吴博—毕业论文教案资料.doc

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1、Good is good, but better carries it.精益求精，善益求善。吴博毕业论文-小麦K型不育系育性恢复基因的cDNA-AFLP分析吴博（农学院农学专升本2012-2班）摘要：采用优化的cDNA-AFLP体系，对小麦K型不育系豫麦3号及其相应的保持系以及两个恢复基因近等基因系BC9F2在小麦二核花粉时期的基因表达谱进行了分析。通过120对引物筛选，产生10757个转录本(TDF)，用26对引物检测到53个差异TDF。经大规模克隆、测序分析，最终获得35个差异TDF。经Blastx比对和功能分类分析，其中23条TDF与NCBI有序列同源性，功能主要涉及细胞和组织代谢、转录

2、因子、胁迫相应、转录促进、表达调节以及混合功能等；3条TDF与未知功能蛋白同源性较高；其余9条TDF未找到同源性匹配，可能是一些新基因。通过对功能已知的基因分析，推测吲哚乙酸合成酶与脯氨酰胺合成酶可能与花药育性恢复的过程相关。关键词：小麦；K型不育系；育性恢复基因；近等基因系；cDNA-AFLP；差异表达基因IdentificationofrestorergenesofK-typeCMSinwheatbycDNA-AFLPWu-Bo(Agriculture2012-2ofAgronomyCollege）ABSTRACT:OptimizedcDNA-AFLPanalysiswasemployed

3、toidentifygeneexpressionprofileofK-typesterilelineYumai3anditsmaintainerlineandtwoNILsofrestorergenesBC9F2duringtheirdicaryophaseofantherdevelopment.Afterthe120pairsofprimerscreened,theresultsshowedthat10757transcript-derivedfragments(TDFs)existedbetweenthematerials,and53(4.9%)discrepantTDFswasdetec

4、tedby26pairsofprimer.Afterlargescalecloningandsequencing,eventually35differentTDFsobtained,andallofthemwereextendedbyelectronicmethod.BymeansofBlastxcomparisonandfunctionalclassificationanalysis,23TDFsofthemhavesequencehomologywithNCBI,andtheirfunctionmainlyrelatestocellandtissuemetabolism(37.1%),tr

5、anscriptionfactor(8.6%),Stresscorresponding(5.7%),transcriptionpromoting(5.7%),regulationofgeneexpression(5.7%)andmixedfunction(29%);3(8.6%)TDFsarehighlyhomologywithunknownfunctionproteinwhile9TDFs(25.7%)donotshowsignificantmatchestoanygenesintheGenedatabase.theymaybenewgenes.Byanalyzingthefunctiono

6、fknowngenes,presumably,indoleaceticacidsynthetaseandpreservedammoniaamidesynthetasemaybeassociatedwiththeprocessofantherfertilityrestoration.Keywords:wheat;sterilelinewithAe.kotschi;restorergene;near-isogenicline;cDNA-AFLP;differentialexpression小麦是我国第三大粮食作物，也是世界上种植范围最广的粮食作物。随着全球人口剧增，人类对小麦的需求量也呈增长趋势。

7、因此，培育高产小麦新品种已经成为当前小麦育种的迫切要求1-3。杂种优势的利用能大幅度地提高小麦单产水平，充分发掘小麦产量的遗传潜力，是未来小麦单产瓶颈突破的重要方法4-6。杂种优势是生物界的一种普遍现象，在全球重要农作物如玉米、水稻、油菜、大豆中都已取得了举世瞩目的成就7-13。小麦和其它作物一样，也具有明显的杂种优势14-16，杂交小麦在诸多重要性状如长势、产量、抗性等方面，均要优于其亲本17-19。经过数十年的不断探索，目前已形成了多途径利用小麦杂种优势的现状20-27，尽管杂交小麦至今未能在生产上大面积应用，但在理论和技术方面取得了较大的研究进展，为推动未来杂交小麦的大面积种植奠定了基础

8、28-29。在生产上大规模推广应用的不育系必须具有显著的杂种优势潜力，而K型不育系杂种存在明显的杂种优势。范濂等30研究发现K型杂交小麦在群体产量方面比普通小麦具有极显著增加，而且K型杂交小麦的恢复系具有高恢复性，不育系具有易恢复性。张改生等31通过研究得出：K型不育系杂种F1在每穗小穗数、千粒重、每株穗数、单株生产力等方面具有显著的杂种优势。高庆荣等32通过对7个杂交组合的研究发现，K型杂交小麦的单株产量具有很强的杂种优势。由此可见，K型杂交小麦具有明显的杂种优势，在生产上有极好的应用前景。K型不育系具有恢复源广的优点，但恢复性高的品种或材料却并不多，这对K型杂交小麦在生产上应用造成限制，因

9、此选育恢复度高的恢复系已成为K型杂交小麦能够走向生产的重要内容，而对育性恢复遗传机制的研究是选育优良恢复系的前提。小麦K型雄性不育是利用小麦杂种优势的重要途径之一，它具有细胞质副效应小、既易保持又易恢复等优点，但是也存在着育性恢复度不高且不稳定的缺陷，直接制约了K型不育在生产上的利用。因此，搞清小麦K型不育系的育性恢复机理有助于选育恢复度高而稳定的优良恢复系。大多数研究表明，小麦K型不育系育性恢复是由主效基因和微效基因共同作用的，不育系中还存在易恢性基因33。K型不育系的育性恢复基因目前已进行了大量研究，Mukai和Tsunewaki认为小麦K型雄性不育系的育性恢复受1个显性基因Rfk1控制，

10、并将其定位于1BS染色体上36；孙兆全等37通过对高恢复力的恢复系研究发现，K型不育系的育性恢复受2对恢复基因控制，且这2对恢复基因具有剂量效应。刘保申等38研究认为小麦K型不育系的恢复材料均含有1对主效显性恢复基因和众多微效恢复基因。范濂等39研究认为，高恢复力的恢复系具有2个主效基因，且恢复系受环境影响小，中部结实率高。刘曙东等40通过对分离世代的植株进行4种类型的划分，得出小麦K型不育系的育性恢复受2对非等位基因控制且这两对基因的显性作用都不完全的结论。本课题组还从小麦品种豫麦2号中发现了一个新的恢复基因，初步定位在2BL染色体上，并找到2个与该基因连锁的SSR标记cfd267和Xgwm

11、526，进一步研究发现该基因的效应小于Rfv1基因，携带两对主效基因的恢复系能够很好恢复其育性34-35。然而对于育性恢复的研究，目前大多集中于恢复基因的SSR标记定位，而细胞信号的转导、传递、基因转录与调控的分子机制等方面，还处于空白状态。所以，对育性恢复的细胞机制、分子机制的阐明还有待于进一步的深入研究。cDNA-AFLP是Bachem等结合RT-PCR和AFLP两种技术提出分析基因差异表达的一种有效方法41-42。该技术具有反应条件严谨、退火温度高、重复性好等特点，已经被广泛用于基因表达差异研究。因此，本研究以二核花粉时期的豫麦3号不育系及其保持系的花药和以豫麦3号不育系为背景的2BL染

12、色体上恢复基因近等基因系的花药为研究材料，利用cDNA-AFLP技术对小麦花药发育过程中基因表达进行分析，并用基因比对方法鉴定其可能的生物学功能及其类别，进一步探讨小麦K型不育系恢复基因的生物学功能，旨在为进一步揭示小麦K型不育系的恢复机理奠定基础。1材料与方法1.1试验材料试验材料为K型不育系豫麦3号及其保持系和两个以豫麦3号不育系为背景构建的2BL染色体上恢复基因近等基因系BC9F2，分别为NILR-1和NILR-2，恢复基因供体恢复系为豫麦2号，以豫麦2号与K豫麦3号作为亲本杂交，并在回交后代中筛选具有恢复性的子代单株与K豫麦3号反复回交9代，从而获得含有恢复基因的近等基因系。2011-

13、10种植在河南农业大学科教试验园区，2012-4取材。1.2小麦K型不育系育性恢复基因的cDNA-AFLP分析121样品总RNA提取和双链cDNA的合成参照产品说明书，用TRIzol试剂盒(Invitrogen)提取各材料的总RNA。经过琼脂糖变性胶进行总RNA浓度和质量检测后，利用双链cDNA合成试剂盒(TaKaRa产品)合成双链cDNA。12.2双链cDNA纯化浓缩、限制性双酶切和接头连接采用苯酚氯仿异戊醇(25：24：1)溶液纯化双链cDNA，无水乙醇沉淀后浓缩，加适量的灭菌蒸馏水，依据A260值将对照和各种低磷处理的双链cDNA含量调整至相同浓度。常规方法进行MseI和PstI限制性双

14、酶切。其后，在反应体系中加入1uL的T4DNA连接酶，PstI接头和MseI接头各1uL，以及1uL10T4连接酶缓冲液，进行接头连接。其中，MseI接头序列为5-GACGATGAGTCCTGAG-3(正向)和5-TACTCAGGACTCAT-3(反向)；PstI接头序列为5-CTCGTAGACTGCGTACATGCA-3(正向)和5-TGTACGCAGTCTAC-3(反向)。12.3cDNA-AFLP预扩增和选择性扩增参照Bachem等的方法，将完成限制性双酶切和连接接头的产物进行预扩增。预扩增反应的热循环程序为95下2min，随后为30个循环过程，每个循环中包括95变性30s，56退火30

15、s和72延伸1min。完成后将预扩增产物于4保存。其中，用于预扩增反应的引物为M00(5-GATGAGTCCTGAGTA-3)和P00(5-AGACTGCGTACATGCAG-3)，分别与MseI和PstI的接头序列相匹配。选用12条M引物和l5条P引物进行选择性扩增。其中，l2条M引物分别与MseI的预扩增引物匹配，15条P引物分别与PstI的预扩增引物匹配。但上述引物的3-端较预扩增引物均增加3个随机碱基。每条M引物分别与P引物进行组合，共有180个引物对组合。用于选择性扩增的M引物和P引物如表1所示。cDNAAFLP的选择性扩增程序为95下5min后进行13个下述热反应循环；95变性30

16、s，65退火30s，72延伸60s；95变性30s，56退火30s，72延伸60s，24个循环；72保温10min。不同材料的各引物组合均重复3次。1.2.4聚丙烯酰胺凝胶电泳：(1)扩增DNA变性在扩增产物中加入5lL变性剂，94变性5min。4冰箱保存。变性剂：98%甲酰胺49mL(100%)，10mMEDTA(pH=8.0)1mL(0.5MpH=8.0)，0.25%溴酚兰0.125g，0.25%二甲苯青0.125g。(2)电泳准备玻璃板清洗与组装：首先用清水将玻璃板进行反复清洗2遍并晾干，然后用酒精均匀擦拭1遍，待晾干后在通风橱中在凹板上涂上5mL10%的剥离硅烷（RepelSilane

17、）并晾干；在平板上涂上0.5%亲和硅烷（BindingSilane），0.5%亲和硅烷要现配现用。涂板时要防止两块板之间相互污染。待两块板彻底干燥后开始进行组装，首先将平板平放，在平板两个边缘放上压条，再将凹板平放于平板之上（涂有硅烷面向里），最后用夹子对称夹紧固定。配胶：80mL6%PA胶中加入10mLTEMED和3mL10%过硫酸铵，混匀后立即灌胶。40%PA胶母液制备：丙烯酰胺（Acrilamide）380g，甲叉双丙烯酰胺（Bis-acrilamide）20g，10TBE定容至1000mL，过滤后置于室温备用6%PA胶配置：40%PA胶母液300mL，10TBE200mL，尿素840g

18、。搅拌溶解后，加蒸馏水至2000mL，过滤后置于室温备用。10TBE的配制：Tris-base108g，硼酸55g，Na2EDTA2H2O7.44g，加蒸馏水至1000mL。0.5%BindingSilane：3mL95%的乙醇加入15uL冰乙酸和15uL亲和硅烷。10%过硫酸铵（AmmoniumPersulphate）：超纯过硫酸铵2g，蒸馏水定容至20mL，溶解后，分装于1.5mL的离心管中，4避光保存。灌胶：将制好的玻璃板呈45度倾斜放置，然后将新配好的6%PA胶沿玻璃板凹槽边缓慢连续灌进板中，防止有气泡产生。待板中灌满胶后，将板平放并迅速倒插入梳子，用夹子将梳子夹紧使其固定。静置使胶聚

19、合40min。(3)扩增产物的电泳待胶凝固后，取出梳子，将板上残留物洗净擦干，然后将板固定在电泳仪上。接着在电泳槽的上下槽注入电极缓冲液1TBE(用10TBE稀释)。预电泳：在恒定功率50W下预电泳2030min。用胶头吸管反复冲洗胶面上沉淀的尿素和气泡，之后插入梳子，梳子刚触到胶为最好。电泳：用微量加样器加入经变性的扩增样品5L，恒定功率50W电泳至溴酚蓝到底部，关闭电源。电泳结束后，放出电泳缓冲液，卸下玻璃板。12.5差异条带DNA再次PCR扩增和克隆从聚丙烯酰胺凝胶上切下重复间稳定一致的差异条带，以96处理10min。12000g离心20min后，吸取上清液1L作为再次PCR扩增反应的模

20、板。PCR反应体系及程序与前述选择性扩增相同，其中，各TDF再次扩增时选用的引物，与cDNAAFLP中鉴定该特异表达TDF的引物一致。PCR产物经1.0琼脂糖凝胶电泳检测后，与pMD19-T载体(上海sangon)连接，转化感受态大肠杆菌菌株DH5。菌液PCR无误后测序(上海Sangon)，获得TDF序列。1.2.6差异表达序列的生物信息学分析利用NCBI官方网站(网址：http:/www.ncbi.nlm.nih.gov/)等数据库中的BLAST工具与GenBank的dbEST数据库和蛋白数据库，进行特异表达基因同源性比较和功能分析。2结果与分析2.1与小麦K型不育系恢复基因表达相关的差异片

21、段的cDNA-AFLP分析利用120对P/M引物组合研究了不育系、保持系和恢复基因近等基因系在二核花粉时期的基因表达变化,通过聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，共观测到10757条清晰条带，平均每一对选择性引物可以获得约24.1条带(图1)。22对引物能够在近等基因系NILR-1、NILR-2和不育系豫麦3号及其保持系之间扩增出53条差异条带，成功回收了35条差异条带,扩增片段长度大多在100400bp(图2)，这其中既存在有或无带的差异,也有转录产物量的差异。恢复系植株中产生的带纹数要多于不育系和保持系，同时恢复系植株基因的转录量也要大于不育系和保持系植株的转录量。不育系和保持系中产生带纹数少的原因可

22、能与花粉发育过程中控制育性恢复的基因未表达有关。1.NILR-1；2.NILR-2；3.豫麦3号；4.K豫麦3号1.NILR-1；2.NILR-2；3.Yumai3；4.K-typesterilelineYumai3图1近等基因系、不育系和保持系的cDNA-AFLP的电泳结果Fig.1AmplifiedproductofNILlines、sterilelinesandmaintainerlinesM.Marker(DL2000);N.阴性对照;128.部分差异TDFs回收后二次PCR.M.Marker(DL2000);N.negativecontrol;128.partsof2ndPCRofd

23、ifferenceTDFs.图2部分差异TDFs回收后二次PCR的电泳结果.Fig.22ndPCRofpartsofdifferenceTDFs.2.2差异TDFs克隆、测序及同源性分析将回收纯化成功的35条特异性片段与pMD19-T载体连接，经过转化后挑取阳性克隆进行测序，并将测序结果进行电子延伸。将电子延伸结果提交GenBank，在NCBI官方网站(网址：http:/www.ncbi.nlm.nih.gov/)通过Blast检索，结果(表2)表明，与已知基因有同源性的片段有23条，约占测序数的65.7，编码未知功能蛋白的片段有3条，约占8.6，另有9条片段与已知基因或序列无任何同源性，可能

24、是尚未发现的新基因。35个TDFs中有25个只出现在近等基因系中出现，有10个只在保持系和不育系中出现，有1个在所有材料中都出现但在近等基因系中表达量高。表明小麦K型不育的育性恢复过程中既受恢复基因的控制，也受抑制基因和其他微效的调控影响。2.3差异TDFs功能分类在35个能通过BLAST方法确定具体功能的差异TDFs中，包含有转录因子、胁迫响应、细胞和组织代谢、转录促进、表达调节、混合功能、未知功能以及无同源性等类型。表明小麦K型不育的育性恢复过程需要各种类型的酶系参与，育性恢复的机理包括复杂的信号通路和生理生化代谢途径。35个TDFs涉及众多方面的功能，其中与P1M3-1同源性较相似的是二

25、穗短柄草(Brachypodiumdistachyon)中的吲哚乙酸氨基化合成酶（indole-3-aceticacid-amidosynthetase），在近等基因系中特异表达。小麦不育系穗和花药中IAA含量不足或亏损，能导致小孢子败育，引起雄性不育的发生4344，而吲哚乙酸氨基化合成酶能诱导IAA正常合成，很可能与K型不育系的育性恢复相关。P8M11-1与一种细胞色素单氧酶同源，该酶与电子载体活性、血红素（亚铁血红素）结合、铁离子（铁离子）结合、单加氧酶的活性、氧化还原酶（氧化还原酶）的活性调节相关。许多研究发现不育系花药中琥珀酸脱氢酶、磷酸化酶、脂酶、细胞色素氧化酶、氧化还原酶、苹果酸脱

26、氢酶以及过氧化物酶的活性均较正常可育的低，且其组分比正常可育的少，认为酶活性的降低阻碍了代谢的正常进行，从而导致不育，因此该酶与育性恢复的关系还需进一步的研究。P9M1、P9M2的同源基因有众多的功能，它与节节麦（Aegilopstauschii）的LRR类受体丝氨酸/苏氨酸-蛋白激酶很相似，但P9M1只在不育系和保持系中特异表达而P9M2则只在恢复系中特异表达。P1M3-2和P2M4-2的基因库对比产物功能相同，分别是节节麦（Aegilopstauschii）和拟南芥（Arabidopsisthaliana）中的钙调蛋白，已知钙调蛋白是一个有多种作用蛋白，是细胞内Ca2+信号受体中最重要的一

27、种，参与多种生理活动的调节。P4M10与小麦线粒体基因高度同源，线粒体基因与雄性不育有很大关系，小麦K型不育系及相应保持系在线粒体DNA上有较明显差异。此外，小麦雄性不育也可能与mtDNA的重组或重排有关。因此，深入研究小麦mtDNA将对育性恢复机理研究有重要作用。P1M3-3与节节麦（Aegilopstauschii）的脯氨酰-tRNA合成酶高度同源，且只在近等基因系中特异表达。研究发现不育花药中氨基酸的总含量和多数含氨基酸的物质含量都高于同核保持系，其中差异最显著的是天冬氨酸和脯氨酸（Pro），其中前者不育系比保持系高，后者则相反，不育系花药中的游离脯氨酸缺乏，必然使新陈代谢紊乱，从而导致

28、雄性不育45。而脯氨酰-tRNA合成酶在蛋白质合成过程中把脯氨酸连到tRNA，在蛋白质合成中不可缺少。鉴于脯氨酰-tRNA合成酶的作用，该基因很可能在花粉二核期的花药中表达，从而影响花药的蛋白质合成，与育性恢复相关。3结论与讨论3.1利用cDNA-AFLP技术研究小麦K型不育系的育性恢复基因小麦K型恢复系的恢复力不仅受恢复系中恢复基因的控制，还受到恢复系中修饰基因或抑制基因的影响。不少学者还发现不同群体中可育株的育性也存在较大差异，可以推测恢复系中存在着对育性恢复基因的表达有影响的修饰基因或抑制基因33-35。张改生等31提出了恢复系中4种育性基因的组成模式，即主效恢复基因+微效可育基因(C1

29、)、主效恢复基因(C2)、主效恢复基因+育性抑制基因(C3)和微效可育基因(C4)，这4种组成模式决定了恢复系的恢复力。此外，在不育系中还存在着易恢性的主效和微效基因。说明小麦K型不育系的育性恢复是很复杂的，但是到目前为止，这些基因特别是微效基因和易恢性基因还没有定位研究结果来证实。本研究选用小麦K型不育系及其相应的保持系以及具有不育系遗传背景的恢复基因近等基因系作为研究材料，通过提取二核花粉时期的花药总RNA，利用cDNA-AFLP方法来检测了恢复基因表达差异，通过120对引物组合的扩增,筛选得到了22对能够在小麦恢复系和不育系、保持系之间揭示出多态性的引物，多态性引物检出率为21.7，此研

30、究结果不仅表明了cDNA-AFLP技术在目的基因研究上的可用性，也表明小麦K型不育的恢复机理是一个综合的、受多种生理生化过程调节的复杂过程。在本试验中，扩增结果分析发现存在几种不同类型的差异表达片段。如仅在近等基因系的材料中出现，而在不育系和保持系的材料中缺失的条带；仅在不育系和保持系的材料中存在，而在近等基因系中不出现；在两类材料中都出现且强弱不同。其中仅在近等基因系中出现的条带可能是在小麦K型不育系的育性恢复中起重要作用的基因片段，可作为下一步研究的重点。本研究中得到了一些此种类型的差异条带，仅对这些差异片段的表达模式有了初步的了解，还需比较一系列不同材料差异片段的表达情况，获得更多信息，

31、从而进一步阐明其在小麦K型不育系育性恢复过程中表达调控机制。在本研究中发现的23条能匹配到已知功能基因的TDFs中，按功能可以分成6大类，代表小麦K型不育系育性恢复过程中的部分生理生化代谢途径。结合前人研究推断有4个是与K型不育系育性恢复极为相关的蛋白（P1M3-1、P8M11-1、P1M3-3、P4M10），但还需荧光定量进一步验证。对其他片段，其编码的蛋白在小麦K型不育系育性恢复过程中可能起决定性作用，但由于这些蛋白的相关功能信息较少，只能初步推测其与育性恢复的关系，所以今后将利用这些片段进行引物设计，对不育系、保持系和近等基因系的cDNA进行扩增、测序，进一步比对扩增条带的序列差异，从而

32、对恢复基因进行克隆，并开发相应的功能标记，以更好地选育优良的K型恢复系。3.2小麦K型不育系育性恢复基因与花药育性生理生化机制的关系关于小麦K型不育系花药育性发育的生理生化机制前人已经进行了广泛研究。其中，IAA对花药小孢子的分裂生长、物质运输与积累有着重要作用，是花粉发育过程中关键的内源激素，花药组织中IAA含量不足是造成不育系花粉败育的直接原因。尽管前人对小麦K型不育系花药组织中IAA含量与花粉败育间的关系进行了详细研究，但都没有将此过程与小麦K型不育系的育性恢复基因联系起来。此外，脯氨酸在花粉代谢过程中也有着重要作用，脯氨酸能够为花粉发育、花粉管伸长提供营养，花药一旦缺乏脯氨酸将会使花粉

33、败育，导致小麦产生雄性不育。虽然前人对脯氨酸含量的变化与育性转换关系进行了详细的研究但也未与小麦K型不育系的育性恢复基因联系起来。研究小麦K型雄性不育育性的最终目的是实现杂交小麦在生产上的应用。因此不但要对不育系的不育机理深入研究，还要考虑其与可恢复性之间存在的关系。本研究选用小麦K型不育系及其相应的保持系以及具有不育系遗传背景的恢复基因近等基因系作为研究材料，通过提取二核花粉时期的花药总RNA，利用cDNA-AFLP方法对恢复基因的表达差异进行分析，分别得到了两个与花药组织中IAA和脯氨酸含量密切相关的差异表达片段P1M3-1和P1M3-3，其序列分别为吲哚乙酸氨基化合成酶和脯氨酰-tRNA

34、合成酶，都能在花药发育以及育性转换方面起到重要作用，这也表明小麦K型不育系育性恢复基因与花药育性的生理生化过程有着密切联系，为今后深入研究二者之间的关系提供了线索。致谢本文是在导师河南农业大学詹克慧教授的悉心指导下完成的。从论文设计、试验分析到论文的撰写都倾注了导师极大的心血。在试验过程中，导师针对我的不足之处及时给予启迪，开拓我的思维，使我获益匪浅。导师渊博的知识、开阔的思路、严谨认真的治学态度、勤于创新的科学精神、执著的敬业精神，给予我无限的激励和启迪，将使我终生受益，鼓舞和激励我在今后的工作和生活中不畏艰难、勇往直前。在此特向导师表示衷心的感谢!在论文撰写过程中，郑宏远师兄、邓跟望师兄、

35、张艳林师姐、韩亚利师姐、谢科军师兄以及同为实习的同学寇南海、朱宝磊、徐世民、李武超等都给予了我极大帮助和支持。在相处的这么多日日夜夜里，他们一丝不苟的实验态度和工作精神让我非常钦佩，同时也让我感受到了集体的温暖与力量。从他们身上，我学到了很多为人、处事的道理及认真的科研态度，特此表示诚挚的谢意!最后，再次向无论上文提及与否的两年来在我的生活、学习以及试验过程中给予无私帮助和支持的各位老师、同学、亲人表示最衷心的感谢和支持。参考文献1田纪春.超级小麦的概念、育种目标和任务J.山东农业科学,2004,5:18-21.2ZhuangQS,LiZS.Presentstatusofwheatbreedi

36、ngandrelatedgeneticstudyinChinaJ.WheatInformationService,1993,(76):1-15.3肖世和.中国小麦育种产业化进展C.北京:中国农业出版社,2002:34-44.4Perez-PratE,VanLookerenCM.Hybridseedproductionandthechallengeofpropagatingmale-sterileplantsJ.Trendsinplantscience,2002,7(5):199-204.5刘乐承,董德坤,曹家树.作物杂种优势机理研究进展J.湖北农业科学,2007,40(4):645-650.6

37、黄铁城.杂种小麦研究进展一问题与展望M.北京:中国农业大学出版社,1990:10-31.7孙寰,赵丽梅,王曙明,等.大豆杂种优势利用研究进展J.中国油料作物学报,2003,25(1):92-96.8曾千春,周开达,朱祯,等.中国水稻杂种优势利用现状J.中国水稻科学,2000,14(4):243-246.9许如根,吕超,祝丽,等.大麦杂种优势利用研究.F1杂种的离中亲优势和超优亲优势J.作物学报,2004,30(7):668-674.10滕文涛,曹靖生,陈彦惠,等.十年来中国玉米杂种优势群及其模式变化的分析J.中国农业科学,2004,37(12):1804-1811.11邢朝柱,靖深蓉,邢以华.

38、中国棉花杂种优势利用研究回顾和展望J.棉花学报,2007,19(5):337-345.12刘静,董振生.白菜型油菜杂种优势利用进展J.西北农业学报,2006,15(5):261-265.13王曙明,孙寰,王跃强,等.大豆杂种优势及其高优势组合选配的研究I.F1代子粒产量的杂种优势与高优势组合选配J.大豆科学,2002,21(3):161-167.14张天真.作物育种学总论M.北京:中国农业出版社,2003:144-163.15关正君,杨学举.小麦杂种优势利用研究进展J.河北农业科学,2002,12(4):31-36.16高庆荣,王大为,田纪春.超级麦育种的重要途径杂交小麦的优势利用J.山东农业

39、科学,2005,(03):11-13.17邹吉承,郑君海,王昌华,等.麦杂种优势的研究现状及应用前景J.辽宁农业科学,2000,(1):33-38.18刘雄伦,何觉民.小麦杂种优势利用途径及其研究进展J.湖南农业科学,2000,(1):9-11.19牛国阳,陈庆富.小麦杂种优势利用的现状与展望J.种子,2008,27(3):8-10.20姚景珍,张建诚,王秋叶.CHA杂种小麦国内外研究进展与现状J.现代农业科技,2006,(5):56-57.21王强,刘小宁,雷国材,等.五种小麦雄性不育系的初步研究J.麦类作物学报,2002,22(4):58-62.22许育彬,康海岐.小麦光温敏型两系法研究进

40、展J.陕西农业科学,2001,(9):28-31.23张建奎.重庆温光敏核雄不育小麦育性转换规律及不育机理研究D:博士学位论文.重庆:西南大学,2006.24徐乃瑜,严家骐.光周期敏感细胞质雄性不育小麦的研究J.武汉植物学研究,1998,16:97-105.25杜伟莉,张改生,刘宏伟,等.粘类小麦雄性不育系研究进展J.陕西农业科学,2000,(4):16-20.26詹克慧,赵鹏,吕德彬,等.K型细胞质对普通小麦主要性状的影响J.华北农学报,2004,19(2):57-61.27耿爱民,武利峰,刘渤,等.蓝矮败小麦杂种优势利用的第五途径J.山东农业科学,2010,(2):24-26.28张爱民,

41、黄铁城.小麦杂种优势利用途径与研究进展J.作物杂种,1997,(5):16-20.29张爱民,许占友.正在走向生产的杂交小麦C.第1届国际杂种小麦研讨会论文集,2001:216-222.30范濂,武耀廷,吕德彬,等.杂交小麦和小麦遗传育种研究M.北京:中国科学技术出版社,1999:168-173.31张改生,赵惠燕,吴兆苏,等.几类异质1B/1R小麦雄性不育系育性稳定性与育性恢复性的研究J.中国农业科学,1996,29(5):41-50.32刘保申,孙兰珍,高庆荣,等.K型杂交小麦恢复基因的遗传研究J.华北农学报,1999,14(2):l-5.33詹克慧,高翔,程西永,等.小麦K型不育系的易恢

42、性的差异研究J.华北农学报,2008,23(5):67-72.34詹克慧,程静,崔党群,等.小麦K型不育系育性恢复基因的遗传分析J.作物学报,2006,32(6):873-877.35詹克慧,崔党群,吕德彬,等.小麦K型不育系的易恢性及育性恢复的稳定性研究J.作物学报,2005,31(11):1490-1494.36MukaiYK,Tsunewaki.BasicstudiesonhybrdwheatbreedingJ.TheorApplGenet,1979(54):153-160.37孙兆全,杨天章,刘宏伟,等.K型1B/1R易位小麦雄性不育系的育性恢复遗传C.北京:农业出版社,1993:97

43、-92.38刘保申,孙兰珍,高庆荣,等.K型杂交小麦恢复基因的遗传研究J.华北农学报,1999,14(2):l-5.39范濂,武耀廷,詹克慧,等.小麦K型雄性不育育性恢复性能的研究J.河南农业大学学报,1998,103(3):212-215.40刘曙东,何蓓如,王忠明,等.K型小麦雄性不育体系育性恢复的遗传分析J.西北农业学报,1992,(4):27-30.41BachemCWB,HoevenRSVD,BruijnSMD,etal.VisualizationofdifferentialgeneexpressionusinganovelmethodofRNAfingerprintingbased

44、onAFLP:analysisofgeneexpressionduringpotatotuberdevelopmentJ.PlantJ,1996(9):745753.42BachemCWB,OomenRJFJ,VisserRGF.TranscriptimagingwithcDNA-AFLP:astep-by-stepprotocolJ.PlantMol.Biol.Rep,1998(16):157174.43李英贤,张爱民,黄铁成.小麦细胞质雄性不育与花药组织内源激素的关系J.农业生物技术学报,1996,12(4):307-313.44张花,何之常,徐乃瑜.不同细胞质雄性不育小麦阳离子过氧化物酶和IAA-氧化酶活性的研究J.武汉大学学报(自然科学版),1996,12(6):728-732.45李传友,孙兰珍.普通小麦T型、V型和K型细胞质雄性不育系花粉败育机理的细胞学研究J.华北农学报,1996,11(2):l-8.-