《物理图谱》PPT课件.ppt

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1、基因组学基因组学 杭州师范大学生命与环境科学学院杭州师范大学生命与环境科学学院 向太和向太和第三章第三章 物理图绘制物理图绘制3.1 3.1 概述概述3.2 3.2 限制性作图限制性作图 荧光原位杂交荧光原位杂交3.4 3.4 序列标记位点作图序列标记位点作图3.5 3.5 克隆作图克隆作图3.6 3.6 遗传图与物理图的整合遗传图与物理图的整合3 Physical mapping3 Physical mapping3.1 3.1 概述概述为什么要进行物理作图？为什么要进行物理作图？遗传学图谱分辨率有限遗传学图谱分辨率有限遗传学图的分辨率依赖于遗传学图的分辨率依赖于得到的交换的数目。对于得到的

2、交换的数目。对于人类与大多数真核生物来人类与大多数真核生物来说，巨大数量的后代不易说，巨大数量的后代不易获得。获得。遗传学图谱精确度有限遗传学图谱精确度有限酿酒酵母酿酒酵母chr3chr3遗传图与物理图的比较遗传图与物理图的比较基因组学基因组学 杭州师范大学生命与环境科学学院杭州师范大学生命与环境科学学院 向太和向太和3 Physical mapping3 Physical mapping3.1 3.1 概述概述结构基因组学的发展：结构基因组学的发展：遗传作图遗传作图物理作图物理作图 基因组测序基因组测序 基因组学基因组学 杭州师范大学生命与环境科学学院杭州师范大学生命与环境科学学院 向太和向

3、太和染色体染色体DNADNA作图文库作图文库物理图谱物理图谱大分子大分子DNADNA的提取的提取大片段大片段DNADNA的克隆的克隆物理作图物理作图物理作图的主要环节物理作图的主要环节3 Physical mapping3 Physical mapping3.1 3.1 概述概述基因组学基因组学 杭州师范大学生命与环境科学学院杭州师范大学生命与环境科学学院 向太和向太和物理作图的主要方法物理作图的主要方法v限制性作图（限制性作图（restriction mapping)restriction mapping)v荧光原位杂交（荧光原位杂交（fluorescent hybridization,FI

4、SH)fluorescent hybridization,FISH)v序列标签位点（序列标签位点（STS)STS)作图作图（sequence tagged sites mapping)sequence tagged sites mapping)3 Physical mapping3 Physical mapping3.1 3.1 概述概述基因组学基因组学 杭州师范大学生命与环境科学学院杭州师范大学生命与环境科学学院 向太和向太和限制性作图限制性作图 定义：定义：将限制性酶切位点标定在将限制性酶切位点标定在DNADNA分子的分子的相对位置。相对位置。局限性：局限性：只能应用于相对较小的只能应用于

5、相对较小的DNADNA分子。分子。3 Physical mapping3 Physical mapping3.2 3.2 限制酶作图限制酶作图基因组学基因组学 杭州师范大学生命与环境科学学院杭州师范大学生命与环境科学学院 向太和向太和限制性作图的基本原理限制性作图的基本原理比较一种比较一种DNADNA分子被不同限制性内切酶切割所产生的片段大小。分子被不同限制性内切酶切割所产生的片段大小。首先用一种酶处理样品后，电泳确定首先用一种酶处理样品后，电泳确定DNADNA片段的大小。片段的大小。然后用第二种酶处理，获得第二组片段。然后用第二种酶处理，获得第二组片段。最后用两种酶混合处理，获得第三组片段。

6、最后用两种酶混合处理，获得第三组片段。收集上述资料进行对比组装。收集上述资料进行对比组装。两种酶切位点交替出现的区段用加减法确定其的相对位置。两种酶切位点交替出现的区段用加减法确定其的相对位置。连续出现连续出现2 2个或多个相同酶切位点的区段，采用部分酶解法。个或多个相同酶切位点的区段，采用部分酶解法。切点过多时可以采用末端同位素标记结合部分酶解进行绘图。切点过多时可以采用末端同位素标记结合部分酶解进行绘图。3 Physical mapping3 Physical mapping3.2 3.2 限制酶作图限制酶作图基因组学基因组学 杭州师范大学生命与环境科学学院杭州师范大学生命与环境科学学院

7、向太和向太和3 Physical mapping3 Physical mapping3.2 3.2 限制酶作图限制酶作图限制酶作图的基本方法限制酶作图的基本方法8 8结论：图谱结论：图谱II II是正确的是正确的双限制性酶切图解双限制性酶切图解 片段片段 结论结论0.2kb,0.5kb 0.2kb,0.5kb 必然来自的必然来自的BamHIBamHI片段，其中有一个片段，其中有一个EcoRIEcoRI的位点的位点 1.0kb 1.0kb 这必然是一个不含这必然是一个不含EcoRIEcoRI位点的位点的BamHIBamHI片段，如果我们如下放置的片段，就可以解释片段的出现片段，如果我们如下放置的

8、片段，就可以解释片段的出现1.2kb,2.0kb 1.2kb,2.0kb 这必然也是不含这必然也是不含EcoRIEcoRI位点的位点的BamHIBamHI片段，它们必须位于的片段，它们必须位于的EcoRIEcoRI片段中。这样就有两种可能：片段中。这样就有两种可能：BamHIBamHI部分限制性酶切的预测部分限制性酶切的预测如果图谱如果图谱I I是正确的，不完全消化产物应该包括的片段是正确的，不完全消化产物应该包括的片段如果图谱如果图谱I I是正确的，不完全消化产物应该包括的片段是正确的，不完全消化产物应该包括的片段BamHIBamHI亚适条件亚适条件基因组学基因组学 杭州师范大学生命与环境科

9、学学院杭州师范大学生命与环境科学学院 向太和向太和限制性作图的规模受限于限制性片段的大小限制性作图的规模受限于限制性片段的大小 限制性片段越大，切点越多，需要比较的片段也会增限制性片段越大，切点越多，需要比较的片段也会增加，而且当片段多到一定程度，一些大小相似的片段会重加，而且当片段多到一定程度，一些大小相似的片段会重叠在一起，不可能组成一个清晰的图谱。因此，叠在一起，不可能组成一个清晰的图谱。因此，限制性作限制性作图更适合于小分子。图更适合于小分子。实际应用中如果实际应用中如果DNADNA分子小于分子小于50kb50kb，通常可以选用识别，通常可以选用识别6 6个核苷酸序列的限制酶来建立清晰

10、的限制性图谱。个核苷酸序列的限制酶来建立清晰的限制性图谱。3 Physical mapping3 Physical mapping3.2 3.2 限制酶作图限制酶作图基因组学基因组学 杭州师范大学生命与环境科学学院杭州师范大学生命与环境科学学院 向太和向太和3 Physical mapping3 Physical mapping3.2 3.2 限制酶作图限制酶作图大于大于50kb50kb的基因组能否用限制性作图？的基因组能否用限制性作图？答案是肯定的。通过选择靶答案是肯定的。通过选择靶DNADNA分子中的稀有酶切位点分子中的稀有酶切位点酶可以克服限制性酶切作图的局限性。酶可以克服限制性酶切作图

11、的局限性。稀有切点内切酶稀有切点内切酶:在基因组在基因组DNADNA顺序中只有很少可识别顺序中只有很少可识别序列的限制酶序列的限制酶,一般识别位点在一般识别位点在6-86-8碱基对之间碱基对之间,并含有并含有高高G/CG/C比。比。稀有切点限制酶分为两大类：稀有切点限制酶分为两大类：识别具有识别具有7 7或或8 8个核苷酸序列的酶；个核苷酸序列的酶；识别序列包含靶识别序列包含靶DNADNA稀少基序的酶。稀少基序的酶。基因组学基因组学 杭州师范大学生命与环境科学学院杭州师范大学生命与环境科学学院 向太和向太和基因组学基因组学 杭州师范大学生命与环境科学学院杭州师范大学生命与环境科学学院 向太和向

12、太和选用稀有切点限制酶的注意事项选用稀有切点限制酶的注意事项v识别顺序越长产生的片段越大，但当识别位点含非特异顺序识别顺序越长产生的片段越大，但当识别位点含非特异顺序时，片段长度小于预期；时，片段长度小于预期；v识别位点的碱基组成影响限制性片段的大小。高等生物基因识别位点的碱基组成影响限制性片段的大小。高等生物基因组一般组一般A/TA/T比较高比较高,应选应选G/C G/C 高比例限制酶高比例限制酶,如如-GC GGCCGC-GC GGCCGC-(NotINotI)v限制酶识别位点较长，即使高等真核生物基因组也没有这种限制酶识别位点较长，即使高等真核生物基因组也没有这种序列，可以通过转座或转导

13、将这类酶切位点引入待测基因组；序列，可以通过转座或转导将这类酶切位点引入待测基因组；v基因组基因组DNADNA甲基化对酶切位点出现频率的影响。高等生物基甲基化对酶切位点出现频率的影响。高等生物基因组因组DNADNA甲基化比例很高甲基化比例很高,但果蝇和酵母基因组无甲基化。但果蝇和酵母基因组无甲基化。3 Physical mapping3.2 限制酶作图限制酶作图基因组学基因组学 杭州师范大学生命与环境科学学院杭州师范大学生命与环境科学学院 向太和向太和稀有切点限制酶在物理作图中的应用稀有切点限制酶在物理作图中的应用v低等生物基因组物理作图低等生物基因组物理作图v大分子大分子DNADNA克隆片段

14、的物理作图克隆片段的物理作图3 Physical mapping3.2 限制酶作图限制酶作图基因组学基因组学 杭州师范大学生命与环境科学学院杭州师范大学生命与环境科学学院 向太和向太和3 Physical mapping3 Physical mapping3.2 3.2 限制酶作图限制酶作图选用稀有切点限制酶酶切大片段选用稀有切点限制酶酶切大片段DNADNA预测稀有切点限制性内切酶酶切片段大小预测稀有切点限制性内切酶酶切片段大小1)1)根据稀有酶切位点限制酶识别碱基数推测产生的根据稀有酶切位点限制酶识别碱基数推测产生的DNADNA 片段长段片段长段:NotI NotI 酶酶:GC/GGCCGC

15、:GC/GGCCGC 4 48 8=74 536 bp=75 kb=74 536 bp=75 kb I-SceI I-SceI 酶酶:TAGGGATAA/CAGGGTAAT:TAGGGATAA/CAGGGTAAT 4 41818=90 000 000 bp=90 000 kb=90 000 000 bp=90 000 kb2)2)由于多细胞真核生物基因组由于多细胞真核生物基因组DNADNA存在大量的甲基化位点存在大量的甲基化位点,识别识别CGCG序列的稀有酶切点限制酶实际产生的序列的稀有酶切点限制酶实际产生的DNADNA片段比预期片段比预期大得多大得多.如如NotINotI酶切人类基因组酶切人

16、类基因组DNADNA产生的片段常在产生的片段常在200 kb200 kb以以上，平均长度达到上，平均长度达到1Mb1Mb。基因组学基因组学 杭州师范大学生命与环境科学学院杭州师范大学生命与环境科学学院 向太和向太和PFGEPFGE的基本原理的基本原理 将一个方向不断变换的电场，取代简单的单一将一个方向不断变换的电场，取代简单的单一电场（单向电场，使电泳中受阻的电场（单向电场，使电泳中受阻的DNADNA分子在电场分子在电场改变时扭转迁移方向，较小的分子比较大的分子重改变时扭转迁移方向，较小的分子比较大的分子重新排列的快，以此达到分离的目的。分辨率达到新排列的快，以此达到分离的目的。分辨率达到10

17、Mb10Mb。大片段大片段DNADNA的分离技术的分离技术脉冲凝胶电泳脉冲凝胶电泳3 Physical mapping3 Physical mapping3.2 3.2 限制酶作图限制酶作图垂直交变电场电泳垂直交变电场电泳 垂直交变电场垂直交变电场(OFAGE)(OFAGE)，有，有2 2对电极，对电极，分别位于凝胶对角线的分别位于凝胶对角线的两端，两端，2 2对电极轮流接对电极轮流接通电场，产生一个交替通电场，产生一个交替的方向不同的电场，的方向不同的电场，DNADNA分子在凝胶中不断分子在凝胶中不断改变迁移方向。交变电改变迁移方向。交变电场电泳主要用于相对分场电泳主要用于相对分子量较大的子

18、量较大的DNADNA分子的分子的分离。分离。3 Physical mapping3 Physical mapping3.2 3.2 限制酶作图限制酶作图基因组学基因组学 杭州师范大学生命与环境科学学院杭州师范大学生命与环境科学学院 向太和向太和大大肠肠杆杆菌菌基基因因组组物物理理图图基因组学基因组学 杭州师范大学生命与环境科学学院杭州师范大学生命与环境科学学院 向太和向太和3 Physical mapping3 Physical mapping限制酶作图限制酶作图DNADNA分子限制性位点的直接检测分子限制性位点的直接检测光学作图光学作图光学作图：光学作图：直接在显微镜下观察检测限制性酶切位点

19、。直接在显微镜下观察检测限制性酶切位点。凝胶拉伸：将染色体凝胶拉伸：将染色体DNADNA悬浮于融化的琼脂糖中，然后滴加到用限制悬浮于融化的琼脂糖中，然后滴加到用限制酶包被的显微载波片上，当凝胶冷却时酶包被的显微载波片上，当凝胶冷却时DNADNA分子呈伸展状态。然后用加分子呈伸展状态。然后用加入氯化镁激活限制酶，切割入氯化镁激活限制酶，切割DNADNA分子，同时加入荧光染料使分子，同时加入荧光染料使DNADNA分子分子染色，延伸的分子中的限制性酶切位点就逐渐形成缺口，可用高分辨率染色，延伸的分子中的限制性酶切位点就逐渐形成缺口，可用高分辨率的荧光显微镜检测到。的荧光显微镜检测到。分子梳理：将硅胶

20、树脂包被的盖玻片浸入分子梳理：将硅胶树脂包被的盖玻片浸入DNADNA溶液中，保留溶液中，保留5 5分钟，分钟，使使DNADNA分子的末端黏附于盖玻片上，然后以分子的末端黏附于盖玻片上，然后以的速度移动玻片，使的速度移动玻片，使DNADNA分子整齐排列在盖玻片表面，然后再加入限制性酶和荧光染料，就可以分子整齐排列在盖玻片表面，然后再加入限制性酶和荧光染料，就可以在荧光显微镜下检测到酶切的缺口。在荧光显微镜下检测到酶切的缺口。耐辐射球菌耐辐射球菌(Deinococcus radiodurans)(Deinococcus radiodurans)基因组基因组NheINheI酶切图酶切图基因组学基因组

21、学 杭州师范大学生命与环境科学学院杭州师范大学生命与环境科学学院 向太和向太和3 Physical mapping3 Physical mapping3.3 3.3 荧光原位杂交荧光原位杂交荧光原位杂交荧光原位杂交（fluorescent fluorescent in situin situ hybridization hybridization，FISHFISH）指在染色体上进行指在染色体上进行DNADNA杂交，以便识别荧光标记探针在染色体杂交，以便识别荧光标记探针在染色体上位置的方法。上位置的方法。基因组学基因组学 杭州师范大学生命与环境科学学院杭州师范大学生命与环境科学学院 向太和向太和

22、 原位杂交的操作原位杂交的操作 染色体分裂细胞染色体分裂细胞 染色体变性染色体变性 检测信号检测信号早期的原位杂交用的标记是放射性标记，但放射性标记很难同早期的原位杂交用的标记是放射性标记，但放射性标记很难同时满足灵敏度和分辨率两个原位杂交的必要条件。时满足灵敏度和分辨率两个原位杂交的必要条件。2020世纪世纪8080年代发展起来的荧光标记解决了这一矛盾。年代发展起来的荧光标记解决了这一矛盾。为了得到高灵敏度，探针的标记量要尽可能大一些，以往的探为了得到高灵敏度，探针的标记量要尽可能大一些，以往的探针至少针至少40kb40kb。现在由于强信号荧光物质的发现和重标记技。现在由于强信号荧光物质的发

23、现和重标记技术的发明，对探针长度的要求已经不那么严格了。术的发明，对探针长度的要求已经不那么严格了。3 Physical mapping3 Physical mapping3.3 3.3 荧光原位杂交荧光原位杂交甲酰胺处理甲酰胺处理加入探针加入探针杂杂交交探探针针非非特特异异位位点点的的封封闭闭基因组学基因组学 杭州师范大学生命与环境科学学院杭州师范大学生命与环境科学学院 向太和向太和如何提高荧光原位杂交的分辨率？如何提高荧光原位杂交的分辨率？原位杂交的分辨率与染色体的制备有关：原位杂交的分辨率与染色体的制备有关：中期染色体分辨率中期染色体分辨率1000kb1000kb，主要用于发现新的分子标

24、记属于，主要用于发现新的分子标记属于哪条染色体；哪条染色体；机械伸展的中期染色体分辨率机械伸展的中期染色体分辨率200300kb200300kb；非中期染色体分辨率可达到非中期染色体分辨率可达到25kb25kb以下。以下。用特殊技术制备的纯化用特殊技术制备的纯化 DNA DNA可以进行纤维可以进行纤维-FISH-FISH，分辨率可，分辨率可达到达到10kb10kb以下。以下。3 Physical mapping3 Physical mapping3.3 3.3 荧光原位杂交荧光原位杂交基因组学基因组学 杭州师范大学生命与环境科学学院杭州师范大学生命与环境科学学院 向太和向太和 3 Physic

25、al mapping3 Physical mapping3.4 3.4 序列标记位点作图序列标记位点作图序列标记位点作图序列标记位点作图大基因组物理图主流构建技术大基因组物理图主流构建技术 限制性酶切作图和限制性酶切作图和FISHFISH的优缺点的优缺点限制性酶切作图快速、简便，能提供详细定位信息，限制性酶切作图快速、简便，能提供详细定位信息，但不能用于大基因组。但不能用于大基因组。FISHFISH可以用于大基因组，但难于操作，数据积累慢，可以用于大基因组，但难于操作，数据积累慢，一次实验定位的标记不超过一次实验定位的标记不超过3-43-4个。个。基因组学基因组学 杭州师范大学生命与环境科学学

26、院杭州师范大学生命与环境科学学院 向太和向太和v序列标记位点序列标记位点（Sequence tagged site,STSSequence tagged site,STS）:指一指一段短的段短的DNADNA序列序列,通常长度在通常长度在100-500bp,100-500bp,易于识别易于识别,在待研究的染色体或基因组中仅存有在待研究的染色体或基因组中仅存有1 1个拷贝。因个拷贝。因此当此当2 2个片段含有同一个片段含有同一STSSTS顺序时，可以确认这两顺序时，可以确认这两个片段彼此重叠。个片段彼此重叠。v序列标记位点作图：序列标记位点作图：通过通过PCRPCR或分子杂交将特定或分子杂交将特定

27、DNADNA顺序定位在基因组染色体区段中。顺序定位在基因组染色体区段中。3 Physical mapping3 Physical mapping3.4 3.4 序列标记位点作图序列标记位点作图基因组学基因组学 杭州师范大学生命与环境科学学院杭州师范大学生命与环境科学学院 向太和向太和STSSTS作图的原理作图的原理v两个两个STSSTS出现在同一片段的机会取决于他们在基因组中的出现在同一片段的机会取决于他们在基因组中的距离，彼此靠的越近，分离的几率越小，彼此相隔越远，距离，彼此靠的越近，分离的几率越小，彼此相隔越远，分离的几率越大。分离的几率越大。v两个两个STSSTS之间相对距离的估算与连锁

28、分析的原理一样，它之间相对距离的估算与连锁分析的原理一样，它们之间的图距根据它们的分离频率来算。们之间的图距根据它们的分离频率来算。3 Physical mapping3 Physical mapping3.4 3.4 序列标记位点作图序列标记位点作图3 Physical mapping3 Physical mapping3.4 3.4 序列标记位点作图序列标记位点作图STSSTS作图原理图示作图原理图示(1)(1)STSSTS作图原理图示作图原理图示(2)(2)3 Physical mapping3 Physical mapping3.4 3.4 序列标记位点作图序列标记位点作图基因组学基因

29、组学 杭州师范大学生命与环境科学学院杭州师范大学生命与环境科学学院 向太和向太和 STSSTS需要具备的两个条件需要具备的两个条件：1 1）在染色体上的位置独一无二；）在染色体上的位置独一无二；2 2）序列已知，方便）序列已知，方便PCRPCR检测。检测。寻找寻找STSSTS的方法：的方法：1 1）表达序列标签（）表达序列标签（expressed sequence tag,ETS)expressed sequence tag,ETS)：来源于来源于cDNAcDNA克隆的小段序列。克隆的小段序列。ESTEST来自单拷贝的基因时可作为来自单拷贝的基因时可作为STSSTS；2 2）SSLP SSLP

30、 具有多态性且通过连锁分析进行定位的具有多态性且通过连锁分析进行定位的SSLPSSLP很有价值，很有价值，可以建立遗传图与物理图之间的联系；可以建立遗传图与物理图之间的联系；3 3）随机基因组顺序。可通过对克隆的基因组）随机基因组顺序。可通过对克隆的基因组DNADNA随机测序获随机测序获得，或者从数据库中寻找。得，或者从数据库中寻找。基因组学基因组学 杭州师范大学生命与环境科学学院杭州师范大学生命与环境科学学院 向太和向太和 STS STS作图的作图的DNADNA片段群片段群v作图试剂作图试剂（mapping reagent)mapping reagent)：STSSTS作图过程中用作图过程中

31、用到的可覆盖待研究的染色体或基因组的到的可覆盖待研究的染色体或基因组的DNADNA片段群。片段群。v如何获得作图试剂？如何获得作图试剂？1 1）放射杂交）放射杂交 2 2）克隆文库）克隆文库基因组学基因组学 杭州师范大学生命与环境科学学院杭州师范大学生命与环境科学学院 向太和向太和3 Physical mapping3 Physical mapping3.4 3.4 序列标记位点作图序列标记位点作图1 1）放射杂交）放射杂交辐射杂种辐射杂种（radiation hybrid)radiation hybrid)：含有其他生物染色：含有其他生物染色体片段的啮齿类动物细胞。体片段的啮齿类动物细胞。辐

32、射杂种群辐射杂种群（radiation hybrid panel)radiation hybrid panel)：通过放射：通过放射杂交产生的融合细胞群称为辐射杂种群。杂交产生的融合细胞群称为辐射杂种群。辐射杂种群分为两类：辐射杂种群分为两类：全基因组辐射杂种群全基因组辐射杂种群单染色体辐射杂种群单染色体辐射杂种群染色体染色体片段化染色体片段化染色体辐射杂种辐射杂种X X射射线线照照射射细细胞胞融融合合基因组学基因组学 杭州师范大学生命与环境科学学院杭州师范大学生命与环境科学学院 向太和向太和全基因组辐射杂种的筛选全基因组辐射杂种的筛选 使用不能产生胸腺激酶（使用不能产生胸腺激酶（TK)TK)

33、或者次黄嘌呤磷酸转或者次黄嘌呤磷酸转移酶（移酶（HPRT)HPRT)的仓鼠细胞系作受体。这种细胞在添的仓鼠细胞系作受体。这种细胞在添加了次黄嘌呤、氨基喋呤和胸苷的培养基（加了次黄嘌呤、氨基喋呤和胸苷的培养基（HATHAT）中不能存活。只有获得人体中不能存活。只有获得人体DNADNA中中TKTK和和HPRTHPRT基因基因的仓鼠细胞才能在的仓鼠细胞才能在HATHAT选择性培养基中生长。选择性培养基中生长。辐辐 射射 杂杂 种种 作作 图图基因组学基因组学 杭州师范大学生命与环境科学学院杭州师范大学生命与环境科学学院 向太和向太和单染色体辐射杂种群单染色体辐射杂种群3 Physical mappi

34、ng3 Physical mapping3.4 3.4 序列标记位点作图序列标记位点作图构建：用构建：用x x射线照射另外一类含一条人染色体射线照射另外一类含一条人染色体的啮齿类（如小鼠）细胞系，再将这种细胞与的啮齿类（如小鼠）细胞系，再将这种细胞与仓鼠细胞融合。仓鼠细胞融合。筛选：用人类基因组广泛分布的重复序列如筛选：用人类基因组广泛分布的重复序列如AluAlu（一类（一类SINE)SINE)做探针，筛选只含有人染色体做探针，筛选只含有人染色体片段的杂种细胞。片段的杂种细胞。基因组学基因组学 杭州师范大学生命与环境科学学院杭州师范大学生命与环境科学学院 向太和向太和辐射杂种群用于作图试剂的条

35、件辐射杂种群用于作图试剂的条件 3 Physical mapping3 Physical mapping3.4 3.4 序列标记位点作图序列标记位点作图使用使用PCRPCR方法鉴定方法鉴定STSSTS时，不会从仓鼠基时，不会从仓鼠基因组或者小鼠基因组扩增出相应的片段。因组或者小鼠基因组扩增出相应的片段。辐射杂种作图的单位辐射杂种作图的单位厘镭厘镭（centiRay,cM)centiRay,cM)：DNADNA分子暴露在分子暴露在NN拉德拉德x x射线剂量下，两个分子标记之间发生射线剂量下，两个分子标记之间发生1%1%段裂段裂的频率。的频率。人类人类2121号染色体辐射杂种图号染色体辐射杂种图一

36、段人类染色体一段人类染色体DNADNA的辐射杂种图的辐射杂种图人人类类基基因因组组辐辐射射杂杂种种图图距距染色体染色体 物理长度（物理长度（MbMb）cM/cR kb/cR cM/cR kb/cR 平均平均滯滯留率（范围）留率（范围）1 263 0.20 197 21.1(14.3-50.6)1 263 0.20 197 21.1(14.3-50.6)2 255 0.21 225 23.8(14.3-37.5)2 255 0.21 225 23.8(14.3-37.5)3 214 0.27 233 26.9(14.3-41.1)3 214 0.27 233 26.9(14.3-41.1)4 2

37、03 0.28 256 24.3(11.3-44.0)4 203 0.28 256 24.3(11.3-44.0)5 194 0.29 272 26.9(17.3-49.4)5 194 0.29 272 26.9(17.3-49.4)6 183 0.24 243 30.6(21.4-49.4)6 183 0.24 243 30.6(21.4-49.4)7 171 0.23 229 27.7(19.0-44.6)7 171 0.23 229 27.7(19.0-44.6)8 155 0.26 271 31.0(31.0-45.8)8 155 0.26 271 31.0(31.0-45.8)9 1

38、45 0.38 305 22.1(14.3-27.4)9 145 0.38 305 22.1(14.3-27.4)10 144 0.26 253 28.5(16.2-56.3)10 144 0.26 253 28.5(16.2-56.3)11 144 0.30 270 25.7(20.2-38.7)11 144 0.30 270 25.7(20.2-38.7)12 143 0.21 234 32.1(23.2-50.6)12 143 0.21 234 32.1(23.2-50.6)13q 98 0.22 179 22.9(16.7-36.3)13q 98 0.22 179 22.9(16.7-

39、36.3)14q 93 0.34 208 32.0(21.1-57.1)14q 93 0.34 208 32.0(21.1-57.1)15q 89 0.36 203 31.7(24.4-45.2)15q 89 0.36 203 31.7(24.4-45.2)16 98 0.43 201 30.5(21.6-39.9)16 98 0.43 201 30.5(21.6-39.9)17 92 0.23 147 61.6(33.9-93.5)17 92 0.23 147 61.6(33.9-93.5)18 85 0.30 172 34.3(20.7-43.5)18 85 0.30 172 34.3(2

40、0.7-43.5)19 67 0.20 110 32.2(21.4-45.8)19 67 0.20 110 32.2(21.4-45.8)20 72 0.30 191 31.0(16.1-41.1)20 72 0.30 191 31.0(16.1-41.1)21q 39 0.31 151 50.1(39.3-71.3)21q 39 0.31 151 50.1(39.3-71.3)22q 43 0.95 185 36.6(30.4-50.6)22q 43 0.95 185 36.6(30.4-50.6)X 164 0.31 231 18.4(11.9-30.4)X 164 0.31 231 18

41、.4(11.9-30.4)基因组基因组 )基因组学基因组学 杭州师范大学生命与环境科学学院杭州师范大学生命与环境科学学院 向太和向太和 2 2）克隆文库）克隆文库克隆文库克隆文库：将基因组或分离的染色体断裂成片段，：将基因组或分离的染色体断裂成片段，克隆到高容量载体中所产生的克隆到高容量载体中所产生的DNADNA片段的集合。片段的集合。克隆文库克隆文库STSSTS作图的优势作图的优势：单独的克隆就可以提供测序的单独的克隆就可以提供测序的DNADNA，来自，来自STSSTS分析的分析的数据可用来构建物理图谱，也可以确定含有重叠数据可用来构建物理图谱，也可以确定含有重叠DNADNA片段的克隆，这就

42、可以帮助我们建立克隆重叠群。片段的克隆，这就可以帮助我们建立克隆重叠群。3 Physical mapping3 Physical mapping3.4 3.4 序列标记位点作图序列标记位点作图基因组学基因组学 杭州师范大学生命与环境科学学院杭州师范大学生命与环境科学学院 向太和向太和绘制物理图的克隆文库绘制物理图的克隆文库v全基因组全基因组DNADNA文库文库v单一染色体单一染色体DNADNA文库文库3 Physical mapping3 Physical mapping3.4 3.4 序列标记位点作图序列标记位点作图流流式式细细胞胞计计数数仪仪工工作作原原理理基因组学基因组学 杭州师范大学生

43、命与环境科学学院杭州师范大学生命与环境科学学院 向太和向太和 YACYAC载体载体:YAC(Yeast artificial chromosome)YAC(Yeast artificial chromosome)即酵母人工染即酵母人工染色体，具有酵母染色体的特性，以酵母细胞为宿主，能在色体，具有酵母染色体的特性，以酵母细胞为宿主，能在酵母细胞中复制。以酵母细胞中复制。以YACYAC为载体，可以乘载的大片段为载体，可以乘载的大片段DNADNA，是物理作图中最早利用的大片段，是物理作图中最早利用的大片段DNADNA载体。载体。优点优点:容量大容量大,插入片段可达插入片段可达1400 kb.1400

44、 kb.缺点缺点:转化效率低；转化效率低；插入子稳定性差；插入子稳定性差；嵌合克隆比例高嵌合克隆比例高,达达48%48%；插入插入DNADNA的制备相当困难。的制备相当困难。3 Physical mapping3 Physical mapping克隆作图克隆作图构建图谱的载体与方法构建图谱的载体与方法克隆作图：根据克隆的克隆作图：根据克隆的DNADNA片段之间的重叠顺序构建片段之间的重叠顺序构建重叠群重叠群(Contig),(Contig),绘制物理连锁图。绘制物理连锁图。酵酵母母人人工工染染色色体体(YAC(YAC)基因组学基因组学 杭州师范大学生命与环境科学学院杭州师范大学生命与环境科学学

45、院 向太和向太和BACBAC载体载体:BAC(Bacterial artificial chromosome)BAC(Bacterial artificial chromosome)即细菌人工染色体，即细菌人工染色体，具有细菌染色体的特性，以细菌细胞为宿主，能在细菌具有细菌染色体的特性，以细菌细胞为宿主，能在细菌细胞中复制。以细胞中复制。以BACBAC为载体，可以乘载约为载体，可以乘载约300kb300kb的大片的大片段段DNADNA，是物理作图中目前用得最多的大片段是物理作图中目前用得最多的大片段DNADNA载体。载体。优点：优点：单拷贝复制，不会因重组发生嵌合；单拷贝复制，不会因重组发生嵌

46、合；插入插入DNADNA的的 提取简单，便于机械化操作。提取简单，便于机械化操作。细细菌菌人人工工染染色色体体（BACBAC）基因组学基因组学 杭州师范大学生命与环境科学学院杭州师范大学生命与环境科学学院 向太和向太和PACPAC载体：载体：PACPAC（P1-derivedartificialchromosome)P1P1-derivedartificialchromosome)P1人工染色体人工染色体插入的外源插入的外源DNADNA没有明显的嵌合和缺失象；没有明显的嵌合和缺失象；可以插入约可以插入约300kb300kb的外源片段；的外源片段；可以稳定遗传及高效扩增。可以稳定遗传及高效扩增。

47、PACPAC除具有许多除具有许多BACBAC载体的特征外载体的特征外,它的多克隆位点位于它的多克隆位点位于蔗糖诱导型致死基因蔗糖诱导型致死基因sacBsacB上上,通过加入蔗糖和抗生素的培通过加入蔗糖和抗生素的培养基筛选出来的克隆都是含有插入片段的重组子。但是养基筛选出来的克隆都是含有插入片段的重组子。但是,PAC,PAC载体自身片段较大载体自身片段较大(约约16kb),16kb),构建文库没有构建文库没有BACBAC载载体体(约约7 78kb)8kb)效率高。效率高。PACPAC载载体体基因组学基因组学 杭州师范大学生命与环境科学学院杭州师范大学生命与环境科学学院 向太和向太和v染色体步移法

48、（染色体步移法（chromosomal walking)chromosomal walking)v 指纹法指纹法(clone fingerprinting)(clone fingerprinting)3 Physical mapping3 Physical mapping克隆作图克隆作图克隆重叠群的组建克隆重叠群的组建基因组学基因组学 杭州师范大学生命与环境科学学院杭州师范大学生命与环境科学学院 向太和向太和染色体步移法染色体步移法 v先从基因文库的一个克隆开始，然后从文库中寻找与之重先从基因文库的一个克隆开始，然后从文库中寻找与之重叠的第二个克隆，再继续确定第三个克隆，依次类推。叠的第二个克

49、隆，再继续确定第三个克隆，依次类推。v这是最早发明的拼接克隆重叠群的方法。这是最早发明的拼接克隆重叠群的方法。v如果探针含有基因组范围分布的重复序列，会有非特异杂如果探针含有基因组范围分布的重复序列，会有非特异杂交，这时需要预杂交，封闭非特异位点。交，这时需要预杂交，封闭非特异位点。v以插入片段末端为探针，减少重复序列出现的可能性。以插入片段末端为探针，减少重复序列出现的可能性。v如果探针序列已知，可以通过如果探针序列已知，可以通过PCRPCR筛选。筛选。v染色体步移的缺点是速度缓慢，只适合小基因组或小区段染色体步移的缺点是速度缓慢，只适合小基因组或小区段染色体物理图绘制。染色体物理图绘制。染

50、染色色体体步步移移用探针进行染色体步查用探针进行染色体步查用用PCRPCR进行染色体步查进行染色体步查基因组学基因组学 杭州师范大学生命与环境科学学院杭州师范大学生命与环境科学学院 向太和向太和v克隆指纹法的原理：如果克隆指纹法的原理：如果2 2个克隆彼此重叠，它个克隆彼此重叠，它们一定含有相同的顺序。们一定含有相同的顺序。v基因组范围内查找重叠克隆的最好方法首推克基因组范围内查找重叠克隆的最好方法首推克隆指纹排序。隆指纹排序。v指纹指纹：指确定：指确定DNADNA样品所具有的特定样品所具有的特定DNADNA片段片段组成，一个克隆的指纹表示了该克隆所具有的组成，一个克隆的指纹表示了该克隆所具有