体外培育牛黄教学提纲.doc

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1、Good is good, but better carries it.精益求精，善益求善。体外培育牛黄-体外培育牛黄与天然牛黄对比研究资料体外培育牛黄与天然牛黄对比研究资料纲要一、体外培育牛黄是国家中药一类新药。 牛黄是干燥的牛胆结石,是名贵的中药材。 体外培育牛黄是模拟体内胆结石形成的原理和生物化学过程，在多种酶作用下，清除胆汁中成石的拮抗成分，制成成石牛胆汁，再通过促发作用，形成结石核心，由于静电吸引及有机高分子物质的架桥作用，呈网状向核心层层沉附、增大成牛胆结石。其性状、结构、成分、含量均与天然牛黄一致；药效学、毒理学研究结果证明安全、有效；临床疗效与天然牛黄一致，且对某些病种的疗效高

2、于天然牛黄。二、质量标准采用正式国家药品标准，与药典牛黄标准一致。 体外培育牛黄的质量标准为正式国家药品标准WS3-45（Z-051）-2003（Z），除增加了游离胆红素检查外，其它各项（性状、鉴别、检查、含量测定、功能与主治、用法与用量、注意、贮藏）均与中国药典2000版一部中牛黄的质量标准一致。三、理化性质（性状、结构、成分、含量）与牛黄一致，且更稳定。 体外培育牛黄与天然牛黄均呈球形或类球形，直径0.5-3cm。表面光滑，呈黄红色至棕黄色。体轻，质松脆，断面有同心层纹。气香，味苦而后甘，有清凉感，嚼之易碎，不粘牙。 显微观察均可见絮状、团絮状棕色胆红素钙颗粒，呈网状结构，网孔7-350。

3、 以连续生产的体外培育牛黄及不同产地的天然牛黄进行对比，分析其成分（胆红素、胆酸、去氧胆酸、牛磺酸、胆固醇、磷脂、无机盐、氨基酸、糖蛋白、灰分、水分）及相应成分的含量，结果表明体外培育牛黄的各种成分及其含量与天然牛黄一致。四、体外培育牛黄与天然牛黄的指纹图谱表现一致。指纹图谱（胆红素类、胆酸类、氨基酸及肽类）的对比分析表明，体外培育牛黄与天然牛黄成分一致，且比天然牛黄更稳定。五、体外培育牛黄与天然牛黄具有相同的药理、药效。 体外培育牛黄的抗惊厥、镇静、解热、抗菌、消炎、降压等作用与天然牛黄一致。 体外培育牛黄的主要药效集中反映在中枢作用方面：除了前述抗惊厥、镇静、解热作用外，还有耐缺氧、清除自

4、由基，保护脑细胞，保护心功能的作用。六、体外培育牛黄临床疗效良好与天然牛黄无统计学差异。 应用体外培育牛黄及以其为原料药的复方制剂治疗中风、乙脑、急性咽炎、牙周炎、疖肿病人共1852例，疗效良好，总疗效、临床症状疗效、临床体征疗效以及病理舌象的改善作用等均与天然牛黄相似。且治疗过程中也未发现明显不良反应。、期临床试验共1852例治疗结果组别药名病名总例数愈显率（%）总有效率（%）治疗组安宫牛黄丸乙脑18293.9599.45对照组安宫牛黄丸乙脑7888.4697.43治疗组单味乙脑12492.7499.20对照组单味乙脑4175.6087.80治疗组安宫牛黄丸中风24847.9884.78对照

5、组安宫牛黄丸中风14847.9784.93治疗组单味中风9537.9086.30对照组单味中风3232.2580.60治疗组片仔癀急性咽炎41675.5096.64对照组片仔癀急性咽炎10280.3897.06治疗组单味牙周炎14890.5499.32对照组单味牙周炎3984.6194.87治疗组单味疖肿11076.3696.36对照组单味疖肿3966.6794.87备注：治疗组用体外培育牛黄；对照组用天然牛黄。体外培育牛黄与天然牛黄对比研究资料目录（1）、牛黄形成机理（2）、体外培育牛黄机理与工艺研究（3）、天然牛黄与体外培育牛黄质量标准对比分析（4）、不同产地的天然牛黄成分及含量的分析研究

6、（5）、体外培育牛黄、天然牛黄、人工牛黄比较表（6）、体外培育牛黄成分含量的分析研究（7）、体外培育牛黄、天然牛黄相关仪器检测对比性研究（8）、体外培育牛黄、天然牛黄游离胆红素含量对比性研究（9）、体外培育牛黄指纹图谱研究（10）、体外培育牛黄、天然牛黄主要药效学对照性研究（11）、体外培育牛黄、天然牛黄一般药理对照性研究（12）、体外培育牛黄耐缺氧、中枢神经作用的研究（13）、体外培育牛黄急性毒性试验（14）、体外培育牛黄长期毒性试验（15）、体外培育牛黄致突变试验（16）、体外培育牛黄培养细胞染色体畸变试验（17）、体外培育牛黄对小鼠微核试验（18）、体外培育牛黄生殖毒性试验（19）、体外

7、培育牛黄与天然牛黄II、III期临床对比研究汇总（20）、安宫牛黄丸（体外培育牛黄）治疗痰热闭窍证（中风）II期临床试验总结206例临床试验分析（21）、安宫牛黄丸（体外培育牛黄）治疗暑温（乙脑）II期临床试验总结150例临床研究分析（22）、片仔癀胶囊（体外培育牛黄）治疗上焦热毒证（急性咽炎）期临床试验总结-203例临床试验分析（23）、体外培育牛黄治疗牙周炎期临床试验总结80例临床试验分析（24）、体外培育牛黄治疗疖肿期临床试验总结63例临床试验分析（25）、体外培育牛黄治疗中风期临床试验总结339例临床试验分析（26）、体外培育牛黄治疗暑温（乙脑）期临床试验总结278例临床试验分析（27

8、）、体外培育牛黄治疗上焦热毒证（急性咽喉炎）期临床试验总结319例临床试验分析（28）、体外培育牛黄治疗牙周炎期临床试验总结112例临床试验分析（29）、体外培育牛黄治疗疖肿期临床试验总结102例临床试验分析（1）、牛黄形成机理:大肠杆菌大肠杆菌结合胆红素肠道感染-葡萄糖醛酸酶钙浓度升高游离胆红素+胆红素钙颗粒成石胆汁核心结石（2）、体外培育牛黄机理与工艺研究在历经十多年研究胆红素钙结石形成的原因和机理的基础上，基于对胆红素型牛胆结石的认识，模拟体内结石形成的原理和生物化学过程。根据天然牛黄的性状、结构、成分、含量特点，应用可调控牛黄质量的配方，在可控条件下的牛胆结石体外培育，并获得性状、结构

9、、成分、含量、药效、临床疗效与天然牛黄相一致的体外培育牛黄。工艺步骤：成石牛胆汁的生成；结石核心的形成；结石的分层培育；结石的真空干燥。新鲜牛胆汁工艺路线：生物反应生物牛胆汁生化过程调pH值配方成石牛胆汁搅拌胆汁核心牛黄机(摇转)调节pH分层培育干燥成品（3）、天然牛黄与体外培育牛黄质量标准对比分析质量标准对比表：类项体外培育牛黄（国家药品标准）牛黄（药典2000版）来源本品为以牛科动物牛的新鲜牛胆汁液,配成成石胆汁,在体外培育所得的牛胆红素钙结石。本品为牛科动物牛干燥的胆结石。宰牛时，如发现有牛黄，即滤去胆汁，将牛黄取出，除出外部薄膜，阴干。性状呈球形、类球形，直径0.5-3cm，表面光滑，

10、呈黄红色至棕黄色，体轻，质松脆，有同心层纹。气香，味苦而后甘，有清凉感，嚼之易碎，不粘牙。呈卵形、类球形，直径0.6-3（4.5）cm，表面黄红色至棕黄色，体轻，质松脆，有同心层纹。气香，味苦而后甘，有清凉感，嚼之易碎，不粘牙。鉴别粉末加清水调和，涂于指甲，能将指甲染成黄色。加清水调和，涂于指甲上，能将指甲染成黄色。显微鉴别呈正反应显微鉴别呈正反应胆红素鉴别呈正反应胆红素鉴别呈正反应胆酸鉴别呈正反应胆酸鉴别呈正反应去氧胆酸鉴别呈正反应去氧胆酸鉴别呈正反应无无检查按药典附录水份测定法测定不得过9.0%按药典附录水份测定法测定不得过9.0%游离胆红素吸收度不得超过0.70无含量测定按药典测定薄层扫

11、描法胆酸含量不得少于6.0%。按药典薄层扫描法测定胆酸含量不得少于4.0%。按药典分光光度法测定胆红素含量不得少于35.0%。按药典分光光度法测定胆红素含量不得少于35.0%。功能主治清心，豁痰，开窍，凉肝，息风，解毒。用于热病神昏，中风痰迷，惊厥抽搐，癫痫发狂，咽喉肿痛，口舌生疮，痈肿疔疮。清心，豁痰，开窍，凉肝，息风，解毒。用于热病神昏，中风痰迷，惊厥抽搐，癫痫发狂，咽喉肿痛，口舌生疮，痈肿疔疮。用法用量0.15-0.35g。多入丸散用；外用适量，研末敷患处。0.15-0.35g。多入丸散用；外用适量，研末敷患处。贮藏置阴凉干燥处，遮光，密闭保存，防潮防压。遮光，密闭，置阴凉干燥处，防潮，

12、防压。（4）、不同产地的天然牛黄成分及含量的分析研究参照国内外有关学者对天然牛黄成分含量的分析方法和结果，对国内外五个不同产地的优质牛黄进行了分析研究，其结果如下成分含量（%）产地澳大利亚牛黄1西藏牛黄2京牛黄3进口牛黄1进口牛黄2水分6.96.87.07.06.7灰分6.86.76.97.16.8胆红素36.700.67*39.621.39*35.800.55*29.290.72*40.900.67*胆酸20.101.48*15.001.13*14.900.88*15.301.03*17.040.92*去氧胆酸6.480.77*4.900.76*4.860.75/10.630.86*7.15

13、0.63*牛磺酸6.420.49*5.920.73*6.250.78*4.660.74*6.460.55*胆固醇4.801.09*5.451.08*5.790.72*10.550.41*4.400.66*磷脂1.750.38*1.700.39*1.900.38*1.300.41*2.960.37*无机盐3.363.583.453.732.96氨基酸0.6550.6330.7480.5650.688糖蛋白1.742.052.591.992.06合计95.7092.3590.1992.6297.37（5）、体外培育牛黄、天然牛黄、人工牛黄比较表项目品名体外培育牛黄天然牛黄人工牛黄粉性状外观棕黄色球

14、、类球形、质轻、松、脆直径0.5-3cm棕黄色球、类球形、质轻、松、脆直径0.5-3cm无形状、粉末、浅黄色断面断层金黄色，有同心层纹结构断层金黄色，有同心层纹结构无结构气味气香、味苦而后甜气香、味苦而后甜微腥，微苦显微观察光学镜10倍取少许粉末加50%甘油乙醇液装片，镜下见絮状、团絮状棕色胆红素钙颗粒取少许粉末加50%甘油乙醇液装片，镜下见絮状、团絮状棕色胆红素钙颗粒大量淀粉颗粒，呈圆形、多面形扫描电镜呈网状结构，网孔7-350u呈网状结构，网孔7-350u含量胆红素35%以上35%以上0.7%胆酸12%以上7%以上12.5%去氧胆酸5%以上4%以上猪去氧胆酸15%（6）、体外培育牛黄成分含

15、量的分析研究通过对体外培育牛黄处方、制备工艺及其原理的研究，对所生产出的产品成分含量的研究分析如下：成分含量（%）批号901102901128901220910220920418水分7.16.97.06.97.0灰分7.37.27.27.07.1胆红素35.580.62*36.610.66*37.370.9036.870.67*37.960.82胆酸14.450.50*16.900.59*16.900.59*16.850.60*16.360.99*去氧胆酸6.800.48*6.790.40*6.610.55*6.600.40*6.800.68*牛磺酸6.480.66*6.700.44*6.72

16、0.46*6.830.48*6.700.44*胆固醇5.950.29*5.201.16*5.000.40*5.100.71*5.300.41*磷脂1.770.30*1.800.62*1.880.25*1.880.36*1.750.15*无机盐3.683.403.353.433.28氨基酸0.7880.6950.6980.6700.762糖蛋白2.572.262.432.491.98合计92.4794.4695.1694.6295.26*n=12*n=6（7）、体外培育牛黄、天然牛黄相关仪器检测对比性研究红外光谱分析结果：天然牛黄与体外培育牛黄在1730-1350cm-1区间，均有胆红素盐及胆红

17、素高聚物质的特征峰。傅立叶变换红外分光光谱仪分析结果：体外培育牛黄与天然牛黄均见1690cm-1为羧酸类；1629-1565cm-1为酰胺类；1404cm-1为羟基类。高效液相色谱分析结果：胆酸、去氧胆酸对照品的图谱与体外培育牛黄、天然牛黄中的胆酸、去氧胆酸一致。薄层色谱分析结果：体外培育牛黄、天然牛黄色谱中，在与胆酸、去氧胆酸对照品相应的位置上显相同颜色的荧光斑点。微量元素含量测定结果：体外培育牛黄与天然牛黄的微量元素及其含量均基本一致。氨基酸含量测定结果：体外培育牛黄与天然牛黄含有相同的17种氨基酸。（8）、体外培育牛黄、天然牛黄游离胆红素含量对比性研究游离胆红素含量对比表批号123456

18、7891011平均值天然牛黄4.4203.2382.0263.7034.3004.503.362.7561.2941.273.823.153体外培育牛黄0.5000.5000.4900.6300.6700.6220.5500.5260.4800.4600.5320.544（9）、体外培育牛黄指纹图谱研究体外培育牛黄与天然牛黄三个提取部位（包括酸水、酸醇和二甲亚砜提取液）的成分，即胆汁酸类、胆红素类等，均基本一致，但某些成分的比例有差异。10批体外培育牛黄三个提取部位（包括酸水、酸醇和二甲亚砜提取液）的HPLC指纹图谱有较好的相似性，说明人工体外培育牛黄的工艺是稳定的。4批天然牛黄的之间成分也基

19、本一致，但某些成分，尤其是胆汁酸类成分的比例有较明显差异。指纹图谱（胆红素类、胆酸类、氨基酸及肽类）的对比分析表明，体外培育牛黄与天然牛黄成分一致，且比天然牛黄更稳定。（10）、体外培育牛黄、天然牛黄主要药效学对照性研究：体外培育牛黄（TPN）灌胃给药能显著抑制小鼠巴豆油性耳廓水肿，大鼠角叉菜胶性足肿胀、大鼠巴豆油芽囊肿的渗出和增生，抑制白细胞游走反应，对抗前列腺素E2致毛细血管通透性增加；对酵母致大鼠发热和伤寒副伤寒三联疫苗侄家兔发热均有明显抑制作用，TPN对安钠咖致小鼠惊厥，吗啡致小鼠竖尾反应有明显的对抗作用，而与戊巴比妥钠台用则有协同催眠作用；TPN能显著减低感染金色葡萄球菌小鼠的死亡率

20、。试验方法：1、TPN的抗炎作用1.1对小鼠巴豆油性耳廓水肿的影响1.2对大鼠角叉菜胶性足肿胀的影响1.3对大鼠肉芽囊肿的影响1.4对白细胞游走反应的影响1.5对大鼠肾上腺素内抗坏血酸含量的影响1.6对大鼠毛细血管通透性的影响2、TPN的解热作用2.1对酵母致大鼠发热的影响2.2对伤寒副伤寒三联疫苗致家兔发热的影响3、TPN的中枢作用3.1对安钠咖致小鼠惊厥的影响3.2对戊巴比妥钠阈下催眠的影响3.3对吗啡致小鼠竖尾反应的影响3.4对尼可刹致小鼠惊厥的影响3.5对士的宁致惊厥的影响4、体外培育牛黄（TPN）的抗菌作用结论：抗炎作用：体外培育牛黄对小白鼠的巴豆油性耳廓水肿，大鼠的角叉菜胶性足肿胀

21、，羧甲基纤维素所致的白细胞游走反应均有明显的对抗作用，表明TPN对急性炎症的渗出和白细胞的趋化均有抑制作用。TPN的抗炎作用强度与天然牛黄相近。其抗炎作用可能与对抗前列腺素有关。解热作用：TPN对酵母所致的大鼠的发热及对伤寒副伤寒三联疫苗致家兔发热均有显著的抑制作用，其作用强度与天然牛黄相似。中枢抑制作用：TPN对安钠咖致小鼠惊厥，吗啡致小鼠竖尾反应有明显的对抗作用，TPN与戊巴比妥钠有协助催眠作用。以上作用强度均与天然牛黄相近。人工牛黄粉则无上述中枢抑制作用（11）、外培育牛黄、天然牛黄一般药理对照性研究体外培育牛黄灌胃给药对动物的一般活动无明显影响，对小鼠协调运动有抑制作用，并具有一定的镇

22、静和抗惊厥作用；能显著降低大鼠的血压，但不影响心率和心电图；对大鼠的呼吸的幅度和频率无明显的影响。方法：1、对中枢神经系统的影响1.1对动物一般活动的影响1.2镇痛作用1.3对协调运动的影响1.4对戊巴比钠阈下催眠剂量的影响1.5对小鼠惊厥的影响1.5.1对安钠咖致小鼠惊厥的影响1.5.2对尼可刹米致小鼠惊厥的影响1.5.3对士的宁致小鼠惊厥的影响1.5.4对吗啡致小鼠竖尾反应的影响2、对大鼠心血管及呼吸系统功能的影响结论：对中枢神经系统的影响：TPN具有镇静、抗惊厥作用，无镇痛作用。TPN对中枢神经系统的作用与天然牛黄相同。对心血管系统的影响：TPN能明显降低大鼠的血压，但不影响心率的心电图

23、。这一作用与天然牛黄一致。对呼吸系统的影响：TPN和天然牛黄对大鼠的呼吸频率和幅度均无明显影响。（12）、体外培育牛黄耐缺氧、中枢神经作用的研究体外培育牛黄的主要药效集中反映在中枢作用方面：除了前述抗惊厥、镇静、解热作用外，还有耐缺氧、清除自由基，保护脑细胞，保护心功能的作用。（1）体外培育牛对小鼠密闭缺氧耐受力的影响组别动物数剂量给药途径成活时间XSD（min）NS1020ml/Kgig31.042.88ICCB10800mg/Kgig37.572089*ICCB101200mg/Kgig39.542.70*ICCB101600mg/Kgig40.023.06*PPN1020mg/Kgig3

24、8.012.95*:p0.001（2）体外培育牛对缺氧小鼠的血清及脑、心、肝组织匀浆SOD活性影响组别动物数剂量给药途径SOD(Nu/mgprc)XSD脑肝血清心NS920ml/Kgig31.2010.7980.0010.79115.5726.1960.449.29ICCB101200mg/Kgig39.905076*94.6814.86*203.1623.73*69.878.71*:p0.005*:p0.01（3）体外培育牛对缺氧小鼠的脑、心、肝组织及血清MDA含量的影响组别动物数剂量给药途径MDAnmol/mg(XSD)脑心肝血清NS920ml/Kgig5.900.998.451.968.

25、761.906.890.71ICCB101200mg/Kgig4.701.11*5.511.40*7.291.55*5.201.02*:p0.05*:p0.01*:p0.001（4）缺氧小鼠脑组织超微结构改变之电镜所见对照组治疗组神经元细胞水肿，胞浆内细胞器不同程度变性，线粒体肿胀，粗面内质网扩张，核糖体数量减少，部分胶质细胞核周积液，胞浆空亮，细胞器溶解，部分有髓神经纤维的髓鞘结构紊乱，部分无髓神经纤维肿胀，呈大小不等泡状，神经丝消失，见局限性神经纤维溶解灶。毛细血管管径不等，内皮细胞肿胀，胞浆内空泡增多，大部分毛细血管周围见积液性间隙。仅少量神经元细胞轻微变性。线粒体轻度肿胀，粗面内质网无

26、明显扩张。核糖体数量基本正常，少数胶质细胞核周间隙增宽，有髓及无髓神经纤维的髓鞘结构规则。毛细血管内皮细胞无明显肿胀，毛细血管周围无积液性间隙。（13）、体外培育牛黄急性毒性试验体外培育牛黄按6.55-16.00剂量予小鼠灌胃给药，动物出现活动减少，摄食量下降，排黄色软便，部分动物死亡。死亡动物肠胃空虚，轻度胀气。存活动物于给药后1-3天内恢复正常，LD50为9.0（8.0-10.1）g/kg，是临床用量（0.3g/60kg或5mg/kg）的1800倍。大鼠口服体外培育牛黄的LD5010g/kg，是临床用量的2000倍以上。方法：受试动物按性别和体重随机分组。口服途径按体重剂量一次灌胃给予受试

27、动物，小白鼠的给药容量为40ml/kg，大白鼠为25ml/kg，对照组给予等量蒸馏水。腹腔注射途径按体重剂量一次腹腔注射给药，给药容量为20ml/kg，对照组予以等量生理盐水。给药后即观察动物的活动、摄食、呼吸、大便、毛色及死亡情况共7天。死亡动物及时尸检；存活动物7天后处死并进行尸检。结论：从急性毒性试验结果可以看出，体外培育牛黄给予小鼠和大鼠口服后的急性毒性很低。小鼠口服TPN的LD50为9.0（8.0-10.1）g/kg，是人口服用量（0.3g或5mg/kg）的1800倍。大鼠口服TPN的LD50大于10g/kg，是人口服用量的2000倍以上。（14）、体外培育牛黄长期毒性试验在长期毒性

28、试验中，大鼠耐受体外培育牛黄1500mg/kg/天，达35天；犬耐受体外培育牛黄500mg/kg/天，共33天；对大鼠和犬各器官、系统的形态、结构和功能均无不良影响。用药组体重增长均高于对照组。各剂量大鼠的血红蛋白和红细胞计数均明显高于对照组。方法：大鼠的长期毒性试验1、一般情况：逐日观察动物的毛色、精神、呼吸、进食、活动、粪便和中毒表现。每周固定时间测量记录体重一次。2、血液指标：末次给药后一天，处死动物取血做红细胞计数（RBC）、血红蛋白定量（Hb）、白细胞计数（WBC）及分类（DC）、血小板计数（Pl）和凝血时间（CT）。3、血液生化指标：谷丙转氨酸（GPT）、碱性磷酸酶（AKP）、总蛋

29、白（TP）、白蛋白（ALB）、血糖（GLU）、总胆红素（TBili）、总胆固醇（Tcholes）、尿素氮（BUN）、肌酐（Gree）。4、病理检查：末次给药后一天处死动物，作病理检查。4.1脏体比：心、肝、脾、肺、肾、肾上腺、睾丸、子宫、脑、前列腺称重并求脏体比。4.2组织学检查：对照组和高剂量组取肾上腺、胰腺、胃、十二指肠、回肠、结肠、前列腺、脑、脊髓、心、肝、脾、肺、肾、胸骨（骨、骨髓）、胸腺、膀胱、子宫、卵巢、睾丸及附睾、视神经。以10%福尔马林固定，石蜡包埋切片，HE染色，光学显微镜下观察病理变化并摄片。5.统计学方法：动物体重、血液学指标、病理检查等参数均用IBM微机进行单因素方差分

30、析，与对照组进行比较，以P=0.05为有意义的临界点。犬的长期毒性试验1、临床观察：同大白鼠2、心电图：导联ECG用药前后各一次。3、血液学指标末次给药后一天，处死动物取血作Hb、RBC、WBC。4、血液生化指标：GPT、BUN。5、尿液分析：尿常规。6、尸检及病理学组织学检查：系统尸检脏器系统：心、肝、脾、肺、肾、肾上腺组织学检查：取心、肝、脾、肺、肾、肾上腺、睾丸、卵巢标本，以10%福尔马林液固定，石蜡包埋切片，HE染色，光学显微镜下观察病理变化病摄片。结论： 在长期毒性试验中，大鼠耐受TPN1500mg/kg达35天，犬耐受TPN500mg/kg达33天。结果表明TPN长期口服大鼠和犬各

31、系统的形态、结构和功能无不良影响，而且用药组动物的体重增长均高于对照组。（15）、体外培育牛黄致突变试验微生物回复突变试验体外培育牛黄经用鼠伤寒沙门氏菌TA97、TA98、TA100和TA102四个菌株，在掺入量高达10000ug/皿和加S9或不加S9的条件下进行Ames试验，对各菌株均未引起回复突变菌落数超过空白对照自发突变菌落数的2倍，表明试验结果为阴性。方法：供试验用的A97、TA98、TA100和TA102四个菌株，先经常规方法进行生物性状鉴定，符合要求即可供使用。试验时间首先采用点试法对受试样品进行定性检测。样品的点加量为20微克，同时以甲基甲烷磺酸酯、正定霉素和敌克松作为阳性对照物

32、。定性试验后用平皿掺入法作进一步测试。受试物的掺入量分别为10mg、5mg、2.5mg、1.25mg/皿四种不同剂量，蒸馏水为阴性对照，2-氨基茐为阳性对照。每组均作加S9或不加S9各2个平皿，按细菌总数约为2103/皿的数量将菌株加入培养皿内，将平皿置于37培养箱培养48小时，然后取出计数每皿生长的回变菌落数，实验重复一次。结论：体外培育牛黄在本试验条件下，从定性的标准和平皿掺入试验的观测结果，其对各受试菌株引起的回复菌落数均未超过对照组自发突变菌落数的2倍，表明试验结果为阴性显示体外培育牛黄对组氨酸缺陷型沙门氏菌无明显的致回复突变作用。（16）培养细胞染色体畸变试验体外培育牛黄的剂量分别为

33、1.0、10.0和100ug/ml，对人外周血淋巴细胞染色体畸变进行检测，各剂量组的淋巴细胞染色体畸变率与对照组比较，均未见明显增高，表明体外培育牛黄在本试验条件下，对人外周血淋巴细胞无明显致畸作用。方法：按常规人体外周皿培养的方法，每一培养瓶中含RPM1640培养液4ml。灭活小牛血清1ml，PHA（400mg/0.1mg）0.2ml，青、链霉素各500单位。取健康人静脉血，按血：肝素（500国际单位/ml）=10：1加入肝素抗凝，每一培养瓶加全血0.3-.40ml，置37温箱培养4小时后，按设计剂量要求，分别加入不同浓度的体外培育牛黄生理盐水溶液，每剂量为2瓶，而后继续培养至72小时取出，

34、加秋水仙素（终浓度为0.1mg/ml），再置37温箱培养4小时后按常规收获细胞、制片、染色。结论：在体外培育牛黄的剂量分别为1.0、10.0和100ug/ml的试验条件下，对人外周血淋巴细胞诱发的染色体细胞畸变率增加与溶剂对照组比较，均无统计学显著性差别意义，试验结果为阴性，表明在试验条件下，对人外周血淋巴细胞染色体无明显的致畸变性作用。（17）、体外培育牛黄对小鼠微核试验体外培育牛黄的剂量为50、150和500mg/kg体重对小鼠进行微核试验，检测各剂量组的动物的骨髓嗜多染红细胞微核率及PCE/RBC比值的结果，与空白对照组比较均无显著性差异（P0.05），表明培育牛黄对小鼠的体细胞未呈现有

35、明显的致突变作用。方法：供试验用的雄性小鼠以随机法进行分组。每组6只，按试验剂量要求每天上午一次经口将受试物给予受试动物。连续3天，溶剂对照组动物经口给予等量蒸馏水，阳性对照组动物经腹腔注射环磷酰胺。在最后一次给予受试物6小时后，处死动物。取胸骨骨髓细胞制作涂片、固定、染色，制成的标本备作镜检用。结论：体外培育牛黄的剂量为50、150、500mg/kg体重的试验条件下，对小鼠的骨髓嗜多染红细胞微核率未引起显著增加，表明体外培育牛黄未呈现明显的致突变性作用。（18）、生殖毒性试验体外培育牛黄对大鼠的一般生殖毒性试验在本试验条件下，体外培育牛黄的剂量高达500mg/kg体重，对大鼠生殖行为和能力、

36、着床数、着床后胚胎存活数、活胎仔的生长发育等方面均未观察到不良影响。对存活的胎仔亦未见明显的致畸胎作用。方法：供试动物按体重以随机法进行分组，每组雌雄动物各20只。雌雄动物在交配前按规定给药期满后，按雌雄1：1合笼进行交配，以每天清晨检查发现有阴栓者确认雌鼠已交配，并定为孕期第0天。于第0-15天连续每天按剂量给药一次，于第20天进行剖检。如雌雄合笼交配两周时间仍未交配成功，此时合笼交配即终止。于孕期第20天进行剖检，观察受孕情况、着床总数、存活胎仔数、死亡胚胎数；对每窝存活胎仔的体重、身长、尾长进行测量和检查外观有无异常；每窝存活胎仔的各半分别按内脏、骨骼检查要求制作标本。始后对透明标本法制

37、作的胎仔骨骼，以直观观察法检查有无异常并记录于制定的表格内；对经波恩氏液固定的胎仔标本，用徒手切面法检查胎仔内脏有无异常并记录在特制的表格中。结论：本试验条件下，体外培育牛黄对大鼠的生殖行为和能力、着床数及着床后胚胎存活数、存活胎仔的生长发育等方面均未观察到不良影响；对存活的胎仔亦未见有明显的致畸作用。体外培育牛黄对大鼠致畸敏感期毒性试验在本试验条件下，体外培育牛黄剂量高达500mg/kg体重，对大鼠妊娠期的体重，着床后的胚胎存活数，胎仔的生长发育均无明显不良影响，对胎仔也未见有明显的致畸胎作用。方法：供试验用的动物按雌：雄=1：1合笼进行交配，以每天清晨检查发现有阴栓者确认雌鼠已交配成功，并

38、定为受孕期的第1天。将每天确认交配成功的雌鼠按随机法分入各组，直至各组达20只为止。各试验组的每只动物，均于受孕后的第7-16天按剂量要求，连续每天上午给药一次。受试动物于孕期第21天，在麻醉的情况下进行剖检，观察受孕情况，黄体数，着床总数，活胎数，死胎数；观测每只活胎仔的体重、身长、尾长、外观有无异常及性别鉴定；每窝活胎仔的1/2数量放如75%乙醇溶液进行固定3-5天，然后按制作透明标本法处理备作骨骼有无异常检查，另外1/2数量的活胎仔放入波恩氏液固定2周，备作检查内脏有无异常。结论：试验结果表明，在本试验条件下，体外培育牛黄对大鼠妊娠期的体重、着床后的胚胎存活数、胎仔的生长发育等方面均无明

39、显的不良影响，对胎仔也未见有明显的致畸作用。体外培育牛黄对小鼠未产期生殖毒性试验小鼠于妊娠后期及哺乳期受予体外培育牛黄剂量最高达500mg/kg体重，其对小鼠的正常分娩，幼仔出生后成活及哺育成活，幼仔的生长发育等方面均未见有不良影响作用。方法：供试验用的动物按雌：雄=1：1合笼进行交配，以每天清晨检查发现有阴栓者认为雌鼠已交配成功，并定为受孕期的第1天。将每天确认交配成功的雌鼠按随机法分入各组，直至各组达16只为止。各试验组的每只动物，均于受孕后的第16天开始至分娩后第21天，按剂量要求，连续每天上午给药一次。试验中按设计的表格观察记录受试动物的正常分娩雌鼠数、每窝出生的仔鼠数、出生后第4天存

40、活的仔鼠数、出生后第21天断奶时仔鼠的存活数、仔鼠的生长发育状况（其中包括外观有无畸形、仔鼠开始长毛时间和开眼时间、行为活动和体重增长状况等）。结论： 在本试验条件下，小鼠于妊娠后期及哺乳期受予体外培育牛黄，剂量最高达500mg/kg体重，其对小鼠的正常分娩、幼仔出生后成活及哺育成活、幼仔的生长发育等方面均未见有不良影响作用，表明体外培育牛黄对小鼠无明显的围产期毒性。(19)、体外培育牛黄与天然牛黄单剂和复方制剂II、III期临床对比性研究总结应用体外培育牛黄及以其为原料药的复方制剂治疗中风、乙脑、急性咽炎、牙周炎、疖肿病人共1852例，疗效良好，与优质天然牛黄无差异（见附表），安全性评价指标

41、包括：临床症状观察、血常规、尿常规、大便常规、肝功能、肾功能、心电图等，临床试验表明体外培育牛黄无明显毒副作用。II、III期临床试验共1852例治疗结果：组别药名病名总例数愈显率（%）总有效率（%）治疗组安宫牛黄丸（ICCB）乙脑18293.9599.45对照组安宫牛黄丸（NN）乙脑7888.4697.43治疗组单味（ICCB）乙脑12492.7499.20对照组单味（NN）乙脑4175.6087.80治疗组安宫牛黄丸（ICCB）中风24847.9884.78对照组安宫牛黄丸（NN）中风14847.9784.93治疗组单味（ICCB）中风9537.986.30对照组单味（NN）中风3232.

42、2580.60治疗组片仔癀（ICCB）急性咽炎41675.5096.64对照组片仔癀（NN）急性咽炎10280.3897.06治疗组单味（ICCB）牙周炎14890.5499.32对照组单味（NN）牙周炎3984.6194.87治疗组单味（ICCB）疖肿11076.3696.36对照组单味（NN）疖肿3966.6794.87注:ICCB:体外培育牛黄,NN:天然牛黄（20）、安宫牛黄丸（体外培育牛黄）治疗痰热闭窍证（中风）II期临床试验总结206例随机双盲对照试验分析研究目的：客观评价含体外培育牛黄的安宫牛黄丸治疗痰热闭窍证（中风）的临床疗效与安全性。诊断标准（参照1986年中华全国中医学会内

43、科学会修订的中风病中医诊断疗效评定标准）：中医诊断标准：中风是以卒然昏仆、不省人事，伴口眼歪斜、半身不遂、语言不利为主症的一种疾病。西医诊断：高血压性脑出血诊断要点脑血栓形成纳入标准：1、符合上述中医辨证及西医诊断标准者2、年龄40岁以上3、病程在5天以内者4、具有不同程度的意识障碍者临床实施方案：采用随机双盲对照试验方法，将合格受试者用简单随机方法分配至治疗与对照组。治疗组与对照组总例数均应大于100例，同时在3间以上医院进行临床试验，以治疗组与对照组为1：1的比例采用双盲法进行观察。具体的随机方法通过操作Casio计算器上的随机数字键，得出随机数字，制成随机分配卡，用信封密封，信封上的序号

44、与随机分配卡上的序号相同，进行编号。合格受试者进行临床试验时，依其进入试验的先后次序，拆开号码相应的信封，按信封内卡片上规定的治疗分组及医嘱进行治疗。对照药的选择：对照药选用含天然牛黄的安宫牛黄丸，天津达仁堂生产。治疗方法：所有受试者均在接受目前临床常规药物治疗、处理措施及护理常规的基础上加用含体外培育牛黄的安宫牛黄丸或天然牛黄的安宫牛黄丸，但应尽量使治疗组与对照组除加用含体外培育牛黄的安宫牛黄丸或含天然牛黄的安宫牛黄丸外，所接受的其它处理措施保持均衡。服法：鼻饲或口服剂量：含体外培育牛黄的安宫牛黄丸、含天然牛黄的安宫牛黄丸均为一次一丸，一天二次。疗程：5天结果：本研究共有合格受试者206例，中医诊断为中风（痰热闭窍证），西医诊断均为急性脑出血或急性脑梗塞。治疗组104例（男性64例，女性40例）；对照组104例（男性62例，女性40例）。均为住院病人。疗效分析：总疗效比较（治疗后5天）组别例数基本痊愈（%）显效（%）有效（%）无效（%）总有效率（%）治疗组1049（8.7）60(57.7)27(26.0)8(7.7)96(92.4)对照组1028(7.8)50(49.0)32(31.4)12(11.8)90(88.2)Ridit分析:u=1.22P=0.22结论:临床研究结果表明,在目前临床常规治疗中风的基础上,含体外培育牛黄的安宫牛黄