电泳完成后内外层缓冲液一起回收到一个瓶里，电泳完成后内外层缓冲液一起回收到一个瓶里，作为下次的外层缓冲液使用。就是配制新的缓作为下次的外层缓冲液使用。就是配制新的缓冲液只作为内层使用（配制冲液只作为内层使用（配制1L可以用很久的），可以用很久的），

46、每次都用回收的缓冲液作外层，效果一点都不每次都用回收的缓冲液作外层，效果一点都不差，即节省了试剂，又节省了时间。差，即节省了试剂，又节省了时间。2 2：电泳条件的选则电泳条件的选则 电泳不采用先低压再高压的常用方法，每电泳不采用先低压再高压的常用方法，每次都是上样后直接采用次都是上样后直接采用200V恒压电泳，一般恒压电泳，一般BioRad的胶板，的胶板，39min即可跑到头，电泳结即可跑到头，电泳结果一点都没有影响。果一点都没有影响。l3 3：染色与脱色染色与脱色 分子克隆上介绍的方法耗时太长，现在用分子克隆上介绍的方法耗时太长，现在用Crystal的的方法已经相当快了，稍做改动：染色时加入

47、染液后，在方法已经相当快了，稍做改动：染色时加入染液后，在微波炉中煮沸一次即可，切记不要喷了，这个过程大约微波炉中煮沸一次即可，切记不要喷了，这个过程大约2030秒，在摇床上染色，这时可以去处理胶板，电泳秒，在摇床上染色，这时可以去处理胶板，电泳槽，台面，待收拾干净后染色也就结束了（不要觉得染槽，台面，待收拾干净后染色也就结束了（不要觉得染色时间太短了，已经足够了，太长了脱色也麻烦），此色时间太短了，已经足够了，太长了脱色也麻烦），此过程大约需要过程大约需要35min；回收染液，用自来水清洗几次；回收染液，用自来水清洗几次胶，再加入适量自来水，放入微波炉中煮沸，条件与染胶，再加入适量自来水，放入微波炉中煮沸，条件与染色时一致，摇床脱色，此时你就可以做其他试验了，色时一致，摇床脱色，此时你就可以做其他试验了，35min后可以再换一次清水，煮沸脱色，我的经验是一后可以再换一次清水，煮沸脱色，我的经验是一次用水脱色就可以看到次用水脱色就可以看到Marker条带了，两次以后就可条带了，两次以后就可以清析的看到你的结果了，如果觉得结果不错可以留存以清析的看到你的结果了，如果觉得结果不错可以留存备用，再加入脱色液，脱干净了就行了。备用，再加入脱色液，脱干净了就行了。