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1、单向免疫扩散试验单向免疫扩散试验沉淀反应(沉淀反应(precipetaiton)是可溶性抗原与)是可溶性抗原与相应抗体特异性结合所出现的反应。相应抗体特异性结合所出现的反应。1905 凝胶内沉淀试验凝胶内沉淀试验 1946 试管免疫扩散技术试管免疫扩散技术 1965 单向免疫扩散技术单向免疫扩散技术 1967 散射比浊法散射比浊法在琼脂胶中混入一定量抗体,使待测的抗在琼脂胶中混入一定量抗体,使待测的抗原溶液从局部向琼脂内自由扩散,在抗原原溶液从局部向琼脂内自由扩散,在抗原抗体比例合适区域内形成可见的沉淀环。抗体比例合适区域内形成可见的沉淀环。(抗原抗体反应时,只有其中一种成分发生抗原抗体反应时
2、,只有其中一种成分发生扩散)扩散)根据试验形式可分为试管法和平板法两种。根据试验形式可分为试管法和平板法两种。测量沉淀环的直径或计算环的面积。沉淀测量沉淀环的直径或计算环的面积。沉淀环直径或面积的大小与抗原量相关,但不环直径或面积的大小与抗原量相关,但不是直线相关,而是对数关系。同时,这种是直线相关,而是对数关系。同时,这种沉淀环与分子量和扩散时间有关。沉淀环与分子量和扩散时间有关。试剂与器材试剂与器材1.羊抗人羊抗人IgG诊断血清诊断血清2.人人IgG标准液(标准液(30g/L)3.待测人血清待测人血清4.琼脂粉琼脂粉5.生理盐水生理盐水6.载玻片载玻片(玻璃板)、三角烧瓶、吸管、加样玻璃板
3、)、三角烧瓶、吸管、加样器、打孔器、水浴箱、湿盒、直尺等器、打孔器、水浴箱、湿盒、直尺等操作方法操作方法1.制备琼脂凝胶制备琼脂凝胶 (1)生理盐水配制琼脂凝胶()生理盐水配制琼脂凝胶(15g/L),煮沸),煮沸溶化至澄清,置溶化至澄清,置56水浴中备用。水浴中备用。(2)取适量溶化琼脂,以琼脂)取适量溶化琼脂,以琼脂 抗体抗体4 1比比例吸取相应抗体,与琼脂充分混合,置例吸取相应抗体,与琼脂充分混合,置56水水浴中备用。浴中备用。2.制板制板 (1)取洁净干燥玻片,置于水平台上)取洁净干燥玻片,置于水平台上 (2)用吸管吸取)用吸管吸取4ml琼脂(含抗体),于琼脂(含抗体),于载玻片载玻片1
4、/3处浇注,使琼脂凝胶均匀铺满玻处浇注,使琼脂凝胶均匀铺满玻片,不要留有气泡。片,不要留有气泡。3.打孔打孔 待琼脂凝固后,用直径待琼脂凝固后,用直径3mm的打的打孔器打孔,孔距孔器打孔,孔距1012mm4.加样加样 用微量加样器吸取待检血清用微量加样器吸取待检血清10l,加入相应加入相应的试验孔中,做好标记。的试验孔中,做好标记。将人将人IgG标准液(标准液(30g/L)用生理盐水分别)用生理盐水分别做如下稀释:原倍做如下稀释:原倍,1:2,1:5,1:10,1:20,1:30,用微量加样器吸取稀释标准液用微量加样器吸取稀释标准液10l,加入相应的试验孔中,做好标记。加入相应的试验孔中,做好
5、标记。5.扩散扩散 将加样的琼脂凝胶板平放于湿盒内,置将加样的琼脂凝胶板平放于湿盒内,置3724h后观察结果。后观察结果。结果判断结果判断 精确测量各试验孔沉淀环的直径,以沉淀精确测量各试验孔沉淀环的直径,以沉淀环直径为横坐标,相应孔中环直径为横坐标,相应孔中IgG含量的对数含量的对数为纵坐标,绘制标准曲线。为纵坐标,绘制标准曲线。(logC/d=K)注意事项注意事项1.玻片须干燥、洁净,边缘无破损。置水平玻片须干燥、洁净,边缘无破损。置水平处。处。2.浇制琼脂板时动作要匀速浇制琼脂板时动作要匀速3.打孔时避免水平移动打孔时避免水平移动4.加样时避免气泡或加至孔外,加样要准确加样时避免气泡或加至孔外,加样要准确5.应同步绘制标准曲线应同步绘制标准曲线6.抗血清与溶化琼脂混合时,温度应控制在抗血清与溶化琼脂混合时,温度应控制在56