《培养基的灭菌》PPT课件.ppt

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1、第五章第五章 培养基及设备的灭菌培养基及设备的灭菌第一节 培养基灭菌的目的、要求 和方法第二节 湿热灭菌的理论基础 第三节 培养基灭菌的工程设计 培养基培养基灭菌的要求和方法菌的要求和方法 1 1，培养基，培养基灭菌的定菌的定义是指从培养基中是指从培养基中杀灭有生活能力的有生活能力的细菌菌营养体及其养体及其孢子，子，或从中将其除去。工或从中将其除去。工业规模的液体培养基模的液体培养基灭菌，菌，杀灭杂菌比除去菌比除去杂菌更菌更为常用。常用。2 2，灭菌与消毒的区菌与消毒的区别 灭菌：用物理或化学方法菌：用物理或化学方法杀死或除去死或除去环境中所有微境中所有微生物，包括生物，包括营养养细胞、胞、细

2、菌芽菌芽孢和和孢子子 消毒：用物理或化学方法消毒：用物理或化学方法杀死物料、容器、器皿内死物料、容器、器皿内外的病源微生物。外的病源微生物。在在发酵酵过程中程中夹杂其它其它杂菌造成的后果：菌造成的后果：l生生产菌和菌和杂菌同菌同时生生长，生，生产菌菌丧失生失生产能力；能力；l在在连续发酵酵过程中，程中，杂菌的生菌的生长速度有速度有时会比生会比生产菌生菌生长得更快，得更快，结果使果使发酵罐中以酵罐中以杂菌菌为主；主；l杂菌及其菌及其产生的物生的物质，使提取精制，使提取精制发生困生困难l杂菌会降解目的菌会降解目的产物；物；l杂菌会菌会污染最染最终产品，品，杂菌会菌会污染最染最终产品；品；l发酵酵时

3、如如污染噬菌体，可使生染噬菌体，可使生产菌菌发生溶菌生溶菌现象。象。培养基培养基灭菌的要求和方法菌的要求和方法 培养基培养基灭菌的目的、要求和方法菌的目的、要求和方法 工业上具体措施 1）使用的培养基和设备须经灭菌；2）好氧培养中使用的空气应经除菌处理；3）设备应严密，发酵罐维持正压环境；4）培养过程中加入的物料应经过灭菌；5）使用无污染的纯粹种子。培养基培养基灭菌的目的、要求和方法菌的目的、要求和方法 培养基灭菌的要求l达到要求的无菌程度（10-3）l尽量减少营养成分的破坏，在灭菌过程中，培养基组分的破坏，是由两个基本类型的反应引起的：u培养基中不同营养成分间的相互作用；u对热不稳定的组分如

4、氨基酸和维生素等的分解。主要灭菌方法灭菌的方法化学法化学药品灭菌法物理法干热灭菌法热灭菌法射线灭菌法主要灭菌方法干热灭菌法干热灭菌法：将金属制品或清洁玻璃器皿放入电热烘箱内，在150170下维持12 h后，即可达到彻底灭菌的目的。在这种条件下，可使细胞膜破坏、蛋白质变性、原生质干燥，以及各种细胞成分发生氧化。灼烧灼烧：是一种最彻底的干热灭菌方法，但它只能用于接种环、接种针等少数对象的灭菌。主要灭菌方法湿热灭菌法，湿热灭菌法，多数细菌和真菌的营养细胞在60左右处理510min后即可杀死；酵母菌和真菌的孢子用80以上的温度处理才能杀死；而细菌的芽孢一般要在120下处理15min才能杀死。巴氏消毒法

5、（巴氏消毒法（pasteurizationpasteurization）：目的是杀死其中无芽孢的病原菌（如牛奶中的结核杆菌或沙门氏菌），而又不影响它们的风味。巴氏消毒法是一种低温消毒法.主要灭菌方法低温维持法：低温维持法：在63下保持30分钟可进行牛奶消毒；间歇灭菌法间歇灭菌法：适用于不耐热培养基的灭菌。待灭菌的培养基在80100下蒸煮1560分钟，以杀死所有营养细胞，然后置室温或37下保温过夜，诱导残留的芽孢发芽，再以同法蒸煮和保温过夜，如此连续重复3天，即可在较低温度下达到彻底灭菌的效果。主要灭菌方法常规加压灭菌法：常规加压灭菌法：盛有适量水的加压蒸汽灭菌锅加热煮沸，彻底驱尽后将锅密闭，再

6、继续加热至121（压力为1kgcm2或15磅英寸2），时间维持1520分钟，也可采用在较低的温度（115，即cm2或10磅英寸2）下维持35分钟的方法。适合于一切微生物学实验室、医疗保健机构或发酵工厂中对培养基及多种器材、物料的灭菌。连续加压灭菌法：连续加压灭菌法：在发酵行业里也称“连消法”。此法只在大规模的发酵工厂中作培养基灭菌用。将培养基在发酵罐外连续不断地进行加热、维持和冷却，然后才进入发酵罐。培养基一般在135140下处理515秒钟。主要灭菌方法高温对培养基成分的影响：高温对培养基成分的影响：主要灭菌方法消除高温有害影响的措施消除高温有害影响的措施l采用特殊加热灭菌法；l含易破坏成分的

7、培养基应与其他成分分别灭菌后再合并，或者进行低压灭菌；l对含Ca2+或Fe3+的培养基与磷酸盐先分别灭菌，再混合，避免产生磷酸盐沉淀。主要灭菌方法湿热灭菌的原理 每一种微生物都有一定的最适生长温度范围。当微生物处于最低温度以下时，代谢作用几乎停止而处于休眠状态。当温度超过最高限度时，微生物细胞中的原生质胶体和酶起了不可逆的凝固变性，使微生物在很短时间内死亡，加热灭菌即是根据微生物这一特性而进行的。主要灭菌方法湿热灭菌相关定义杀死微生物的极限温度称为致死温度致死温度。在致死温度下，杀死全部微生物所需的时间称为致死致死时间；在致死温度以上，温度愈高，致死时间愈短。微生物的微生物的热阻阻：是指微生物

8、在某一特定条件（主要是温度和加热方式）下的致死时间。相相对热阻阻是指某一微生物在某条件下的致死时间与另一微生物在相同条件下的致死时间的比值。主要灭菌方法各种微生物各种微生物对湿湿热的相的相对热阻阻微生物相对热阻营养细胞和酵母1.0细菌芽孢3106霉菌孢子210病毒和噬菌体15主要灭菌方法培养基成分对灭菌的影响油脂，糖类及一定浓度的蛋白质可增加微生物的耐热性，另一些物质，如高浓度的盐类，色素等可削弱其耐热性。培养基的物理状态对灭菌的影响培养基中微生物数量对灭菌的影响培养基中氢离子浓度对灭菌的影响培养基中氢离子浓度直接影响灭菌的效果。培养基的 酸碱度越大，所需杀灭微生物的温度越低。主要灭菌方法微生

9、物细胞中水分对灭菌的影响细胞含水越多，蛋白质变性的温度越底微生物细胞菌龄对灭菌的影响老细胞水分含量低、低龄细胞水分含量高空气排除情况对灭菌的影响搅拌对灭菌的影响泡沫对灭菌的影响主要灭菌方法湿热灭菌的优点蒸汽来源容易，操作费用低，本身无毒；蒸汽有强的穿透力，灭菌易于彻底；蒸汽有很大的潜热；操作方便，易管理。湿热灭菌的理论基础培养基湿热灭菌需解决的工程问题将培养基中的杂菌总数N0杀灭到可以接受的总数N（10-3），需要多高的温度、多长的时间为合理。灭菌温度和时间的确定取决于：杂菌孢子的热灭死动力学反应器的形式和操作方式培养基中有效成分受热破坏的可接受范围第二节 湿热灭菌的理论基础 二、微生物的热死

10、灭动力学方程实验证明，微生物营养细胞的均相热死灭动力学符合化学反应的一级反应动力学，即：N：任一时刻的活细菌浓度（个/L）t：时间（min）K：比热死速率常数（min-1）第二节 湿热灭菌的理论基础 取边界条件t0=0，N=N0，对（1）积分得 （2）或 （3）第二节 湿热灭菌的理论基础 细菌孢子的热杀灭动力学与营养细胞的有所不同。它表现为非对数的死亡动力学。这可能与孢子壁的化学成分及结构有关。但当温度超过120C时，热阻极强的嗜热脂肪芽孢杆菌孢子的热杀灭动力学也接近对数死亡动力学即符合一级反应规律。第二节 湿热灭菌的理论基础 三、温度对K的影响微生物的热死灭动力学接近一级反应动力学它的比热死

11、灭速率常数K与灭菌温度T的关系可用阿累尼乌斯方程表征 A：频率因子（min-1）E：活化能（J/mol）R：通用气体常数J/（）第二节 湿热灭菌的理论基础 l活化能E的大小对K值有重大影响。其它条件相同时，E越高，K越低，热死速率越慢。l不同菌的孢子的热死灭反应E可能各不相同。第二节 湿热灭菌的理论基础 1/TK（min-1）第二节 湿热灭菌的理论基础 反应的反应的E越高，越高，lnK对对T的的变化率越大，即变化率越大，即T的变化对的变化对K的影响越大的影响越大细菌孢子热死灭反应的细菌孢子热死灭反应的E很高，而某些有效成分热破坏反应的很高，而某些有效成分热破坏反应的E较较低。低。将温度提高到一

12、定程度，会加速细菌孢子的死灭速度，缩短灭菌时将温度提高到一定程度，会加速细菌孢子的死灭速度，缩短灭菌时间，由于有效成分的间，由于有效成分的E很低，温度的提高也会增大其破坏速度，但很低，温度的提高也会增大其破坏速度，但幅度较小。由于灭菌时间的显著缩短，有效成分的破坏反而减少幅度较小。由于灭菌时间的显著缩短，有效成分的破坏反而减少受热物质E（J/mol）维生素B1296232维生素B1盐酸盐92048嗜热脂肪芽孢杆菌孢子283257肉毒梭菌孢子343088枯草杆菌孢子317984第二节 湿热灭菌的理论基础 温度上升，灭菌速率常数增加的倍数大于培养基成分破温度上升，灭菌速率常数增加的倍数大于培养基成

13、分破坏的速率常数倍数。坏的速率常数倍数。将温度提高到一定程度，会加速细菌孢子的死灭速度，缩短灭菌时间，由于有效成分的E很低，温度的提高只能稍微增大其破坏速度，但由于灭菌时间的显著缩短，有效成分的破坏反而减少.因此，培养基灭菌宜采用“高温短时间高温短时间”灭菌。第二节 湿热灭菌的理论基础 1/T lnK第二节 湿热灭菌的理论基础 灭菌时温度从T1 T2时：第二节 湿热灭菌的理论基础 杀灭细菌芽孢的活化能 E 大于维生素等营养物质破坏的活化能 E(即E E)第二节 湿热灭菌的理论基础 EBS=67000 4.184（J/mol）EVB=22000 4.184（J/mol）将灭菌温度从105C提高到

14、127 CKVB从（min-1）提高到（min-1）KBS从（min-1）提高到（min-1）嗜热脂肪芽孢杆菌孢子和嗜热脂肪芽孢杆菌孢子和维生素维生素B B1 1的的lnK-1/TlnK-1/T图图第二节 湿热灭菌的理论基础 嗜热脂肪芽孢杆菌孢子死灭程度为N/N0=10-16时，灭菌温度对维生素B1破坏的影响灭菌温度（C）达到灭菌程度的时间（min）维生素B1的损失（%）10084399.9911075891207.6271300.851101400.10731500.0151第二节 湿热灭菌的理论基础 第二节 湿热灭菌的理论基础 杀菌锅内灭菌杀菌锅内灭菌 培养基及物品灭菌所需压强培养基及物品

15、灭菌所需压强0,098MPa,固体培养基维持固体培养基维持20-30min，液体培养基维持，液体培养基维持15-20min，玻璃器皿及用具维持，玻璃器皿及用具维持30-60min。种子罐、发醉罐、计量罐、补料镶等的空罐灭菌及管道灭菌种子罐、发醉罐、计量罐、补料镶等的空罐灭菌及管道灭菌 通入蒸汽，使罐内蒸汽压强达通入蒸汽，使罐内蒸汽压强达0.147MPa，维持，维持45min。灭菌。灭菌过程中从阀门、边阀排出空气，并使蒸汽达到所有死角。灭过程中从阀门、边阀排出空气，并使蒸汽达到所有死角。灭菌完毕，关闭蒸汽后，待罐内压力低于空气过滤器压力时，菌完毕，关闭蒸汽后，待罐内压力低于空气过滤器压力时，通人

16、无菌空气保持罐压通人无菌空气保持罐压0,098MPal 空气空气总过滤器和分过滤器灭菌总过滤器和分过滤器灭菌 从过滤器上部通入蒸汽，并从上、下排气口排气，维持压从过滤器上部通入蒸汽，并从上、下排气口排气，维持压强强0.174MPa，灭菌完毕，通入压缩空气吹干。，灭菌完毕，通入压缩空气吹干。l 种子种子培养基实罐灭菌培养基实罐灭菌 从夹层通人燕汽间接加热至从夹层通人燕汽间接加热至80，再从取样管、进风管、，再从取样管、进风管、接种管通人蒸汽直接加热同时关闭夹层蒸汽进口阀门，升接种管通人蒸汽直接加热同时关闭夹层蒸汽进口阀门，升温到温到121 ，维待，维待30min，谷氨酸发酵的种子培养基实罐，谷氨

17、酸发酵的种子培养基实罐灭菌为灭菌为110,维持维持l0minl 发酵培养基发酵培养基实罐灭菌实罐灭菌 从夹层或盘管进人蒸汽，间接加热至从夹层或盘管进人蒸汽，间接加热至90 ,关闭夹层蒸汽，关闭夹层蒸汽，从取样管、进风管、放料管三路进蒸汽，直接加热至从取样管、进风管、放料管三路进蒸汽，直接加热至121，维持，维持10min.谷氨酸发酵培养基实罐灭菌为谷氨酸发酵培养基实罐灭菌为105 ，维持维持25min。第二节 湿热灭菌的理论基础 n 发酵培养基酵培养基连续灭菌菌一般培养基一般培养基为130,维持持5min。谷氨酸。谷氨酸发酵培养基酵培养基为115,维持持6-8min。发酵罐需在培养基酵罐需在培

18、养基灭菌之前直接用蒸汽菌之前直接用蒸汽进行行空罐空罐灭菌。空消之后不能立即冷却，先用无菌空气保菌。空消之后不能立即冷却，先用无菌空气保压，待待灭菌的培养基菌的培养基输人罐内后，才可以开冷却系人罐内后，才可以开冷却系统进行冷却。行冷却。n 油罐油罐(消泡消泡剂罐罐)灭菌菌一般条件一般条件为0.15-0.18MPa维持持60min。n 补料料实罐罐灭菌菌视物料性物料性质而定，如糖水而定，如糖水为0.1MPa(120)，保温，保温30min;淀淀粉料液粉料液为121维持持5min。n 尿素溶液尿素溶液灭菌菌常用常用灭菌条件菌条件为105,维持持5min。第二节 湿热灭菌的理论基础 第三第三节 培养基

19、培养基灭菌的工程菌的工程设计 一、无菌的一、无菌的标准准 根据微生物根据微生物热死死灭方程，要求方程，要求灭菌后达到菌后达到绝对无菌是很无菌是很难做到的，也是不必要的。因此在工程做到的，也是不必要的。因此在工程设计中常取中常取N=10N=10-3-3二、分批二、分批灭菌菌1，分批，分批灭菌的菌的设计 在在发酵罐中酵罐中进行行实罐罐灭菌，是典型的分批菌，是典型的分批灭菌。全菌。全过程包括升温、保温、降温三个程包括升温、保温、降温三个过程程第三第三节 培养基培养基灭菌的工程菌的工程设计 孢子热死亡的规律符合第三节第三节 培养基灭菌的工程设计培养基灭菌的工程设计 二、分批灭菌二、分批灭菌因为升温、冷

20、却阶段T是时间t的函数，K不是常数，所以：式中Kh是保温阶段的孢子比热死亡速度常数第三节第三节 培养基灭菌的工程设计培养基灭菌的工程设计 二、分批灭菌二、分批灭菌分批灭菌中几种换热方式的温度-时间变化关系T：介质温度（K）；T0：介质初温（K）；t：时间（min）；h：蒸汽相对于介质的热焓（kJ/kg）；s：蒸汽的重量流率（kg/min）M：介质重量(kg)；Cp：介质比热kJ/(kg.K)；TH：热源温度(K)U：总传热系数kJ/（）；q：传热速率（kJ/min）Cp：冷却剂比热；W：冷却剂流率；TCO：冷却剂温度二、分批灭菌二、分批灭菌第三节第三节 培养基灭菌的工程设计培养基灭菌的工程设计

21、 培养基间歇灭菌过程中应注意的问题温度和压力的关系泡沫问题投料过程中，麸皮和豆饼粉等固形物在罐壁上残留的问题灭菌结束后应立即引入无菌空气保压二、分批灭菌二、分批灭菌第三节第三节 培养基灭菌的工程设计培养基灭菌的工程设计 三、连续灭菌的设计第三节第三节 培养基灭菌的工程设计培养基灭菌的工程设计 三、连续灭菌的设计第三节第三节 培养基灭菌的工程设计培养基灭菌的工程设计 连续灭菌流程图连续灭菌流程图第三节第三节 培养基灭菌的工程设计培养基灭菌的工程设计 连续灭菌主要设备套管式连消塔第三节第三节 培养基灭菌的工程设计培养基灭菌的工程设计 喷嘴式连消塔连续灭菌主要设备第三节第三节 培养基灭菌的工程设计培

22、养基灭菌的工程设计 喷射加热器连续灭菌主要设备第三节第三节 培养基灭菌的工程设计培养基灭菌的工程设计 薄板换热器第三节第三节 培养基灭菌的工程设计培养基灭菌的工程设计 维持罐喷淋冷却器连续灭菌主要设备第三节第三节 培养基灭菌的工程设计培养基灭菌的工程设计 培养基的灭菌如果是采用连续灭菌法。则发酵罐应在加入灭菌的培养基前先行单独灭菌。通常是用蒸汽加热发酵罐的夹套或设管并从空气分布管中通入蒸汽，充满整个容器后，再从徘气管中缓缓排出。容器内的蒸汽压力保持1公斤，20分钟。在保温结束后，关键是随即通入无菌空气，使容器保持正压，防止形成真空而吸入带菌的空气。第三节第三节 培养基灭菌的工程设计培养基灭菌的

23、工程设计 在发酵过程中，往往要向发酵罐中补入各种不同的料液。这些料液都必需经过灭菌。灭菌的方法则视料液的性质、体积和补料速率而定。如果补料量较大，而具有连续性时，则采用连续灭菌较为合适。也有利用过滤法对另补料液进行除菌。补料液的分批灭菌，通常是向盛有物料的容器中直接通入蒸汽。所有的附属设备和管道都要经过灭菌。第三节第三节 培养基灭菌的工程设计培养基灭菌的工程设计 连续灭菌的优缺点优点保留较多的营养质量容易放大较易自动控制；糖受蒸汽的影响较少；缩短灭菌周期；在某些情况下，可使发酵罐的腐蚀减少；发酵罐利用率高；蒸汽负荷均匀。缺点设备比较复杂，投资较大。第三节第三节 培养基灭菌的工程设计培养基灭菌的工程设计 分批分批灭菌的菌的优缺点缺点优点设备投资较少染菌的危险性较小人工操作较方便对培养基中固体物质含量较多时更为适宜缺点灭菌过程中蒸汽用量变化大，造成锅炉负荷波动大，一般只限于中小型发酵装置。第三节第三节 培养基灭菌的工程设计培养基灭菌的工程设计