辽宁石油化工大学环境与生物工程学院.doc

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1、辽宁石油化工大学环境与生物工程学院细胞工程概论教案2005-2006 学年第二学期学 生 专业 及 年级：生工0301主讲教师姓名及职称：姜虎生 必 读 参 考 书： 植物细胞工程 朱至清 动物细胞工程 徐永华 课程总学时数 16本学期总学时数 16本学期上课周数 16 平均每周学时数 1课 程 性 质 选修课本学期学时分配讲课 16实验等 测验 周次月日教学内容（写明章节标题）学时数其它（作业、习题课、实验等）119/3-26/3一、绪 论1.细胞工程在生物技术领域中地位2.细胞工程的发展2226/3-2/43.细胞工程的基础知识与基本技术二、植物细胞工程1.细胞全能性及其表达2布置作业32

2、/4-9/42.植物细胞培养和次生代谢物的生产249/4-16/43 植物细胞原生质体制备与融合4. 单倍体植物的诱发与利用2布置作业516/4-23/45 人工种子的研制2623/4-30/4三动物细胞工程1.细胞培养的条件2原代细胞的培养与建系2布置作业77/5-14/53.细胞组织培养4.细胞融台和单抗的杂交瘤技术 5.细胞拆合2814/5-21/5复习考试2绪 论【课时安排】1.1 细胞工程在生物技术领域中的地位 1学时1.2 细胞工程的发展 1学时总计 2学时【掌握内容】1. 基本概念：生物技术定义、细胞工程。2. 细胞工程的发展。【了解内容】1. 了解细胞工程与现代生物技术的关系；

3、了解细胞工程的发展与相关学科的联系；了解细胞工程在现代世界经济中的潜力.2. 生物技术的内涵。3. 生物技术对经济社会发展的影响。【教学难点】1. 生物技术对经济社会发展的影响。2.。基因工程、细胞工程、酶工程、发酵工程以及生化工程含义及相互关系。【教学目标】1. 掌握生物技术定义、细胞工程基本概念。2. 能对几对重要概念进行辨析。3. 能了解现代生物技术及细胞工程发展历史。第一节 细胞工程在生物技术领域中的地位生物技术被世界各国视为一项高新技术。细胞工程就是在细胞水平研究开发、利用各类细胞的工程。亦即人们根据科学设计改变细胞的遗传基础，及通过无菌操作，大量培养细胞、组织乃至完整个体的技术。一

4、、生物技术概述1.生物技术定义:是以生物科学为基础，利用生物个体或生物器官、组织、细胞的特性和功能，设计构建具有预期性状的新物种或新品系（包括细胞系），以及与工程原理相结合进行产品加工生产的综合性技术体系。解释先进的工程技术手段、改造生物体、生物原料、为人类生产出所需的产品、达到某种目的。2.生物技术的内涵主要是：1）运用现代生物学理论与科学技术改造细胞的遗传物质，培育出人们需要的生物新品种；2）工业规模地利用现有生物体系，制备生物产品；3）模拟生物体系，以生物化学工程代替化学工程，制备工业产品；4）发展相应的科学理论与工程技术。主要技术范畴包括：基因工程、细胞工程、酶工程、发酵工程以及生化工

5、程。3.现代生物技术特征：多学科性；商业性；规模化。4.生物技术发展历程。4.1传统生物技术的发展4.2 现代生物技术的发展5. 生物技术涉及的学科它以包括分子生物学、细胞生物学、微生物学、免疫生物学、人体生理学、动物生理学、植物生理学、微生物生理学、生物化学、生物物理学、遗传学等几乎所有生物科学的次级学科为支撑，又结合了诸如化学、化学工程学、数学、微电子技术、计算机科学等生物学领域之外的尖端基础学科，从而形成一门多学科互相渗透的综合性学科.概括地说，生物技术相关的行业可分为七大类型（表1-2）。6.生物技术对经济社会发展的影响61 改善农业生产、解决食品短缺611 提高农作物产量及其品质（1

6、）培育抗逆的作物优良品系 （2）植物种苗的工厂化生产 （3）提高粮食品质 （4）生物固氮，减少化肥使用量 612 发展畜牧业生产 62 提高生命质量，延长人类寿命医药生物技术是生物技术领域中最活跃，产业发展最迅速，效益最显著的领域。其投资比例（图13）及产品市场（表1-3）均占生物技术领域的首位。6.21 开发制造奇特而又贵重的新型药品 622 疾病的预防和诊断 623 基因治疗 624 人类基因组计划（HGP） 633 解决能源危机、治理环境污染 6331 解决能源危机 6332 环境保护 634 制造工业原料、生产贵重金属 6341 制造工业原料 6342 生产贵重金属 二、细胞工程的概念

7、及研究范畴1.细胞工程（cell engineering）是应用细胞生物学和分子生物学方法，借助工程学的试验方法或技术，在细胞整体水平和细胞器水平上研究改造生物遗传特性和生物学特性，以获得特定的细胞、细胞产品或新生物体的一门综合性科学技术。2.研究范畴 根据研究对象不同，细胞工程可分为动物细胞工程和植物细胞工程。3. 细胞工程的优势：避免了分离、提纯、煎切、拼接等基因操作，只需将细胞遗传物质直接转移到受体细胞中就能够形成杂交细胞，不仅可以在植物与植物之间、动物与动物之间、微生物与微生物之间，甚至可以在三者之间形成前所未有的杂交物种。第二节 细胞工程的发展一、动物物细胞工程的发展1融合现象的发现

8、2. 动物组织细胞培养技术的建立3. 细胞融合技术的建立和杂交瘤技术的诞生4. 动物克隆技术的建立二、植物细胞工程的发展1探索阶段2培养技术建立阶段3应用研究阶段三细胞工程的基础知识与基本技术1 基础知识1. 1细胞的特性 1.1.1培养细胞的形态 1.1.2 培养细胞的生长方式和类型 贴壁型生长细胞 悬浮型生长细胞 2 基本操作21 无菌操作技术22 细胞培养技术23 细胞融合技术思考题1细胞工程的概念、研究范畴、在生命科学中与其它学科的关系。2动物细胞工程发展的主要标志性阶段。3植物细胞工程技术的发展阶段与标志性成就。4植物细胞工程的作用与应用领域。第一部分 植物细胞工程第一章 细胞全能性

9、及其表达【课时安排】1.1 概念 10分钟1.2 细胞分化和脱分化 20分钟1.3 器官发生 10分钟1.4 体细胞胚胎发生 20分钟1.5 植物组织培养 40分钟 总计 2学时【掌握内容】1. 基本概念：全能性、细胞脱分化、胚状体、器官发生。2. 细胞的脱分化过程3. 离体培养中器官发生的方式4. 器官分化过程5. 体细胞胚的形成6. 植物组织培养过程【了解内容】1. 植物细胞分类。2.细胞脱分化过程中生理活动与细胞结构的变化3.分析各种因素对器官的分化的影响。4. 影响体细胞胚发生的因素【教学难点】1. 离体培养中器官发生的方式。2. 细胞的脱分化和再分化。【教学目标】1. 掌握相关基本概

10、念并能对几对重要概念进行辨析。2. 对分化、再分化、器官分化、体细胞胚的形成有全面深入的了解。3. 植物组织培养过程。【教学内容】一.概念：一个生活细胞所具有的产生完整生物个体的潜在能力称之为细胞的全能性。植物细胞可分为三类：第一类是茎尖、根尖及形成层细胞第二类是筛管、导管、气孔保卫细胞等特化细胞第三类是表皮细胞及各种薄壁细胞分析各类细胞特点并加以区分。二、细胞分化 是指导致细胞形成不同结构，引起功能改变或潜在发育方式改变的过程。时间上的分化： 空间上的分化： 三、细胞脱分化 在培养条件下使一个已分化的细胞回复到原始无分化状态或分生细胞状态的过程就是细胞脱分化。3.1细胞的脱分化过程可分为三个

11、阶段：第一阶段为启动阶段，表现为细胞质增生，并开始向细胞中央伸出细胞质丝，液泡蛋白体出现；第二阶段为演变阶段，此时细胞核开始向中央移动，质体演变成原质体；第三阶段为终结期，细胞回复到分生细胞状态，细胞分裂即将开始。3.2细胞脱分化过程中生理活动与细胞结构的变化脱分化过程中细胞结构会发生急剧变化。这些变化总体上包括：细胞质显著变浓，大液泡消失，核体积增加并逐渐移位至细胞中央，细胞器增加。液泡蛋白体的出现和质体转变为原质体被认为是细胞脱分化的重要特征。四、器官发生 植物的离体器官发生是指培养条件下的组织或细胞团（愈伤组织）分化形成不定根、不定芽等器官的过程。4.1、离体培养中器官发生的方式通过器官

12、发生形成再生植株大体上有三种方式：第一种方式是先芽后根第二种方式为先根后芽第三种方式是在愈伤组织的不同部位形成芽和根，再通过维管组织的联系形成完整植株。4.2、器官分化过程第一阶段是外植体经过诱导形成愈伤组织。第二阶段是“生长中心”形成。当把愈伤组织转移到有利于有序生长的条件下以后，首先在若干部位成丛出现类似形成层的细胞群，通常称之为“生长中心”，也称为拟分生组织，它们是愈伤组织中形成器官的部位。第三阶段是器官原基及器官形成。在有些情况下，外植体不经过典型的愈伤组织即可形成器官原基。这一途径有两种情况：一是外植体中已存在器官原基，进一步培养即形成相应的组织器官进而再生植株，如茎尖、根尖分生组织

13、培养；另一种情况是外植体某些部位的细胞，在重新分裂后直接形成分生细胞团，然后由分生细胞团形成器官原基。分析各种因素对器官的分化的影响。不同外植体类型对器官的分化是影响的。激素对器官分化的调控： 光照对器官分化的影响： 五、体细胞胚胎发生胚状体：离体培养下没有经过受精过程，但经过了胚胎发育过程所形成的胚的类似物（不管培养的细胞是体细胞还是生殖细胞），统称为体细胞胚或胚状体。这一定义有以下几方面的界定：其一，与无融合生殖胚不同，体细胞胚是离体培养的产物，只限于在离体培养范围使用。其二，与合子胚不同，体细胞胚起源于非合子细胞。其三，与离体培养中器官发生形成个体的途径不同，她经过了胚胎发育过程。5.1

14、、体细胞胚的形成1）从外植体上直接发生在以叶片为外植体的培养中，体细胞胚的直接形成可分为两个阶段：第一个阶段为诱导期。第二个阶段是胚胎发育期。2）经过愈伤组织的体细胞胚发生第一阶段是诱导外植体形成愈伤组织。第二阶段是诱导愈伤组织胚性化；第三阶段是体细胞胚形成。3）细胞悬浮培养的体细胞胚胎发生1.5.2、影响体细胞胚发生的因素1）外源激素对体细胞胚胎发生的调控2）培养基及培养条件对体细胞胚形成的影响3）不同基因型间体细胞胚形成能力的差异六植物组织培养介绍组织培养概念、发展历史、现状、意义。进行植物组织培养，一般要经历以下5个阶段：1 预备阶段（1）选择合适的外植体是本阶段的首要问题（2）除去病原

15、菌及杂菌 对外植体除菌的一般程序如下：外植体自来水多次漂洗消毒剂处理无菌水反复冲洗无菌滤纸吸干。然后制备：（3）配制适宜的培养基 由于物种的不同，外植体的差异，组织培养的培养基多种多样，但它们通常都包括以下三大类组分：含量丰富的基本成分微量无机物微量有机物2诱导去分化阶段 3 继代增殖阶段4 生根成芽阶段5 移栽成活阶段思考题1细胞学说与细胞全能性的概念。2细胞分化的阶段及细胞结构的变化。3真核生物细胞周期调控的分子机理。5离体条件下生长素与细胞分裂素在细胞分化中的作用。6器官发生的影响因素及调控机理。7体细胞胚与合子胚在形成途径和结构上的异同。8影响体细胞胚形成的因素及调控。第二章 植物细胞

16、培养和次生代谢物的生产【课时安排】1.1 单细胞培养技术 30分钟1.2 次生代谢物的生产 30分钟1.3 细胞培养生产有用物质 20分钟1.4 若干有用物质的生产 20分钟 总计 2学时【掌握内容】1. 单离细胞的方法。2. 单细胞培养技术方法。3. 培养细胞的同步化4. 固定化细胞培养系统【了解内容】1. 成功的悬浮细胞培养体系必须满足的条件。2. 培养细胞的密度及生活率的测定3. 次生代谢物的生产的意义。4. 细胞培养生产有用物质和若干有用物质的生产。【教学难点】1. 细胞悬浮培养。2.工业化生产次及代谢物过程。【教学目标】5. 能够对各种单细胞培养技术方法进行分析比较。6. 能够区分分

17、批和连续培养及封闭与开放培养。3. 掌握平床和立拄培养系统特点。【教学内容】一、单细胞培养技术1、单离细胞的方法(一)物理方法 这是最早采用且至今仍用得最多的方法。即悬浮培养的细胞经摇床振动使细胞分散，如果向细胞悬浮液中吹入脉冲压缩空气，会使细胞分散得更好；分离时用镍丝网进行过滤，细胞大的植物种类用200一300目，细胞小的用400目。过滤后用500转分密度梯度离心510分钟，使单离细脑沉淀在离心管底，收集之。(二)化学方法 加草酸钙l00ug/L处理胡萝卜细胞悬浮物，因草酸盐能结合细胞间质中的果胶钙的钙离子，从而获得了较分散的细胞。另外，秋水仙碱(o1mm01L)或2，4D或水解乳蛋白对细胞

18、分散均有一定的作用。(三)酶法加果胶酶和少量纤维素酶，使细胞彼此分离开来，也是单离细胞的一种方法。酶法往往对细胞有不良影响，故此法用得较少。2. 单细胞培养技术方法(一)液体浅层培养 是先把细胞以一定的密度悬浮在液体培养基中，用吸管将悬浮液移到平皿中使之形成一个浅层。此浅层以1mm为宜，太厚不利于细胞对氧的吸收。用石蜡膜封住平皿后，进行静置培养。该法的优点是培养与空气接触面大、通气好，细胞的代谢物易扩散，防止了有害物质的积累过多而造成毒害。此外，转移培养物或添加新鲜培养基也方便，并便于观察和照惕。但由于细胞可能游动，不能进行定点观察；也可能出现细胞的集聚作用。(二)微室培养 此法的优点是可在显

19、微镜下连续观察细胞的变化。(三)平板培养技术 是先将琼脂(琼脂糖效果更好)加热融化后冷却至43-45c时，迅速与等体积的细胞悬浮液均匀混合。完全冷却后，培养基在培养皿中形成一平板，单离的细胞包埋于培养基内。混合后琼脂的最终浓度控制在o6%以下，以得到松软的固化状态，有利于细胞生长。此法的优点是单离的细胞在培养基中分布较均匀，也便于定点观察，缺点是通气不好。(四)看护培养 看护培养也曾称为纸筏营养技术，是在一个锥形瓶中，先加入一定体积的固体培养基，培养基上放上一块几毫米大小的愈伤组织块，在此愈伤组织块上再放上一张预先灭菌过的滤纸，然后放置一个晚上，使滤纸充分地吸收愈伤组织里渗透出来的培养基成分，

20、次日把分离好的单细胞接种到滤纸表面。单细胞通过滤纸从愈伤组织和培养至中吸收养分后，可以分裂形成小细胞团。小细胞团可转移出来继代培养。如此可促使小细胞团增殖、分化。(五)饲喂层技术 其方法是：作饲喂层的细胞经射线照射后核失活不能分裂，但细胞仍存活。饲喂层细胞用平板技术制成一琼脂(糖)平板此平板亦即“伺喂层”，然后将单离细胞以液体浅层或平板技术铺在饲喂层上。饲喂层的作用没有种的特异性，即以一种植物细胞制成的平板可以支持另一种的生长。（六）悬浮培养 是指将单个游离细胞或小细胞团在液体培养基中进行培养增殖的技术。悬浮培养与固体培养比较有三个优点：一是增加培养细胞与培养液的接触面，改善营养供应；二是在振

21、荡条件下可避免细胞代谢产生的有害物质在局部积累而对细胞自身产生毒害；三是振荡培养可以适当改善气体的交换。一个成功的悬浮细胞培养体系必须满足三个条件：冘 悬浮培养物分散性良好，细胞团较小，一般在3050个细胞以下，在实际培养中很少有完全由单细胞组成的植物细胞悬浮系。冘 均一性好，细胞形状和细胞团大小大致相同。悬浮系外观为大小均一的小颗粒，培养基清澈透亮，细胞色泽呈鲜艳的乳白或淡黄色。冘 细胞生长迅速，悬浮细胞的生长量一般23天甚至更短时间便可增加一倍。1.培养方法1）分批培养 分批培养是将游离细胞按一定的细胞密度分散在液体培养基中进行培养，这样可以建立单细胞培养物。分批培养所用的容器一般为100

22、250m1三角瓶，每瓶装2075ml培养基，培养过程中，除气体和挥发性代谢产物可以同外界气体交换外，一切都是密闭的。当培养基中主要营养物质耗尽时，细胞的生长和分裂即停止，为使分批培养达到细胞能不断增殖，必须及时进行继代培养，即取出一小部分细胞悬浮液，转移到成分柑同的新鲜培养基中(约稀释5倍)。悬浮细胞培养进行继代操作时，可用吸管或注射器，不过进液口的孔径必须小到只能通过一个细胞或小细胞团(24个细胞)，操作前应将培养瓶静置几秒钟，让大的细胞团沉淀下去，然后再吸取上层悬浮液。在细胞培养过程中，如何使细胞充分分散于培养液中是很重要的问题，而细胞的分散性与最初用于悬浮培养的愈伤组织的松散性有密切关系

23、，将愈伤组织在半固体培养基上继代23个周期，可增加其松散性；另外，培养基某些成分也能增加细胞的分散性，如加入适量的2，4D、纤维京酶、果胶酶、酵母提取液等均能提高培养细胞的分散性。当然，采用上述方法可以提高细胞的分散性，但无论如何只含有单细胞的悬浮液是没有的，总存在一些细胞田每个细胞团由几个到几十个细胞组成，这是因为植物细胞有聚集在一起的特性。分批培养是细胞悬浮培养的一种常用方法，但由于培养过程中细胞生长和代谢方式及培养基成分在不断改变，因此对研究细胞的生长和代谢不是一种理想的方法，但其所用设备简单、操作简便、重复性好，特别适合于突变体筛选和遗传转化等研究。2）连续培养 连续培养是利用特制的培

24、养容器进行大规模细胞培养的一种方法。在连续培养过程中新鲜培养基的注入和老培养基的排出不断进行，这样在培养物容积保持恒定的情况下，培养液中营养物质不断得到补充。连续培养有封闭型和开放型之分。封闭型是指旧培养基的排出与新培养基的注入是等量进行的，排出液中的细胞经机械回收后，又被放回到培养系统中，因此，在这样的培养系统中，随着培养时间的延长，细胞数目不断增加。开放型培养与封闭型培养的区别在于新鲜培养基的加入和控制方式，开放型培养中，加入新鲜培养基的容积和排出的旧培养基及其中细胞的容积相等并通过调节流入、流出速度，使细胞的生长速度保持在接近最高值的恒定水平上。根据调节机制的不同，可分为化学恒定式和浊度

25、恒定式。化学恒定式培养是以固定速度加入新鲜培养基，选其中一种营养成分(氮、磷或葡萄糖)的浓度调节成为生长限制浓度从而使细胞的增殖保持在稳定状态之中。在这种培养体系中，除限制因素外培养基的其他成分的浓度均高于细胞生长的需要，而限制因素的浓度则要调节到这样一种水平：它的任何增减都能由相应的细胞增长速率的增减反映出来。浊度恒定培养中，新鲜培养基是间断加入的，它是由细胞密度的增加引起培养额浊度的增加来调节的预先设定一种细胞密度，当超过这一密度时，就排出培养液及其中的细胞，再加入新鲜培养基，从而保持细胞密度的恒定。2.培养细胞的同步化细胞分裂周期由分裂间期和分裂期(M)经成，细胞分裂的发生是随机的，并不

26、是人们设想的那样从某一点同时开始步调一致地完成分裂周期的各个时期，因此，一个培养体系中的细胞将会是由处于不同分裂时期的细胞组成，即是不同步的，这对于细胞分裂和代谢机制研究、大规模培养细胞来生产次生代谢产物都是不利的，这些研究和生产都要细胞分裂同步或基本同步。为了使培养细胞同步化，进行了各种尝试，包括物理的和化学的方法，物理方法主要是通过对细胞的物理特性(细胞或细胞团的大小)和生长环境条件(光照、温度等)进行控制，实现细胞的同步化如按细胞团大小进行选择和分别培养及低温休克方法。化学方法是使细胞受到某种营养饥饿或是用某种因素抑制细胞分裂，这就是所谓的饥饿法和抑制法。（1）饥饿法 这种方法是在培养过

27、程中先停止供应细胞分裂所必需的种营养物质或激素，使细胞停止在G1或G2期，经一段时间饥饿后，向培养基重新加入这种限制因子，静止的细胞就会同步进入分裂。如在长春花细胞悬浮培养中，先使细胞受到磷酸盐饥饿4d，然后转移到含磷酸盐的培养基中，获得了同步化。 (2)抑制法 使用DNA合成抑制剂如5氨基尿嘧啶、羟基脲、胸腺嘧啶脱氧核苦，使细胞内DNA合成受到抑制，细胞分裂只能进行到Gl期，细胞都停在G1和s期的边界上，当把这些抑制剂去掉后，细胞即进入同步化分裂。不过用这种方法取得的同步性只保持一个细胞周期。3. 培养细胞的密度及生活率的测定(一)起始密度的决定 培养细胞的密度一般在104105个mL之间为

28、宜，具体密度视细胞体积的大小和试验培养的效果而定。密度的计算可采用上梅医用光学仪器厂生产的血球计进行。（二）活细胞百分率的测定单离细胞并不全是活的，通常只有60以上的活细胞。活细胞百分率的测定有助于评价细胞质量，同时对以后的培养效率有较正确的估计。测定方法是：先以培养液为溶剂配制o1的酚藏花红和用丙酮配制5mgmL的二醋酸酯荧光素，贮于冰箱。使用时把萤光素稀释至0.01后，使其与细胞在载玻片上混合。滴一滴o1的酚藏花红染色液于载片上后，即盖上盖玻片。在显微镜下，被染上红色的是死细胞，而活细胞木染色。由此可以计算出活细胞的百分率q经1530分钟后，还可在萤光镜下观察、计数。活细胞会在荧光素作用下

29、发茧光，死者则不会。(三)植板率的测定用平板培养的需统计植板车，即每个平板接种细胞总数中形成细胞团的百分串。汁算公式为：植板率%=细胞团数/接种细胞总数*100%其中，每平板接种细胞数每毫升培养液中的细胞数目该平板细胞培养液的毫升数二、次生代谢物的生产工业化植物细胞培养系统主要有两大类：悬浮细胞培养系统和固定化细胞培养系统。前者适于大量快速地增殖细胞，但往往不利于次生物质的积累；后者则相反，细胞生长缓慢而次生物质含量相对较高。（一）悬浮培养系统液体悬浮培养系统基本原理与上述实验室悬浮培养方法一致，但大规模培养所采用的设备及控制技术比实验室小规模培养要复杂的多。冘 机械搅拌式培养系统机械搅拌式生

30、物反应器通常是在微生物发酵罐的基础上改进设计的，根据植物细胞的特性，其设备要求在微生物发酵罐的基础上作如下改进：搅拌装置要减少剪切，一般改叶轮式为螺旋式；因为植物细胞生长周期长，需要随时补充水分和营养，因此必须设计加液装置；由于植物细胞的生理活动需要新鲜空气，且细胞代谢也可能产生有害气体，所以必须设计通气装置； 为便于取样观察，一般还设计有取样口。冘 气压搅拌式培养系统考虑到机械搅拌式反应器的剪切作用难以避免，同时搅拌器转动的中轴往往是容易使培养物污染的部位，因此，发展出空气提升式生物反应器，但其缺点是搅拌不均匀。冘 旋转式培养系统一般用于产品中试或某些必需裂解细胞才能获得目的产物的培养，其优

31、点是控制精确，处理灵活，缺点是培养体积较小。Tulecke和Nickell（1959）推出了一个20L的植物细胞封闭式悬浮培养系统（图3-1）。该系统由培养罐及四根导管连通辅助设备构成。经蒸汽灭菌后接入目的培养物，以无菌压缩空气进行搅拌。当营养耗尽，细胞数目不再增加且次生物质达一定浓度时，收获细胞，提取产物。他们用此系统成功地培养了银杏、冬青、黑麦草和蔷薇等细胞。结构简单，易于操作是本系统的突出优点。但它的生产效率不够高，次生物质累积的量也较少。（二） 固定化细胞培养系统针对上述细胞悬浮培养的缺点，Brodelius等（1979）首次报道了用藻酸钙成功固定培养橘叶鸡眼藤、长春花、希腊毛地黄细胞

32、。实验证明，细胞分化和次生物质积累之间存在正相关性。细胞固定化后的密集而缓慢的生长有利于细胞的分化和组织化，从而有利于次生物质的合成。此外，细胞固定化后不仅便于对环境因子的参数进行调控，而且有利于在细胞团间形成各种化学物质和物理因素的梯度，这可能是调控高产次生物质的关键。这一技术的优点在于：冘 细胞的缓慢生长。由于初级代谢和次级代谢注往对前体存在着竞争，细胞生长快速时，初级代谢占优势，而细胞生长缓慢时，次级代谢占优势，故固相化的细胞生长缓慢导致次生代谢物产量增高。冘 可以较容易地控制培养系统的理化环境，从而可以研究特定的代谢途径，并便于调节；冘 细胞位置的固定使其所处的环境类似于在植物体中所处

33、的状态，相互间接触密切，可以形成一定的理化梯度，有利于次生产物的合成；冘由于细胞留在反应器中，新的培养基可以再次利用这些细胞生产初生产物，从而节省了生产细胞所付出的时间和费用；冘便于次生代谢物的收集 由于细胞固定在一定的介质中，并可以从培养基中不断提取产物，因此，它可以进行连续生产。细胞固定化培养技术按照其支持物不同可以分为两大类：冘 包埋式固定化培养系统：支持物多采用琼脂、琼脂糖、藻酸盐、聚丙烯酰胺等；冘 附着式固定化培养系统：支持物采用尼龙网、聚氨酯泡沫、中空纤维等材料。细胞固定化是将细胞包埋在惰性支持物的内部或贴附在它的表面。其前提就是通过悬浮培养获得足够数量的细胞。常见的固定化细胞培养

34、系统有以下两大类：（1）平床培养系统 本系统由培养床、贮液罐和蠕动泵等构成（图3-2）。新鲜的细胞被固定在床底部由聚丙烯等材料编织成的无菌平垫上。无菌贮液罐被紧固在培养床的上方，通过管道向下滴注培养液。培养床上的营养液再通过蠕动泵循环送回贮液罐中。本系统设备较简单，比悬浮培养体系能更有效地合成次生物质（表3-2）。不过它占地面积较大，累积次生代谢物较多的滴液区所占比例不高；而且在这密闭的体系中氧气的供应时常成为限制因子，经常还得附加提供无菌空气的设备。（2）立柱培养系统 本方法将植物细胞与琼脂或褐藻酸钠混合，制成一个个12cm3的细胞团块，并将它们集中于无菌立柱中（图3-3）。这样，贮液罐中下

35、滴的营养液流经大部分细胞，亦即“滴液区”比例大大提高，次生物质的合成大为增强，同时占地面积大为减小。在立柱培养系统中，由于细胞被固定化，因此应尽可能选择那些次生物质能自然地或经诱导后能逸出胞外的细胞株系。此外，为了提高次生物质的产量，还应注意：要选用高产细胞株系。在营养液中加入目的产物的直接或近直接前体物质，往往对增产目的产物有特效。对各类细胞的培养都应反复摸索碳源、氮源和生长调节物质的配比，找出最佳方案。适量光照及通气在多数情况下有利于产物的生成。三、细胞培养生产有用物质利用植物细胞培养生产有用物质，与栽培植物相比，有种种优点，但是，植物细胞生产次生物质还存在许多问题，它与微生物培养系统具有

36、很大不同：1)植物细胞培养时，其生产速度较慢。通常微生物的工业发酵生产只需要几天，便可完成发酵生产全过程。而植物细胞培养至少需要3周，一般要45周才能完成一次生产周期。虽然，随着细胞培养技术的改进，其生长速率不断提高，但生产效率仍落后于微生物生产。2)植物细胞培养生产次生代谢物的总量一般要比植株低。通常未经筛选的外植体，次生物质的合成与积累比亲本少的原因，主要是离体培养中，高产植袜的外植体，大多数细胞没有合成和积累所期望的化合物，这与微生物大不相同，而仅少数细胞能够产生浓度与整体植株的细胞相等。当然也有少数变异细胞与微生物突变系一样，会产生比亲本细胞更高的次生物质。3）生产技术上还存在一些问题

37、。植物细胞壁与微生物不同，较脆，在振荡培养中，容易因搅拌而破碎；培养过程需要复杂的培养基及附加物，又极易遭受真茵的污染；次生物的产量不甚稳定等，因此成本较高。细胞培养生产有用物质的一般程序：1.选材 在开展细胞培养生产有用物质的选材时，应注意以下先决条件：(1)药效肯定；(z)对其有效成分有充分的了解；(3)有测定有效成分相约理的可靠方法；(4)市场短缺或价格贵重。上述诸条件对随后的研究开发将带来许多方便。例如：人参是我国传统的名贵药材国内外对其有效成分和药理研究较多。它具有补元气，安神益智等药效，其药效成分为皂角贰等，对其药理也有一定的测定方法：而且，人参栽培困难，产品短缺，价格贵重。因此，

38、开展人参的细胞培养生产有用物质就很有前途。取材应取有药效成分的部位，且该部位较易形成愈伤组织，例如人参药效以根部较佳，但其形成愈伤组织的能力较差；茎和叶柄既有一定的有效成分，又有较好的形成愈伤组织能力，是较合适的材料。2.细胞株系建立 将诱导产生的愈伤组织分离建立悬浮细胞繁殖体系。为了实现细胞培养工业化产品质量，对纫胞株系的选择有两个基本要求，即有用物质的合成积累能力强和生长速度快的细胞株。因此，在培养过程中，要不断对培养细胞进行分析，检测其生化合成某些有效物质的能力，筛选合成能力高的细胞株，不断更新培养的细脑株系。3.大量培养 将选出的优良细胞株扩大繁殖后，即可作为细胞工厂化培养的生产“种子

39、”。采用成批的、半连续或连续的培养系统，对这些“种子”进行大量培养。4.产品提取与纯化 从植物细胞培养物产提取和纯化有用的产品.四、若干有用物质的生产1.生物碱 2.苷类物质 3.醌类物质 4.酶制剂 5胰岛素 6色素 思考题1一个好的悬浮细胞系有哪些特征？用于建立悬浮细胞系的愈伤组织有何要求？2建立悬浮细胞系的关键技术有哪些？3悬浮细胞系在继代培养中其群体生长规律。4细胞大规模培养有哪些培养系统？5植物细胞规模培养与次生产物生产前景及需要研究解决的问题。第三章 植物细胞原生质体制备与融合【课时安排】1.1 原生质体的制备 25分钟1.2原生质体培养 25分钟1.3原生质体的融合 25分钟1.

40、4杂合体的鉴别与筛选 25分钟 总计 2学时【掌握内容】1基本概念：原生质体2. 原生质体的制备。3原生质体培养4原生质体的融合5.杂合体的鉴别与筛选【了解内容】植物细胞原生质体制备与融合意义。【教学难点】1. 原生质体的融合方法。2. 杂合体的鉴别与筛选。【教学目标】1.能够对原生质体的融合方法进行分析比较。2.能够区分杂合体的鉴别与筛选各种方法。【教学内容】一、原生质体的制备 在植物组织里，原生质体被坚硬的细胞壁包裹着，而且由于果胶质等使细胞相互紧紧粘连在一起。在愈伤组织中，这种粘连相对松些；在细胞悬浮培养物中，只有存在细胞团的情况下，有轻度的粘连。如果破除这种粘连作用，即可使细胞分离开来

41、，进一步去除细胞壁，就能使裸露的原生质体游离出来。游离效率的高低主要与植物材料和酶混合浓的组成有关。（1）取材与除菌 原则上植物任何部位的外植体都可成为制备原生质体的材料。但人们往往对活跃生长的器官和组织更感兴趣，因为由此制得的原生质体一般都生活力较强，再生与分生比例较高。常用的外植体包括：种子根、子叶、下胚轴、胚细胞、花粉母细胞、悬浮培养细胞和嫩叶。对外植体的除菌要因材而异。悬浮培养细胞一般无需除菌。对较脏的外植体往往要先用肥皂水清洗再以清水洗23次，然后浸入70酒精消毒后，再放进3次氯酸钠处理。最后用无菌水漂洗数次，并用无菌滤纸吸干。（2）酶解 现以叶片为例说明如何制备植物原生质体。配制酶

42、解反应液：反应液应是一种pH值在5.55.8的缓冲液，内含纤维素酶0.33.0以及渗透压稳定剂、细胞膜保护剂和表面活性剂等。酶解：除菌 绿反应液转绿是酶解成功的一项重要指标，说明已有不少原生质体游离在反应液中。经镜检确认后应及时终止反应，避免脆弱的原生质体受到更多的损害。（3）分离 在反应液中除了大量的原生质体外，尚有一些残留的组织块和破碎的细胞。为了取得高纯度的原生质体就必需进行原生质体的分离。可选取200400目的不锈钢网或尼龙布进行过滤除渣，也可采用低速离心法或比重漂浮法直接获取原生质体。（4）洗涤 刚分离得的原生质体往往还含有酶及其他不利于原生质体培养、再生的试剂，应以新的渗透压稳定剂

43、或原生质体培养液离心洗涤24次。（5）鉴定 只有经过鉴定确认已获得原生质体后才能进行下阶段的细胞融合工作。由于已去除全部或大部分细胞壁，此时植物细胞呈圆形。如果把它放入低渗溶液中，则很容易胀破。也可用荧光增白剂染色后置紫外显微镜下观察，残留的细胞壁呈现明显荧光。通过以上观测，基本上可判别是否原生质体及其百分率。此外，尚可借助台盼蓝活细胞染色、胞质环流观察以及测定光合作用、呼吸作用等参数定量检测原生质体的活力。二、原生质体培养1、培养基 不同来源的原生质体有不同的营养需求。一般来说原生质体培养基的基本成份与培养细胞的培养基成份相似，只是添加了渗透压稳定剂。常用的基本培养基是MS。但MS配方里的铵

44、态氮含量对许多植物的原生质体来说显得太高，甚至有毒害作用，可以降低其至12或14强度，另加氨基酸类。2、培养方法各种培养单细胞的方法均适用于原生质体的培养。由于原生质体的产率往往较高，故常用液体浅层培养和平板培养这两种方法，而不需用其他更为复杂的方法。但后来发展起来的一种固体和液体相结合的方法效果似乎特别好。这种方法是将原生质体混于琼脂糖中制成乎板，把平板切成小块，转移到液体培养基中，在振荡器上混合振荡培养。此法兼具固体培养和液体培养的优点。对此法再加改进，将原生质体悬液与琼脂糖培养基混合后，逐滴地满在平皿底面上*待凝固后在其周围加入液体培养基，还可在液体培养基中加入经辐射的细胞，兼具了饲喂层方法的特点。原生质体的培养密度可为l05个mI，左右。通常用直径6cm的培养皿，每皿培养量以3mL为适宜，太多通气差，太少液体易挥发光。尽管在培养皿上下盖之间加石腊膜或用透明胶封住，但由于培养室温度比较高，即使每皿装3mL培养基的情况下，挥发仍快，故最好把培养皿放人能较好保持湿度的有机玻璃等盒子中。由于原生质体培养再生植株难度比较大，在培养某种植物原生质体时，不但需要借鉴前人的经验，也须自己根据研究对象的培养中出现的情况探索出有效的办法。三、原生质体的融合 也称体细胞杂交，就是使分离下来的不同亲本的原生质体之间在人工控制的条件下，像性细胞受精作用