流式细胞仪分析技术及应用 (2)优秀课件.ppt

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1、流式细胞仪分析技术及应用流式细胞仪分析技术及应用第1页，本讲稿共87页主要内容主要内容数据的显示与分析数据的显示与分析1流式细胞仪的流式细胞仪的原理原理2流式细胞仪免疫分析的技术要求流式细胞仪免疫分析的技术要求 3流式细胞术在免疫检查中的应用流式细胞术在免疫检查中的应用 4第2页，本讲稿共87页流式细胞术（流式细胞术（flow cytometry，FCM）是以流式是以流式细胞仪作为检测工具，结合激光光学、计算机、细胞仪作为检测工具，结合激光光学、计算机、电子物理学、流体力学、细胞化学和免疫学等学电子物理学、流体力学、细胞化学和免疫学等学科的理论与技术，对于处在快速直线流动状态中科的理论与技术，

2、对于处在快速直线流动状态中的细胞或生物颗粒同时进行多参数、快速定量分的细胞或生物颗粒同时进行多参数、快速定量分析和分选的高新技术析和分选的高新技术 研究对象为生物颗粒，如各种细胞、微生物及人研究对象为生物颗粒，如各种细胞、微生物及人工合成微球等工合成微球等第3页，本讲稿共87页第一节第一节 流式细胞术的分析及分选原理流式细胞术的分析及分选原理 光光光光 学学学学系系系系 统统测测 试试原原原原 理理理理流式流式细胞仪细胞仪电电 子子子子系系系系 统统液液液液 流流流流系系系系 统统光光光光 学学学学原原原原 理理理理光光光光电转电转换换原理原理原理原理4第4页，本讲稿共87页光电光电倍增管倍增

3、管放大电路放大电路流式细胞仪流式细胞仪是集多种是集多种技术为一体的技术为一体的新型高科新型高科技仪器技仪器激光技术激光技术单克隆抗体技术单克隆抗体技术细胞荧光化学技术细胞荧光化学技术光电测量技术光电测量技术电子物理技术电子物理技术电子计算机技术电子计算机技术能对于处在快速直线流动状态中能对于处在快速直线流动状态中的细胞或生物颗粒同时进行多参的细胞或生物颗粒同时进行多参数、快速定量分析和分选数、快速定量分析和分选第5页，本讲稿共87页一、流式细胞仪分析的工作原理一、流式细胞仪分析的工作原理 荧光显微镜技术荧光显微镜技术荧光显微镜技术荧光显微镜技术单克隆抗体与单克隆抗体与单克隆抗体与单克隆抗体与荧

4、光染料技术荧光染料技术荧光染料技术荧光染料技术 计算机技术计算机技术计算机技术计算机技术处理光信号处理光信号处理光信号处理光信号激发光源改为激光激发光源改为激光激发光源改为激光激发光源改为激光提高检测灵敏度提高检测灵敏度提高检测灵敏度提高检测灵敏度和特异性和特异性和特异性和特异性 提高检测速度和提高检测速度和提高检测速度和提高检测速度和统计分析精确性统计分析精确性统计分析精确性统计分析精确性 第6页，本讲稿共87页（一）流式细胞仪基本结构（一）流式细胞仪基本结构 包括流动室（flow chamber）和液流驱动系统作用：依次传送待测样本中的细胞到激光照射区理想状态：细胞逐个传送到激光束的中心，

5、而且在特定的时间内，应该只有一个细胞或生物微粒通过激光束。1液流系统液流系统第7页，本讲稿共87页流流动动室室和和液液流流驱驱动动系系统统 第8页，本讲稿共87页流动室流动室仪器的核心部件，待测样品与激光在仪器的核心部件，待测样品与激光在这里相交，通常由有机玻璃、光学玻璃或石英等这里相交，通常由有机玻璃、光学玻璃或石英等制成。制成。流动室内充满了鞘液，使细胞排成单列进入流动流动室内充满了鞘液，使细胞排成单列进入流动室喷嘴口，形成细胞液柱。室喷嘴口，形成细胞液柱。第9页，本讲稿共87页 FCM FCM的液流系统的液流系统（如何形成单个细胞流）（如何形成单个细胞流）样本管样本管鞘液管鞘液管第10页

6、，本讲稿共87页液流驱动系统：包括压缩空气泵、压力传感器、液流驱动系统：包括压缩空气泵、压力传感器、鞘液过滤器和样本压力调节器等。鞘液过滤器和样本压力调节器等。常用的液流系统中细胞流和鞘液流的驱动一般采常用的液流系统中细胞流和鞘液流的驱动一般采用正压的方法控制的，保证了鞘液的流速恒定。用正压的方法控制的，保证了鞘液的流速恒定。鞘液以匀速通过流动室，因此整个液流系统运行鞘液以匀速通过流动室，因此整个液流系统运行流速是不变的。流速是不变的。第11页，本讲稿共87页包括激发光源、分光镜、光束成形器、透镜组和光电倍增管。流式细胞仪的测定是基于对光信号的检测来实现的，因此光学系统是流式细胞仪中最为重要的

7、一个系统。2光学系统光学系统第12页，本讲稿共87页光学系统光学系统第13页，本讲稿共87页采用高压汞灯，采用高压汞灯，廉价、激发光谱廉价、激发光谱广泛，但在单一广泛，但在单一谱线上能量较弱，谱线上能量较弱，且功率不够稳定，且功率不够稳定，应用受到一定限应用受到一定限制制 弧光灯弧光灯 提供单波长、高提供单波长、高能量、高稳定性能量、高稳定性的光照，是快速、的光照，是快速、准确分析细胞微准确分析细胞微弱光的理想光源。弱光的理想光源。现代流式细胞仪现代流式细胞仪多采用激光多采用激光激光激光 激发光源激发光源第14页，本讲稿共87页光学系统：主要由多组透镜、滤光片和分光镜等光学系统：主要由多组透镜

8、、滤光片和分光镜等光学元件组成，将不同波长的光信号送入不同的光学元件组成，将不同波长的光信号送入不同的探测器探测器 1 1）长通）长通滤片（滤片（long pass filter，LP)2）短通滤片（）短通滤片（short pass filter，SP)3）带通滤片（）带通滤片（band pass filter，BP）滤片滤片滤片滤片第15页，本讲稿共87页长通滤片长通滤片只允许特定波长以上的光通过只允许特定波长以上的光通过 ，如，如LP500LP500滤片，只允许滤片，只允许500nm500nm以上的光通过以上的光通过 短通滤片短通滤片与长通滤片正好相反与长通滤片正好相反 ，只允许特定波长以

9、下的光，只允许特定波长以下的光通过通过 ，如，如SP500SP500滤片，只允许滤片，只允许500nm500nm以下的光通过以下的光通过 带通滤片带通滤片 只允许相当窄波长范围内的光通过，滤片一般只允许相当窄波长范围内的光通过，滤片一般有两个值，如有两个值，如BP500/50BP500/50允许通过的波长范围为允许通过的波长范围为475475525nm525nm，中心值为，中心值为500nm500nm。第16页，本讲稿共87页组成：光电转换器、放大器和信号处理电路 作用：将产生的各种光信号成比例的转换成电信号，进行数字化处理后转入电子计算机进行数据采集和分析。3电子系统电子系统第17页，本讲稿

10、共87页高度聚焦高度聚焦激光束激光束（二）基本工作原理（二）基本工作原理 单单细细胞胞悬悬液液 特异性荧光染料特异性荧光染料标记抗体染色标记抗体染色流动流动室室检检测测区区 恒定气压恒定气压鞘液喷出鞘液喷出 高压高压 细胞单行排列细胞单行排列 特异性荧光特异性荧光+散射光散射光 第18页，本讲稿共87页入射光束入射光束与液柱与液柱垂直方向垂直方向前向小角方向前向小角方向荧光信号荧光信号 侧向散射光信号侧向散射光信号 前向散射光信号前向散射光信号 荧光检测系统荧光检测系统 散射光检测系统散射光检测系统 前向散射光感受器前向散射光感受器 光信号光信号光信号光信号电信号电信号计算机系统计算机系统转换

11、转换 放大放大 第19页，本讲稿共87页第20页，本讲稿共87页二、细胞分选原理二、细胞分选原理 （一）分选的基本原理（一）分选的基本原理 流式细胞仪的分选是指从细胞群体中分离出感兴趣的细胞，检测的任意参数都可作为分选时指定的细胞的依据。分选的方式有捕获式分选和电荷式分选，目前应用最多的是电荷式分选。第21页，本讲稿共87页当单细胞悬液形成液柱通过流动当单细胞悬液形成液柱通过流动室时，液柱被分割成一连串均匀室时，液柱被分割成一连串均匀的液滴。的液滴。根据设定的被分选细胞的某个参根据设定的被分选细胞的某个参数由逻辑电路判断是否被分选。数由逻辑电路判断是否被分选。电荷式分选电荷式分选1 第22页，

12、本讲稿共87页充电电路对选定细胞液滴充电，充电电路对选定细胞液滴充电，使其带正电荷或负电荷，未被设使其带正电荷或负电荷，未被设定分选参数的细胞液滴则不带电定分选参数的细胞液滴则不带电荷。荷。带电细胞液滴通过静电场而发生带电细胞液滴通过静电场而发生偏转，落入收集器中，其他液体偏转，落入收集器中，其他液体则被当作废液抽吸掉，完成细胞则被当作废液抽吸掉，完成细胞分选的目的。分选的目的。电荷式分选电荷式分选2 第23页，本讲稿共87页（二）（二）FCM分选技术要求分选技术要求 细胞分选对仪器的性能要求较高分选是流式细胞仪的重要功能之一分选功能的装置较为复杂 分选指标分选指标分选指标分选指标分选速度分选

13、速度分选速度分选速度 分选纯度分选纯度分选纯度分选纯度 分选收获率分选收获率 第24页，本讲稿共87页每秒可分离所要细胞的个数，一般要求分选速度每秒可分离所要细胞的个数，一般要求分选速度至少达至少达5000个个/秒左右。秒左右。分选纯度分选纯度2分选速度分选速度1分选收获率分选收获率3被分选出的细胞所占百分比，分选纯度与仪器配置和细胞是否重叠有关。被分选出来的细胞占应被分选的细胞的比例。通常情况下，分选纯度和收获率是相互矛盾。第25页，本讲稿共87页488 nm 激光激光+-前向散射光前向散射光检测器检测器 荧光检测器荧光检测器电磁场电磁场单个细胞被分类单个细胞被分类进入检测管进入检测管流流式

14、式细细胞胞仪仪分分选选系系统统第26页，本讲稿共87页第二节第二节 数据的显示与分析数据的显示与分析一、参数一、参数1、散射光信号：分为前向散射光（forward scatter，FSC）和侧向散射光（side scatter，SSC）。散射光不依赖于任何细胞样品的制备技术，被称为细胞的物理参数，反映的是细胞的大小的内部结构。2、荧光信号第27页，本讲稿共87页二、散射光的测定二、散射光的测定前向散射光检测器前向散射光检测器 侧向散射光检测器侧向散射光检测器 在激光束的正前方，在激光束的正前方，在激光束的正前方，在激光束的正前方，又称小角散射又称小角散射又称小角散射又称小角散射 FSCFSCF

15、SCFSC信号的强弱与细信号的强弱与细信号的强弱与细信号的强弱与细胞的胞的胞的胞的体积大小体积大小体积大小体积大小成正比，成正比，成正比，成正比，检测的是细胞或其他检测的是细胞或其他检测的是细胞或其他检测的是细胞或其他颗粒的表面属性颗粒的表面属性颗粒的表面属性颗粒的表面属性在激光束的垂直方向，在激光束的垂直方向，在激光束的垂直方向，在激光束的垂直方向，又称又称又称又称90909090散射散射散射散射SSCSSCSSCSSC信号的强弱与细信号的强弱与细信号的强弱与细信号的强弱与细胞内胞内胞内胞内颗粒结构颗粒结构颗粒结构颗粒结构的质量的质量的质量的质量成正比，用于检测成正比，用于检测成正比，用于检

16、测成正比，用于检测细胞内部结构属性细胞内部结构属性细胞内部结构属性细胞内部结构属性第28页，本讲稿共87页前向散射光示意图前向散射光示意图前向散射光示意图前向散射光示意图细胞大小细胞大小第29页，本讲稿共87页侧向散射光示意图侧向散射光示意图侧向散射光示意图侧向散射光示意图结构复杂程度结构复杂程度第30页，本讲稿共87页三、荧光测量三、荧光测量 当荧光抗体或其他染料染色的颗粒通过激光束时，当荧光抗体或其他染料染色的颗粒通过激光束时，染料吸收光子跃迁到激发态，返回基态时，染料释染料吸收光子跃迁到激发态，返回基态时，染料释放出能量，大部分以光的形式释放。放出能量，大部分以光的形式释放。特异性荧光探

17、针与单克隆抗体结合后，与细胞膜特异性荧光探针与单克隆抗体结合后，与细胞膜或细胞内的靶抗原结合，经染色后的细胞在激光的或细胞内的靶抗原结合，经染色后的细胞在激光的照射下，荧光染料发出比激发光波长长的荧光，检照射下，荧光染料发出比激发光波长长的荧光，检测荧光素信号的强弱就可以了解抗原表达量的多少。测荧光素信号的强弱就可以了解抗原表达量的多少。第31页，本讲稿共87页（一）荧光信号测量与放大器（一）荧光信号测量与放大器 线性放大器线性放大器：输入与输出放大倍数相同，用于信号强度变化输入与输出放大倍数相同，用于信号强度变化较小或具有生物学线性的信号较小或具有生物学线性的信号 对数放大器：对数放大器：输

18、入放大输入放大10倍，输出由倍，输出由1变为变为2，用于信号强度变，用于信号强度变化较大且其光谱信号较复杂的信号化较大且其光谱信号较复杂的信号（二）荧光补偿（二）荧光补偿 消除重叠信号消除重叠信号第32页，本讲稿共87页四、数据显示方式四、数据显示方式X轴代表一维参数（荧光或散射光信号强度），以通道(channel)表示，其与光强度之间的关系（线性或对数）依放大器的性质而定，通道右侧信号的光强度明显高于左侧，越靠右侧光亮度越强。（一）单参数直方图（一）单参数直方图 第33页，本讲稿共87页Y轴代表颗粒计数轴代表颗粒计数（Count），反映相同荧），反映相同荧光或散射光强度的颗粒相光或散射光强度

19、的颗粒相对数量的多少，可用于定对数量的多少，可用于定性、定量资料的分析。性、定量资料的分析。单参数分析只能表达具有相同特性细胞数量与光单参数分析只能表达具有相同特性细胞数量与光信号强度的关系，对复杂表型分析时单参数分析信号强度的关系，对复杂表型分析时单参数分析结果的准确性会受到诸多因素的干扰。结果的准确性会受到诸多因素的干扰。第34页，本讲稿共87页双参数直方图是一种细胞与双测量参数的图形，双参数直方图是一种细胞与双测量参数的图形，X轴与轴与Y轴分别代表一种参数。轴分别代表一种参数。双参数信号常采用对数信号，最常用的基本表示双参数信号常采用对数信号，最常用的基本表示法是用点密图来显示。法是用点

20、密图来显示。如果把一个散点图分别投影到如果把一个散点图分别投影到X轴和轴和Y轴，可得到轴，可得到两个单参数直方图。两个单参数直方图。临床实践中常以多个散点图联合分析。临床实践中常以多个散点图联合分析。（二）双参数直方图（二）双参数直方图 第35页，本讲稿共87页点图由二维参数构成，根据颗粒密度来反映相同点图由二维参数构成，根据颗粒密度来反映相同光信号的颗粒数量的多少光信号的颗粒数量的多少 1、点图、点图 2、二维等高图、二维等高图 等高图(contourplot)是一种可以同时表达两个检测参数和细胞频度的方式，其本质也是双参数直方图 第36页，本讲稿共87页X X轴反映轴反映SSCSSC的信号

21、强弱的信号强弱Y Y轴反映轴反映FSCFSC的信号强弱的信号强弱 X X轴反映轴反映FITCFITC荧光信号强弱荧光信号强弱Y Y轴反映轴反映PEPE荧光信号强弱荧光信号强弱 点点 图图第37页，本讲稿共87页把代表相同细胞数目的把代表相同细胞数目的点依次连接起来形成密点依次连接起来形成密闭曲线，越在里面的曲闭曲线，越在里面的曲线代表的细胞数目越多，线代表的细胞数目越多，越密集的区域也就是细越密集的区域也就是细胞数目变化最快的区间。胞数目变化最快的区间。等间距等高线适用于细胞数目变化不大的情况等间距等高线适用于细胞数目变化不大的情况对数间距等高线适用于细胞数目变化较大的情况对数间距等高线适用于

22、细胞数目变化较大的情况二维等高图二维等高图第38页，本讲稿共87页三维坐标均为参数三维坐标均为参数（散射光或荧光）而（散射光或荧光）而非细胞数非细胞数 对复杂的细胞亚群观对复杂的细胞亚群观察更为直观、准确，察更为直观、准确，但对其数据的统计分但对其数据的统计分析较难析较难（三）三参数直方图（三）三参数直方图 第39页，本讲稿共87页FCM常常需要分析三个以上的参数，但软件技术常常需要分析三个以上的参数，但软件技术能够无法显示四维空间结构。能够无法显示四维空间结构。随着随着FCM多色荧光信号检测的发展，所得到的荧多色荧光信号检测的发展，所得到的荧光信号和散射光信号需根据需要进行组合分析以光信号和

23、散射光信号需根据需要进行组合分析以获得所需的信息。获得所需的信息。多参数分析能够同时比较各种细胞的不同抗原表多参数分析能够同时比较各种细胞的不同抗原表达水平，可以统计出多种数据。达水平，可以统计出多种数据。（四）多参数组合分析（四）多参数组合分析 第40页，本讲稿共87页指同一张单参数或双参数直方图中根据信号的强指同一张单参数或双参数直方图中根据信号的强弱来划定分析区域，从而计算分析区域内的细胞弱来划定分析区域，从而计算分析区域内的细胞数量。数量。GateGate设置设置 2RegionRegion设置设置 1指在某一张选定参数的直方图上根据该图的细胞群分布选定要分析的特定细胞群，并要求该样本

24、的所有其他参数组合的直方图只体现该群细胞的分布情况。第41页，本讲稿共87页RegionRegion设置设置 GateGate设置设置 第42页，本讲稿共87页五、流式细胞术的特点五、流式细胞术的特点 速度快速度快速度快速度快 对单个细胞或生物颗粒进行快速、逐个检测，对单个细胞或生物颗粒进行快速、逐个检测，对单个细胞或生物颗粒进行快速、逐个检测，对单个细胞或生物颗粒进行快速、逐个检测，测量速度可以达到每秒数千个甚至上万个细胞测量速度可以达到每秒数千个甚至上万个细胞测量速度可以达到每秒数千个甚至上万个细胞测量速度可以达到每秒数千个甚至上万个细胞 灵敏度高灵敏度高灵敏度高灵敏度高 每个细胞上只需带

25、有每个细胞上只需带有每个细胞上只需带有每个细胞上只需带有10001000100010003000300030003000个荧光分子即能检测出来个荧光分子即能检测出来个荧光分子即能检测出来个荧光分子即能检测出来 多参数多参数多参数多参数多色荧光染色同时分析单个细胞或生物颗粒的多种特征多色荧光染色同时分析单个细胞或生物颗粒的多种特征多色荧光染色同时分析单个细胞或生物颗粒的多种特征多色荧光染色同时分析单个细胞或生物颗粒的多种特征 精度高精度高精度高精度高 在细胞悬液中检测细胞，比其他技术的变异系数更小，分辨在细胞悬液中检测细胞，比其他技术的变异系数更小，分辨在细胞悬液中检测细胞，比其他技术的变异系数

26、更小，分辨在细胞悬液中检测细胞，比其他技术的变异系数更小，分辨率更高率更高率更高率更高 纯度高纯度高纯度高纯度高 可以把指定特征的细胞分选出来，分选细胞的纯度可以把指定特征的细胞分选出来，分选细胞的纯度可以把指定特征的细胞分选出来，分选细胞的纯度可以把指定特征的细胞分选出来，分选细胞的纯度可达到可达到可达到可达到99%99%99%99%以上以上以上以上 无害性无害性无害性无害性 能保持细胞不被破坏，进行无害性定性或定量分析和分选能保持细胞不被破坏，进行无害性定性或定量分析和分选能保持细胞不被破坏，进行无害性定性或定量分析和分选能保持细胞不被破坏，进行无害性定性或定量分析和分选 第43页，本讲稿

27、共87页 六、流式细胞术定量分析的注意事项六、流式细胞术定量分析的注意事项 流式细胞仪的应用已从科研进入了临床，在进行流式细胞仪的应用已从科研进入了临床，在进行科研和临床检验定量分析过程中，应明确各项工科研和临床检验定量分析过程中，应明确各项工作环节的影响因素并对仪器性能进行严格的质量作环节的影响因素并对仪器性能进行严格的质量控制，以保证检测数据的准确性和可靠性。控制，以保证检测数据的准确性和可靠性。第44页，本讲稿共87页1.确保标本上机检测前细胞浓度满足仪器检测要求。确保标本上机检测前细胞浓度满足仪器检测要求。2.荧光抗体染色后需充分洗涤，注意混匀、低速离荧光抗体染色后需充分洗涤，注意混匀

28、、低速离心，减少重叠细胞和细胞碎片。心，减少重叠细胞和细胞碎片。3.避光染色，保证细胞免疫荧光的稳定。避光染色，保证细胞免疫荧光的稳定。4.必须根据具体实验目的设置必要的对照，确保实必须根据具体实验目的设置必要的对照，确保实验结果的准确性和客观性，消除非特异性荧光的验结果的准确性和客观性，消除非特异性荧光的影响。影响。5.判定结果时，应注意减去本底荧光，可应用计算判定结果时，应注意减去本底荧光，可应用计算机程序软件，使机程序软件，使定量分析更精确。定量分析更精确。注意事项注意事项 第45页，本讲稿共87页能能否否制制备备出出合合格格的的单单细细胞胞悬悬液液是是关关系系最最终终分分析析结结果准确

29、与否的关键。果准确与否的关键。单单细细胞胞悬悬液液大大多多来来自自生生物物样样品品，不不同同组组织织来来源源的的样本制备方法也不同。样本制备方法也不同。第三节第三节 流式细胞仪免疫分析的技术要求流式细胞仪免疫分析的技术要求 一、一、FCM单细胞标本的制备单细胞标本的制备 第46页，本讲稿共87页流式细胞术主要是以某一类细胞群为检测对象，流式细胞术主要是以某一类细胞群为检测对象，减少检测时的干扰因素。减少检测时的干扰因素。新鲜的外周血是天然的单细胞悬液。新鲜的外周血是天然的单细胞悬液。单次密度梯度离心法是最常用于分离制备单个核单次密度梯度离心法是最常用于分离制备单个核细胞悬液，采用淋巴细胞分离液

30、分离外周血中的细胞悬液，采用淋巴细胞分离液分离外周血中的单个核细胞。单个核细胞。（一）外周血单细胞悬液制备（一）外周血单细胞悬液制备 第47页，本讲稿共87页（二）培养细胞的单细胞悬液制备（二）培养细胞的单细胞悬液制备 悬浮悬浮生长生长 贴壁贴壁生长生长 反复吹打反复吹打 分散分散细胞细胞 常规常规洗涤洗涤 低速低速离心离心 蛋白酶消化蛋白酶消化 机械吹打机械吹打 细胞细胞脱落脱落 低速低速离心离心 漂洗漂洗重悬重悬 单细胞单细胞悬液悬液 培养细胞一般是以悬浮或贴壁的方式生长。培养细胞一般是以悬浮或贴壁的方式生长。第48页，本讲稿共87页将新鲜实体组织进行单细胞悬液的制备是一项困将新鲜实体组织

31、进行单细胞悬液的制备是一项困难而复杂的技术。理想的状态是既要达到分离细难而复杂的技术。理想的状态是既要达到分离细胞的目的又要不损伤细胞。胞的目的又要不损伤细胞。最常用的方法是酶消化法、机械法、化学处理法最常用的方法是酶消化法、机械法、化学处理法和表面活性剂处理法等。和表面活性剂处理法等。不论是哪种方法都不可避免的会对细胞表面膜结不论是哪种方法都不可避免的会对细胞表面膜结构、细胞活性和功能等造成不同程度的损伤。构、细胞活性和功能等造成不同程度的损伤。（三）新鲜实体组织单细胞悬液制备（三）新鲜实体组织单细胞悬液制备 第49页，本讲稿共87页该制备方法的建立扩大了流式细胞术的应用范围，该制备方法的建

32、立扩大了流式细胞术的应用范围，有利于进行临床回顾性研究和利用。有利于进行临床回顾性研究和利用。常用的方法有二甲苯脱蜡法、组织清洁剂脱蜡法常用的方法有二甲苯脱蜡法、组织清洁剂脱蜡法和甲氧和甲氧-双氧水处理法。双氧水处理法。对石蜡切片的要求较严格。对石蜡切片的要求较严格。（四）石蜡包埋组织单细胞悬液制备（四）石蜡包埋组织单细胞悬液制备 第50页，本讲稿共87页活检标本及各种内镜取材标本也克制备成单细胞活检标本及各种内镜取材标本也克制备成单细胞悬液。悬液。一般要求镜检取材标本至少取一般要求镜检取材标本至少取3块以上。块以上。制备方法与新鲜实体组织基本相同。制备方法与新鲜实体组织基本相同。（五）活检标

33、本单细胞悬液制备（五）活检标本单细胞悬液制备 第51页，本讲稿共87页脱落细胞应去除取材伴随的杂质后，再制备单细脱落细胞应去除取材伴随的杂质后，再制备单细胞悬液。胞悬液。脱落细胞用流式细胞术检测，是一种更为客观的脱落细胞用流式细胞术检测，是一种更为客观的检测手段，对临床诊断和治疗很有意义。检测手段，对临床诊断和治疗很有意义。（六）脱落细胞的单细胞悬液制备（六）脱落细胞的单细胞悬液制备 第52页，本讲稿共87页FCM主要的信号参数包括散射光信号和荧光信号，主要的信号参数包括散射光信号和荧光信号，荧光染色是保证荧光信号产生的关键步骤。荧光染色是保证荧光信号产生的关键步骤。目前间接免疫荧光染色已较少

34、用；直接免疫荧光目前间接免疫荧光染色已较少用；直接免疫荧光染色以双色以上分析较为常用。染色以双色以上分析较为常用。单色免疫荧光多用于单克隆抗体特异性较高、单单色免疫荧光多用于单克隆抗体特异性较高、单一细胞群的抗原检测，多色免疫表型分析宜采用一细胞群的抗原检测，多色免疫表型分析宜采用同一品牌的试剂。同一品牌的试剂。二、二、FCM样品的荧光染色样品的荧光染色 第53页，本讲稿共87页直接免疫荧光染色法是荧光抗体技术最基本、最直接免疫荧光染色法是荧光抗体技术最基本、最简单的方法，多用于细胞表面标志的染色分析。简单的方法，多用于细胞表面标志的染色分析。（一）直接免疫荧光染色法（一）直接免疫荧光染色法

35、优优点点 操作简单，方法简便、快速 特异性强，与其他抗原交叉染色较少 反应中只有两种因素（细胞与抗体）参与，结果判断较简单 第54页，本讲稿共87页（二）间接免疫荧光染色法（二）间接免疫荧光染色法 已知未标记的特异性抗体（一抗）与待已知未标记的特异性抗体（一抗）与待测抗原反应，再用荧光素标记的抗免疫测抗原反应，再用荧光素标记的抗免疫球蛋白抗体（二抗）进行标记染色，通球蛋白抗体（二抗）进行标记染色，通过对荧光素标记的二抗所发射的荧光信过对荧光素标记的二抗所发射的荧光信号进行检测，对标本中待测抗原进行鉴号进行检测，对标本中待测抗原进行鉴定。定。一抗二抗第55页，本讲稿共87页优优点点 敏感性高具有

36、更广的通用性 缺缺点点 操作步骤繁琐，干扰因素较多易产生非特异性染色，结果判断有时比较困难 第56页，本讲稿共87页多色流式细胞仪的开发促进了新的荧光染料的合多色流式细胞仪的开发促进了新的荧光染料的合成及抗体标记物的发展。成及抗体标记物的发展。多色标记简便、省时、节约成本，但对操作人员多色标记简便、省时、节约成本，但对操作人员的要求较高。的要求较高。试剂的选择还需结合仪器的配置考虑。试剂的选择还需结合仪器的配置考虑。（三）多参数分析时荧光抗体的组合标记（三）多参数分析时荧光抗体的组合标记 第57页，本讲稿共87页自发荧光：未经荧光标记的细胞受到激光照射后自发荧光：未经荧光标记的细胞受到激光照射

37、后所发出的荧光。所发出的荧光。每种细胞群都有不同水平的自发荧光，如淋巴细每种细胞群都有不同水平的自发荧光，如淋巴细胞、中性粒细胞、嗜酸性粒细胞等。胞、中性粒细胞、嗜酸性粒细胞等。自发荧光易引起信号干扰，出现假阳性结果，在自发荧光易引起信号干扰，出现假阳性结果，在实际临床检验工作中应注意区别。实际临床检验工作中应注意区别。（四）自发荧光（四）自发荧光 第58页，本讲稿共87页（五）（五）FCM常见荧光染料的种类和特性常见荧光染料的种类和特性 尽可能高的光子产量，以提高信号强度 对激发光有较强的吸收，以降低背景噪音 激发光谱与发射光谱之间要有尽可能大的间隔，以减少背景信号对荧光信号的干扰 易于与被

38、标记的抗原、抗体或其他生物物质结合，而不会影响被标记物的特性 理想理想理想理想理想理想荧光染料荧光染料荧光染料荧光染料荧光染料荧光染料第59页，本讲稿共87页常用的染料有以下几种：常用的染料有以下几种：异硫氰基荧光素（异硫氰基荧光素（FITCFITC）藻红蛋白（藻红蛋白（PEPE）别藻青蛋白（别藻青蛋白（APCAPC）藻红蛋白偶联物藻红蛋白偶联物 PE-Cy5 PE-Cy5 得州红（得州红（Texas redTexas red）藻红蛋白偶联物藻红蛋白偶联物 PE-Cy7 PE-Cy7 第60页，本讲稿共87页常用荧光染料的特性和应用常用荧光染料的特性和应用荧光染料激发光(nm)发射光(nm)颜

39、色应用FITC488525绿色免疫荧光PE（RDI）488575橙色免疫荧光PE-Cy5488670红色 免疫荧光PE-Cy7488755深红色免疫荧光ECD488620橙红色免疫荧光PI488620橙红色DNA染色APC633670红色第61页，本讲稿共87页三、免疫胶乳颗粒技术的应用三、免疫胶乳颗粒技术的应用液相芯片技术：液相芯片技术：利用胶乳颗粒的载体特性，结合利用胶乳颗粒的载体特性，结合荧光标记和荧光标记和FCM，实现对多种可溶性物质的分析。，实现对多种可溶性物质的分析。低样本量、多参数、更高检测效率低样本量、多参数、更高检测效率第62页，本讲稿共87页四、流式细胞仪的质量控制四、流式

40、细胞仪的质量控制（一）单细胞悬液制备的质量控制（一）单细胞悬液制备的质量控制 材料新鲜、防止细胞膜损伤材料新鲜、防止细胞膜损伤 溶血剂由于低渗液，严格掌握低渗时间溶血剂由于低渗液，严格掌握低渗时间 机械法优于化学法或酶法，控制力度机械法优于化学法或酶法，控制力度 温度：温度：25-37 ，PH7.0-7.2第63页，本讲稿共87页（二）免疫荧光染色的质量控制（二）免疫荧光染色的质量控制高温荧光淬灭的可能性增大对荧光染色结果影响显著，一高温荧光淬灭的可能性增大对荧光染色结果影响显著，一般要求温度在般要求温度在2020以下以下 温度温度 pH值改变则会造成荧光光谱改变，影响荧光强度值改变则会造成荧

41、光光谱改变，影响荧光强度 pH值值 非特异性荧光强弱代表非特异性结合水平，不消除将非特异性荧光强弱代表非特异性结合水平，不消除将使检测结果假性升高使检测结果假性升高 非特异非特异荧光荧光细胞浓度低、溶剂的性质等细胞浓度低、溶剂的性质等其他其他固定剂与细胞的某些物质结合后，干扰了荧光染料与固定剂与细胞的某些物质结合后，干扰了荧光染料与细胞成分的结合，造成荧光强度改变细胞成分的结合，造成荧光强度改变 固定剂固定剂第64页，本讲稿共87页（三）仪器操作技术的质量控制（三）仪器操作技术的质量控制光路与流路校正光路与流路校正PMT校准校准绝对计数的校准绝对计数的校准第65页，本讲稿共87页（四）免疫检验

42、的质量控制（四）免疫检验的质量控制在流式细胞术实验过程中，实验的每一个环节都在流式细胞术实验过程中，实验的每一个环节都会存在很多不稳定的因素，因此必须严格做好质会存在很多不稳定的因素，因此必须严格做好质量控制工作，从而保证实验的科学性和可靠性。量控制工作，从而保证实验的科学性和可靠性。第66页，本讲稿共87页环境环境环境环境要求要求要求要求 一般要求环境温度在一般要求环境温度在20202525之间，实验之间，实验室内尽量减少灰尘和烟尘，光源要有良好室内尽量减少灰尘和烟尘，光源要有良好的屏蔽作用。的屏蔽作用。仪器仪器仪器仪器校正校正校正校正 每天校正，定期进行光路和流路校准，每天校正，定期进行光

43、路和流路校准，还需进行不同仪器间和不同实验室间还需进行不同仪器间和不同实验室间的比对。的比对。样本样本样本样本要求要求要求要求 合格的单细胞悬液是分析成功的关键，合格的单细胞悬液是分析成功的关键，保证待测标本新鲜，避免细胞损伤等。保证待测标本新鲜，避免细胞损伤等。123第67页，本讲稿共87页设置设置设置设置对照对照对照对照 最重要的是设置同型对照和全程质控，最重要的是设置同型对照和全程质控，将质控品与待测标本一起操作，以保将质控品与待测标本一起操作，以保证检测结果的准确性证检测结果的准确性数据的获数据的获数据的获数据的获取和分析取和分析取和分析取和分析获取实验数据前，应先调节仪器；获取实验数

44、据前，应先调节仪器；分析实验数据时，要根据实验目分析实验数据时，要根据实验目的来决定分析模型。的来决定分析模型。45第68页，本讲稿共87页淋巴细胞亚群的检测已成为某些疾病诊断、疗效淋巴细胞亚群的检测已成为某些疾病诊断、疗效评价和免疫功能检测的常规手段。评价和免疫功能检测的常规手段。不同淋巴细胞亚群用普通光学显微镜、血细胞分不同淋巴细胞亚群用普通光学显微镜、血细胞分析仪无法鉴别，其在分化成熟过程中表达的析仪无法鉴别，其在分化成熟过程中表达的CD抗抗原特性也不同，利用流式细胞仪结合单克隆抗体原特性也不同，利用流式细胞仪结合单克隆抗体技术能够准确分类计数淋巴细胞亚群。技术能够准确分类计数淋巴细胞亚

45、群。第四节第四节 流式细胞术在免疫学检查中的应用流式细胞术在免疫学检查中的应用 一、淋巴细胞亚群分析一、淋巴细胞亚群分析 第69页，本讲稿共87页采用三色标记的单克隆荧光抗体，可对采用三色标记的单克隆荧光抗体，可对T细胞亚群细胞亚群进行分类。进行分类。Th细胞表达细胞表达CD3+CD4+CD8-Tc细胞表达细胞表达CD3+CD4-CD8+（一）（一）T淋巴细胞及亚群分析淋巴细胞及亚群分析 第70页，本讲稿共87页成熟成熟B细胞主要表达细胞主要表达CD19、CD20、CD21、CD22分子，同时检测分子，同时检测CD25分子，可进一步观察分子，可进一步观察B细胞细胞活化状态。活化状态。（二）（二

46、）B淋巴细胞及亚群分析淋巴细胞及亚群分析（三）（三）NK细胞分析细胞分析 目前临床上常采用三色荧光抗体标记将CD3-CDl6+CD56+淋巴细胞定为自然杀伤细胞（Natutal killer cell，NK细胞）。第71页，本讲稿共87页项目百分率(%)绝对数(个/l)比值总T淋巴细胞(CD3+CD19-)50849552860总B淋巴细胞(CD3-CD19+)51890560辅助/诱导性T淋巴细胞(CD3+CD4+)27515501440抑制/细胞毒性T淋巴细胞(CD3+CD8+)15443201250辅助/抑制性T淋巴细胞比值(CD3+CD4+/CD3+CD8+)0.712.78NK细胞(

47、CD3-CD16+CD56+)7401501100T淋巴细胞+B淋巴细胞+NK细胞9510015303700注：每个实验室宜建立本室的参考范围，不同人群、不同试剂、注：每个实验室宜建立本室的参考范围，不同人群、不同试剂、不同地区可能有差别不同地区可能有差别 健康成年人外周血淋巴细胞亚群分析的参考区间健康成年人外周血淋巴细胞亚群分析的参考区间第72页，本讲稿共87页细胞介导细胞毒实验：细胞介导细胞毒实验：淋巴细胞与靶细胞共培养，淋巴细胞与靶细胞共培养，加入碘化丙啶（加入碘化丙啶（PI，渗透到死亡细胞致其染红色），渗透到死亡细胞致其染红色），细胞内细胞因子测定：细胞内细胞因子测定：同时测定多种同时

48、测定多种CK二、淋巴细胞功能分析二、淋巴细胞功能分析 第73页，本讲稿共87页FCM在血液病诊断、治疗和预后判断方面，具有在血液病诊断、治疗和预后判断方面，具有非常重要的价值。非常重要的价值。三、白血病免疫表型分析三、白血病免疫表型分析 正确区别急性髓细胞性白血病（AML）和急性淋巴细胞性白血病（ALL）。正确鉴别AML中的M0、M6、M7型。正确诊断双系列型或双表型白血病。正确诊断少见、疑难白血病。发现仅表达个别次要非本系列相关抗原的白血病。第74页，本讲稿共87页正常血细胞在分化发育成熟过程中，某些抗原的正常血细胞在分化发育成熟过程中，某些抗原的表达与否可作为鉴别和分类血细胞的标记。表达与

49、否可作为鉴别和分类血细胞的标记。白血病细胞可用造血细胞分化抗原类标记检测。白血病细胞可用造血细胞分化抗原类标记检测。FCM结合单克隆抗体的应用可以提高白血病分类结合单克隆抗体的应用可以提高白血病分类诊断的符合率，是一种客观的检测手段。诊断的符合率，是一种客观的检测手段。FCM对白血病复发的主要根源，微小残留病灶对白血病复发的主要根源，微小残留病灶（MRD）的检测具有高敏感性和特异性，早期检）的检测具有高敏感性和特异性，早期检出出MRD避免疾病复发。避免疾病复发。第75页，本讲稿共87页FAB分类CD13CD33CD11bCD14HLA-DRCD34CD117MPOM0+/-+M1+-/+-+M

50、2+-+/-+M3+-+M4+/-+/-+M5a+/-+/-+/-+-/+M5b+-/+M6+/-+/-+或-+/-+M7-+/-+?-典型典型AMLAML的免疫表型特点的免疫表型特点第76页，本讲稿共87页获得性免疫缺陷综合征获得性免疫缺陷综合征(AIDS)的特征是的特征是CD4+T淋淋巴细胞数量和功能的进行性破坏巴细胞数量和功能的进行性破坏,从而引起全身继从而引起全身继发严重感染和癌变。发严重感染和癌变。FCM可以快速检测外周血可以快速检测外周血CD4+T和和CD8+T淋巴淋巴细胞相对数和绝对数的变化，同时也可以检测细胞相对数和绝对数的变化，同时也可以检测CD4+T细胞的功能变化。细胞的功