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1、Good is good, but better carries it.精益求精，善益求善。刘藏中文翻译-利用微卫星技术对狗牙根遗传图谱进行扩增摘要狗牙根品种的遗传连锁图谱使用了来自T89和T574的118个三倍体，这118个三倍体富集与表达了序列标签衍生的简单重复序列（EST-SSR）。引物来源于53个富含制造75分离标记物的EST，其中的28个可以映射到T89和T574遗传图谱。随着先前生成的标记数据，26个T89连锁群和八个T574连锁群，形成使用4.0的赔率（LOD）值。该T89和T574连锁图谱跨越1055cM和311.1cM，其中包括125和36单剂量扩增片段（SDAFs）。许多S

2、DAFs显示二体分离，因此T89可以是一个异源的四倍体。通过增加标记密度在地图上附加EST-SSR标记增值，并可以很容易地转移到其他狗牙根资源中。此外，EST-SSR标记可以立即用于评估材料的遗传多样性，确定非突变狗牙根品种，确认谱系，并从“天堂草品种衍生污染物中分化出来。百慕大既是最好的暖季型草坪草，又是优良的牧草，同时也是世界四大恶性杂草之一。通用的百慕首先被引入是在殖民时期的美国，并很快在整个美国南部蔓延。品种发行来自于Tifton，GA，是通过非洲狗牙根狗transvaalensis（2N=2X=18）与常见类型狗牙根杂交产生的不育三倍体杂交种的改良。目前其他草坪草育种计划最近开发了无

3、性改善或种子繁殖。狗牙根具有很大有利于推广和普遍使用的性状。百慕大具有耐盐、耐热和耐旱的特性，并且具有发达的匍匐茎，繁殖能力及再生能力。尽管有这么多的特质，基因控制这些特征尚未确定，仅有少数分子工具被开发。虽然狗牙根品种往往是多倍体，但基于singledose遗传连锁图谱的限制性片段框架已成功构建。SDRFs或者可作为仅在交叉父母一方染色体的单剂量扩增片段标记存在，因为SDAFs存在于1：1的配子，它们可以被用来制图在多倍体倍性水平或染色体配对。随着SDAF映射可以为每个材料分别产生一个连锁图谱。形成的四个同源四倍体是用双亲的采用155SDRFs地图。对于T574（二倍体）地图，77SDRFs

4、形成7同源集。随着T89和T574具有61和62的标记覆盖映射其基因组，分别附加标记填补缺口以及链接同源联动群体。近日，狗牙根抗性基因类似物已被识别并添加到地图。增加标记密度，需要映射的特征，如线虫宽容，根长和草坪质，这可能是两个亲本之间的不同。因此，这样做的研究目的是开发EST-SSR标记，同时可用于鉴定同源连锁群和丰富的狗牙根遗传图谱。此外，这些SSR标记是要评估一组密切相关的基因型和用于识别单一栽培种质的基因型之间差异。材料和方法W.汉纳（格鲁吉亚，蒂夫顿大学，GA）创造了T89三倍体作物群体。从狗牙根品种天堂草，JonesDwarf，FloraDwarf，Tifdwarf，老鹰草，冠军

5、，Tifway，TifwayII，TifSport和TifGrand中获得节子，获得了两次奖励。倍体分析。三倍体倍性水平得到了证实。从盆栽分离新鲜组织（0.5平方厘米）使用是双刃剃须刀切碎，加入600毫升核提取缓冲液（PARTEC，明斯特，德国）以释放核。将该淤浆倒入50毫米的过滤器并加入1.6毫升PARTECDAPI染色缓冲溶液，在PAS-流式细胞仪上用PARTEC细胞分析器对至少5000个荧光颗粒进行计数。T89和T574被用作控制因素，三倍体倍性levelwas加入T89T574，并且每个样品的F1代和未知GAP1（G1）峰的确认证实是控制在G1峰之间。简单重复序列生成。使用PureLi

6、nkDNA纯化试剂盒从118F1田间生长的个体提取DNA，根据基因型T89，对含143个SSREST的序列进行鉴定，但不通过聚合酶链反应证实。引物使用引物3的侧翼SSREST序列（见表1）。SSR扩增和荧光标记检测使用的是改进的M13尾引物法。.PCR反应总体积为在0毫升，包括2L5buffer、1L模板DNA2.5ng/L、1LMg2+2.50mmol/L、0.8LdNTP0.25mmol/L、1.0LPrimer、0.04LTaqDNA聚合酶、3.16LSterilewater。具体扩增程序为：94预变性3min，94变性30s，50-60退火1min，72延伸70s，循环39次；72延伸

7、10min，4储存以备以后使用。两微升的PCR产物是5mL蓝和0.35mL混合物并装载在6.5丙烯酰胺凝胶。凝胶图像视觉得分。遗传图谱，使用SSR分子标记技术对118个F1后代进行数据隔离，其结果被记录到一个使用Joinmap？4基因型的代码一BC1群体的一个Excel工作表中SSR标记数据与来自伯特利等的限制性片段长度多态性（RFLP）数据合并，这些标记显示偏分离，由C2确定的从映射中被排除的0.05或更低的显着性水平，分析为被排除。一个LOD4是用于分组，遗传距离是使用距离映射函数导出的扩增片段长度多态性的产生分析，用14个三倍体杂交生成的（AFLP）模板（表2）和片段的扩增片段长度多态性

8、，如前所述得到解决。多态性标记的选择性扩增引物组合如下：E-AACM-CAT,E-AACM-CTC,E-AACM-CTT,E-AAGM-CTA,EACAM-CAA,E-ACCM-CTT,E-AGGM-CAA,E-AGGMCAC,E-AGGM-CAG,E-AGGM-CAT,andE-ECGM-CAT。基因的存在或不存在，视觉是无法确定的，我们我们对加入的每个标记进行编码表示，编码为“1”表示存在一个基因，编码为“0”表示一个基因的缺失，或“9”表示缺失数据。利用相似的骰子系数成成一个所有对线之间的遗传相似性矩阵，相似性矩阵通过使用非加权类聚类分析创建了一个NTSYSpc模块。使用500引导重复的

9、软件程序FreeTree进行引导重采样（Hampl，2001年）等。多态性片段的鉴定“狗牙根草”产生的突变体和污染物。扩增产物是从设计好的53条引物组合中产生的，含一个单一样品杂交狗牙根的SSR标记，两“矮生”类型（BT1，BT3）和两个控制矮生的样品（BT2，BT4），“floradwarf，琼斯矮，冠军，“miniverde，两非类型和控制的miniverd扩增产物。三倍体品种Tifway，天堂II，tifgrand，和tifsport被扩增以及可能的离型识别。如先前所述使用NTSYSpc方案建立遗传相似性聚类分析。结果与讨论简单重复序列扩增。引物是从53条含有微卫星的序列开发出来的，（表

10、1），并产生了110个多态性标记，六条引物未能产生足够的多态性条带。这110个标记中，35号标记显示的是一个等位基因的关系，（26）或（九）574等位基因显示的是缺失的三倍体后代基因，大多数显示一个等位基因的标记，其三倍体后代很可能在三或四剂量或T89上是纯合的T574。七十五个SSR标记物的分离后代，在使用C2测试（与C20.05或更低的水平，11）时，EST-SSR标记明显偏离1:1的分离比。遗传图谱的构建许多EST-SSR标记来源于具有共显性标记亲本（15）或574（2）（表1中列出的标记）有趣的是，从这些用T89共显性标记过的二体继承（图1）无杂F1代中，看到了15号标记，除了个别B1

11、7-26为EST-SSR标记ES293862。这一信息表明，是四倍体狗牙根变种。狗牙根基因型（即，T89）可以是一个节段的异源四倍体或异源多倍体而不是同源四倍体。RFLP和EST标记显示的是二体遗传，分别位于T89遗传图谱上，并映射在连锁群1A（RZ476b，ES296135-A），1C（RZ142b，ES293106-C，ES294081-B），2A（ES306505，ES306865-A，RZ596a，T5745D12c，T5748G06b），3（T5745A03a，ES295349-B）7A（ES291883-A，PCD137a）和8b（T5741A08e，T5745F10d，ES299

12、392-B）中，如图5a和15（T5742C08a，ES297831-B，ES304827-BT5741G08b）。在个别单标记与二体遗传连锁群上看到了3C（PCD070a），4A（T5746B12a），6（T5745F06b），16（T5741D01b），20（T5745B09a），21（ES293862-D），22（ES303634），和23（ES297043-C）。如图4c（T5741E07a）标记物的聚类与遗传图谱暗示T89双体分离节段性异源多倍体，但映射标记数是相当低的和额外的标志物与二体可能继承映射到所有连锁群，这将说明是明异源多倍体。两种方法已被用来区分自动多倍体和利用分子标记异

13、源多倍体，一个是通过比较的单到多剂量标记比例（达席尔瓦等人，1993），另一种是通过比较基因座中链接的数目同位点在斥力链接的数目耦合（吴等。，1992年）。非SDAF标记在预期的比例一个四倍体的配子是0.17，而在预期比一个异源四倍体是0.25（傲威等人，2005）。检查所有的用标记显示非SDAF作为0.39的比例。因此，这种技术不是为多倍体决心在我们的研究很有用，也没有给予的alloploid与明确划分多倍体当RFLP标记在柳枝稷中使用（傲威等人，2005）。为了比较在连锁标记的数目同位点在斥力链接的数目耦合，遗传使用标记在偶合和斥力创建遗传图谱阶段。标记物的数量在耦合连接到斥力中这个基因图

14、谱是85：100（补充图1）。预期比率为异源多倍体和四倍体分别为1：1和0.25：1。因此，T89似乎分离作为allopoly倍体（C2=1.216，P=0.2701），这是在协议与减数分裂染色体行为（福布斯和伯顿，1963年;汉纳和伯顿，1977年）。的确，这种技术已被用于确定在染色体分类的类型各种多倍体。例如甘蔗（甜根子）的（铝贾纳比等人，1993）。此外，标记的双体继承限制共显性标记的用处是确定同源连锁群，因为这些标记映射到单个轨迹。对四倍体狗牙根种质减数分裂染色体行为进行了检查，对于“沿海”狗牙根，细胞在终变期的平均值是0.15，16.00IIS和0.96的IV，而PI，PI22601

15、1的平均值是1.36，15.69二，0.18，和0.68。在后续的研究中（汉娜和Burton，1977）四四倍体狗牙根品种，在中期多数染色体构型为二价良好。例如，他们表现出的品种中有两个是米德兰，17个是非法入境，IIS0和0.39，III，IV。在基因组的异源多倍体中，减数分裂是有限的二价配对（Soltis和Soltis博士，2000）和同源四倍体形成四价体，一价和三价占两个最大频率，二价体只占10%左右。因此，这些的数据证明狗牙根为异源四倍体。用百慕大探头产生的遗传图谱对狼尾草属基因组和cDNA克隆进行分析，狗牙根抗性基因类似物（Harris等，2010）和EST-SSR标记生成了333单

16、dosemarkersofwhich125markersmapped26T89，跨越1055cM和36个单剂量标记的连锁群映射在八个T574连锁群，共跨越311.1cM。在与伯特利等人的比较中发现，一些连锁群被合并还是分道扬镳，主要由EST和狗牙根抗性基因同源物决定（图2，连锁群2023）。例如，在伯特利等中标记物形成的连接基团4c。2006）遗传图谱形成了两个独立的联动组和伯特利连锁群5A和15并在这个研究得到合并。此外，伯特利等人。（2006年）确定了35个连锁T89团体，而我们发现其中9和26个连锁群只有两个标记（图2作了，连锁群图2d，图4c，图916，17，20，21，22，和23）

17、，随着更多标记的加入，一些标记可以映射到现有的连锁群或合并。一个异源四倍体，预期的连锁群数为18，是574遗传图谱，为伯特利等人在这项研究中发现的是八个连锁群而不是18个连锁群鉴定。一个二倍体，一个连锁群，可以对每染色体进行预计。因此，对于Ctransvaalensis，9连锁群将有望被鉴定。狗牙根映射标记效率很低，因为许多没有1:1隔离和许多没有地图的被删除。更多的标记，最好使用产生大量的碎片的标记系统，如AFLP标记，来增加地图的密度，从而使所有的连锁群可以识别。映射到二十八个狗牙根遗传图谱（表3）的可能是EST-SSR标记T89（24标记）和T574（四种标记）。从产生的ES序列图谱基因

18、型T89（Kim等人，2008）可以看出，这更可能是EST-SSR映射到T89连锁图谱，而不是T574标记，而且这28个EST-SSR标记可分成17个连锁群（表3;图1和2）。美国东部有两个有关联EST引物（es293106c，DT891C/5746a；es294151a，ET894A/11），映射到等位基因T89和574的遗传图谱上。两个RFLP标记（T5742F09c，ET894C;T5743E12a，BT893A;T5745F10a，BT5747B）在地图上表示同一连锁群，因此可能代表重复事件。需要在同源或同源（T89为）连锁集团可分配前，需要联结T89和T574连锁群的进一步标记数据（

19、生成多个等位基因从一个单一的轨迹）。狗牙根和高粱染色体遗传图相似性研究28狗牙根的EST序列利用EST-SSR标记对水稻和高粱（高粱相比双色）染色体的同源性进行分析（表3）。它们两个的ESTSSR标记映射到连锁群7A，且有一定的关系，水稻的3号染色体和高粱的1号染色体非常相似。EST-SSR标记在连锁2A组中，水稻染色体6和3有相似性。许多连锁群仅含一对EST-SSR标记，利用BLASTn相似性数据，对水稻或高粱染色体是否与以前收集的数据地图RFLP连锁群一致进行了对比。在这篇文章中，两个遗传图C.transvaalensis和C.dactylon使用狗牙根基因组克隆和cDNA发展先前实验得到的数据进行了富集。狗牙根抗病基因类似物（Harris等人。，2010），和新创建的EST-SSR标记。虽然更多的工作需要这些遗传图谱地，这些新开发的EST-SSR标记具有特别高价值，在确定样品和品种的遗传多样性或污染物的识别上，具有特别高价值。-