高通量药物筛选精选文档.ppt

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1、高通量药物筛选本讲稿第一页，共八十五页高通量筛选最初是伴随组合化学而产生的一种药物筛选方式。1990年末，组合化学的出现改变了人类获取新化合物的方式，人们可以通过较少的步骤、在短时间内同时合成大量化合物，在这样的背景下高通量筛选的技术应运而生。高通量筛选技术可以在短时间内对大量候选化合物完成筛选，经过近十年的发展，已经成为比较成熟的技术，不仅仅应用于对组合化学库组合化学库的化合物筛选，还更多地应用于对现有化合物库现有化合物库的筛选。目前世界各大药物生产商都建立有自己的化合物库和高通量筛选机构，对有潜力形成药物的化合物进行篦梳式的筛选。本讲稿第二页，共八十五页我国药物高通量筛选起步较晚，且不规范

2、，仅有十多年的研究历史。1996年中国医学科学院引进国内第一台Bionek2000型实验自动化工作站；1998年又引进全国第一台Topcount微量闪烁计数器，使放射配基实验、放射免疫实验等技术微量化、自动化。上海药物研究所、北京军事医学科学院分别成立了药物筛选专门机构，开始从事大规模筛选工作。西安交通大学药学院贺浪冲教授首创的细胞膜色谱细胞膜色谱（CMC）为化合物的体外高通量筛选提供了高选择性、高特异性、高效率的筛选手段。CMC已成功用于钙钙离子拮抗剂受体配体结合反应离子拮抗剂受体配体结合反应的研究，目前正在进行心血管化学合成药物的高通量筛选和中药有效部位及有效成分的寻找。今年将建立CMC自

3、动化筛选体系，促进我国药物高通量筛选技术的全面发展。本讲稿第三页，共八十五页一、一、概念概念高通量筛选(Highthroughputscreening，HTS)技术是指以分子水平和细胞水平的实验方法为基础，以微板形式作为实验工具载体，以自动化操作系统执行试验过程，以灵敏快速的检测仪器采集实验结果数据，以计算机对实验数据进行分析处理，同一时间对数以千万样品检测，并以相应的数据库支持整体运转的技术体系。本讲稿第四页，共八十五页HTS是药物快速、微量、灵敏、大规模筛选的新方法。采用分子、细胞水平的药物筛选模型，可从大量的样品中鉴别出对确定的分子靶点有相互作用的微量活性化合物。每年能处理成千万个样品，

4、加速了先导化合物的发现进程。突破了传统药物筛选的模式，提高了新药研发的效率。本讲稿第五页，共八十五页高通量平行合成仪本讲稿第六页，共八十五页液相芯片检测仪本讲稿第七页，共八十五页微孔过滤板本讲稿第八页，共八十五页12通道药物筛选仪本讲稿第九页，共八十五页高通量平行合成仪本讲稿第十页，共八十五页国家新药筛选中心本讲稿第十一页，共八十五页二高通量筛选的技术过程二高通量筛选的技术过程1、样品库2、初筛和复筛3、活性化合物4、深入筛选5、获得少量先导化合物6、确证筛选药物药理学研究7、侯选药物8、临床前研究本讲稿第十二页，共八十五页1、HTS筛选的基本步骤第一步是选择分子靶。选择的依据是来源于国际医学

5、生物学的新成果。目前国际常用的分子靶有以下几类：A、细胞膜受体；B、离子通道蛋白；C、酶蛋白；D、细胞核受体；E、转运蛋白。第二步是建立稳定表达分子靶的生物体系。靶是蛋白-克隆相对应的蛋白，在大肠杆菌中表达和提纯；靶是细胞受体-克隆出的基因转化到载体细胞中，建立稳定的细胞株。本讲稿第十三页，共八十五页第三步建立简便快速的大规模的生物检测方法。根据靶的不同分为两类：1、以蛋白等分子为基础；2、以细胞为基础酶蛋白-测定酶活性的变化；细胞膜受体-测定配体-受体的结合；细胞核受体-测定蛋白的表达。在建立大规模生物检测方法的同时，要用组合化合物的方法合成大量不同结构的化合物库相配套。本讲稿第十四页，共八

6、十五页2、HTS药物筛选靶点与检测方法（1）、分子靶点筛选模型-细胞信号通路细胞信号通路筛选系统外界信号从细胞表面传递到细胞内，或者直接穿过细胞膜进入到细胞质和细胞核，最终影响某些基因的转录。在这个传递过程中，某些特殊的细胞或一些病理状况下，可能是其中的一条或几条通路起作用，药物可以根据需要对这些通路进行阻断对这些通路进行阻断。使用信号通路筛选系统，可直接对药物作用的分子机制有所了解。本讲稿第十五页，共八十五页（2）、细胞膜表面受体筛选模型）、细胞膜表面受体筛选模型a.G蛋白耦联受体蛋白耦联受体：受体与GTP结合的调节蛋白的耦联，在细胞内产生cAMP，从而将外界信号跨膜传递到细胞内。如趋化因子

7、受体、-受体阻断剂等。b.催化受体催化受体：为单跨膜受体，分为胞外区，跨膜区和胞内区。当细胞因子与胞外区结合后，引起多个受体单体的聚合，每个聚合体的受体单体可以是同一类型，也可以不同。如EPO、G-CSF、GH受体2个同样的单体；IL-1，GM-CSF，IL-6受体是2个不同的单体；TNF-是3个同样的单体；IL-2是3个不同的受体。c.离子通道耦联受体离子通道耦联受体：细胞表面一些神经递质的受体，自身是一些离子通道，或者与离子通道相耦联。当与配体结合时，受体构象改变，通道开放，离子进出细胞，引起电兴奋。本讲稿第十六页，共八十五页三三.高通量筛选技术体系的组成高通量筛选技术体系的组成1.化合物

8、样品库化合物样品主要有人工合成和从天然产物中分离纯化两个来源。其中,人工合成又有常规化学合成和组合化学合成两种方法。本讲稿第十七页，共八十五页2.自动化的操作系统自动化操作系统利用计算机通过操作软件控制整个实验过程。操作软件采用实物图像代表实验用具，简洁明了的图示代表机器的动作。自动化操作系统的工作能力取决于系统的组分，根据需要可配置加样、冲洗、温解、离心等设备以进行相应的工作。本讲稿第十八页，共八十五页3.高灵敏度的检测系统检测系统一般采用液闪计数器、化学发光检测计数器、宽谱带分光光度仪、荧光光度仪等。本讲稿第十九页，共八十五页4.数据库管理系统数据库管理系统承担4个方面的功能:样品库的管理

9、功能;生物活性信息的管理功能;对高通量药物筛选的服务功能;药物设计与药物发现功能。5、高特异体外筛选模型本讲稿第二十页，共八十五页四四.高通量筛选模型高通量筛选模型常用的筛选模型都在分子水平和细胞水平，观察的是药物与分子靶点的相互作用，能够直接认识药物的基本作用机制。本讲稿第二十一页，共八十五页1.分子水平的药物筛选模型分子水平的药物筛选模型:(1).受体筛选模型受体筛选模型:指受体与放射性配体结合模型。以受体为作用靶的筛选方法,包括检测功能反应、第二信使生成和标记配体与受体相互作用等不同类型。(2)酶筛选模型酶筛选模型:观察药物对酶活性的影响。根据酶的特点,底物,产物都可以作为检测指标,并由

10、此确定反应速度。典型的酶筛选包括（1)适当缓冲液中孵化;(2)控制反应速度,如:温度,缓冲液的pH值和酶的浓度等;(3)测量产物的增加和底物的减少。(3)离子通道筛选模型离子通道筛选模型:(1)贝类动物毒素的高通量筛选,其作用靶为Na+通道上的蛤蚌毒素结合位点，用放射性配体进行竞争性结合试验考察受试样品。(2)用酵母双杂交的方法高通量筛选干扰N型钙通道3亚单位与1亚单位相互作用的小分子，寻找新型钙通道拮抗剂。本讲稿第二十二页，共八十五页2.细胞水平药物筛选模型细胞水平药物筛选模型观察被筛样品对细胞的作用。但不能反映药物作用的具体途径和靶标,仅反映药物反映药物对细胞生长等过程的综合作用。对细胞生

11、长等过程的综合作用。包括:内皮细胞激活;细胞凋亡;抗肿瘤活性;转录调控检测;信号转导通路;细菌蛋白分泌;细菌生长。本讲稿第二十三页，共八十五页高通量筛选技术与传统的药物筛选方法相比高通量筛选技术与传统的药物筛选方法相比有以下几个优点有以下几个优点:反应体积小；自动化；灵敏快速检测；高度特异性。但是，高通量筛选作为药物筛选的方法,并不是一种万能的手段，特别是在中药研究方面，其局限性也是十分明显的。本讲稿第二十四页，共八十五页五、高通量药物筛选原理五、高通量药物筛选原理1基本原理基本原理高通量药物筛选技术是将多种技术方法有机结合而形成的新的技术体系，它以分子水平和细胞水平的实验方法为基础，以微板形

12、式作为实验工具载体，以自动化操作系统执行实验过程，以灵敏快速的检测仪器采集实验数据，以计算机对实验获得的数据进行分析处理。它的正常开展需要有一个高容量的化合物库、自动化的操作系统、高灵敏度的检测系统、高效率的数据处理系统以及高特异性的药物筛选模型。本讲稿第二十五页，共八十五页（1）化合物样品库化合物样品库高通量筛选是一种利用已有的化合物进行的体外随机筛选。因此通过高通量药物筛选发现先导化合物(leadingcompounds)的有效性取决于化合物样品库中化合物的数量及其质量。化合物样品的数量是指不同样品的数量。化合物样品的质量由化合物结构的多样性决定的。许多活性反应基团(reactivegro

13、ups)使初筛的假阳性大量增加，剔除这些化合物可以提高化合物样品库的质量。本讲稿第二十六页，共八十五页化合物样品主要有人工合成和从天然产物中分离纯化两个来源。人工合成又可分为常规化学合成和组合化学合成两种方法。采用常规化学合成的纯化合物一直是国外制药企业建立化合物样品库的主要来源。它们通过长年积累的化合物建立化合物样品库，通过购买和化合物交流使化合物样品库的数量和质量大幅度提高。本讲稿第二十七页，共八十五页组合化学(combinatorialchemistry)的出现为大量增加化合物的数量提供另外一种来源。组合化学的基本原理是采采用适当的化学方法，在特定的分子母核上加入不同用适当的化学方法，在

14、特定的分子母核上加入不同的基团，在同样条件下，产生大量的新化合物的基团，在同样条件下，产生大量的新化合物。这种方法在化合物的结构改造和优化方面已经表现出强大的优势。但是，由于该方法是基于母核结构的改造，因此产生的大量化合物在结构多样性方面尚有不足。解决组合化学产物结构多样性的问题，已经成为化学研究人员的研究课题。本讲稿第二十八页，共八十五页从天然产物中分离出来的化合物，母核结构和活性基团是长期的自然选择形成的，它们通过高通量筛选所表现出来的生物活性在药物发现中具有人工合成化合物所不能比拟的优势。因此，增加具结构多样性的天然化合物及其衍生物是提高样品库质量的一个重要途径。跨国制药企业为了增加高通

15、量筛选的阳性率，已经或正在寻求购买我国的天然产物单体。本讲稿第二十九页，共八十五页(2)自动操作系统自动操作系统高通量药物筛选每天要对数千化合物样品进行检测，工作枯燥、步骤单一，人工操作容易疲劳、出错。自动化操作系统采用微孔板作为反应容器，具有固定的分布模式(format)；不同的微孔板通过条形码加以标不同的微孔板通过条形码加以标记记。自动化操作系统通过光电阅读器对特定的微孔板上的特定位置进行操作，并将操作结果及相关数据存贮在计算机内，使筛选结果准确，实验过程快速。本讲稿第三十页，共八十五页除了实验步骤的需要以外，自动化的加样方式自动化的加样方式是决定筛选速度的重要因素。目前主要有单孔、8孔、

16、96孔、384孔等几种方式。单孔一般用于对照样品以及复筛中零散样品的转移。单孔一般用于对照样品以及复筛中零散样品的转移。96孔、孔、384孔在酶活性检测以及需同时开始、同时终止反应的筛选孔在酶活性检测以及需同时开始、同时终止反应的筛选模型模型中是必需的。自动化操作系统的一个重要组成部分是堆栈堆栈(hotel)。所谓堆栈是指在操作过程中用来放置样品板、反应板以及对它们进行转移所需的腾挪空间。因此，高通量筛选的样品数量取决于堆栈的容量。本讲稿第三十一页，共八十五页由此可见，高通量药物筛选的自动化操作系统由计算机及其操作软件计算机及其操作软件、自动化加样自动化加样设备、温孵离心等设备、堆栈设备、温孵

17、离心等设备、堆栈4个部分组成。不同的单位可根据筛选模型类型、筛选规模选购不同的部分整合成为一个完整的操作系统。本讲稿第三十二页，共八十五页(3)检测系统检测系统快速、高灵敏度的检测技术是高通量药物筛选的关键技术之一。在高通量药物筛选中，检测系统一般采用液闪计数器、化学发光检测计数器、宽谱带分光光度仪、荧光光度仪等。检测仪器灵敏度的不断提高，即使对微量样品的检测，也可以得到很好的检测效果。本讲稿第三十三页，共八十五页A.放射性检测技术放射性检测技术。美国学者GanieSM在高通量药物筛选研究中，应用放射性测定法，特别是亲和闪烁（SPA）检测方法，使在96孔板上进行的样本量实验得到发展。该方法灵敏

18、度高，特异性强，促进了高通量药物筛选的实现，但存在环境污染问题。本讲稿第三十四页，共八十五页 液闪计数液闪计数放射性同位素广泛用于受体结合测定、细胞毒性、细胞增殖实验、药物代谢示踪以及基因分析中。由于采用了双光电倍增管及时间分辨偶合回路(time-resolvedcoincidencecircuit)技术，有效地降低了背景信号的干扰，使测定灵敏度提高，同位素用量少。在96孔板的分析检测中，背景信号可控制在10cpm左右。本讲稿第三十五页，共八十五页亲和闪烁分析亲和闪烁分析(scintil1ationproximityassay，SPA)是一种新的液闪分析法。在高通量筛选测定细胞表面受体亲合结合

19、作用时，放射配体标记滤过分析技术放射配体标记滤过分析技术由于需要进行分离，现已被亲合闪烁分析所取代。亲合闪烁分析技术通过亲合结合，将放射性配基结合到具通过亲合结合，将放射性配基结合到具有受体的闪烁球上，从而产生光子，减少了放射配体标记游有受体的闪烁球上，从而产生光子，减少了放射配体标记游离配基与结合配基的分离过程，使得放射配基分析可完全以离配基与结合配基的分离过程，使得放射配基分析可完全以自动化的方式进行自动化的方式进行，适于进行高通量筛选。产生低能量放射粒子的同位素可被用来进行放射性标记，而这种低能量放射粒子在短距离内可被重吸收，以确保只有结合到受体表面的配基才被检测到。SPA技术被广泛的应

20、用到激酶、核酸处理、酶分析以及受体配体的相互作用分析中。本讲稿第三十六页，共八十五页B.光学测定技术光学测定技术。近年来，美、英两国研究人员在高通量筛选检测中，建立了大量的非同位素标记测定法，如用分光光度检测法筛选蛋白酪氨酸激酶抑制剂、组织纤溶酶原激活等，均获得成功。本讲稿第三十七页，共八十五页 分光光度法分光光度法 为了适应高通量药物筛选，许多公司都生产了具备计算机接口并能对多孔板进行同时检测的分光光度计。以MolecularDevice公司的spectra190为例，它采用8条光导纤维同时对8孔进行测定。测定波长以2nm为间隔，可以在190nm一850nm间进行选择。对未知物质，可在该范围

21、内进行扫描以确定其特征吸收光谱。因此，大大增加了建立模型的多样性。检测数据以不同文件格式输出，可用随机软件或通用数据处理软件进行处理。方便、快速、准确、自动化程度高。分光光度法高灵敏仪器同自动化操作系统的连接，使得基于紫外、可见光谱的高通量药物筛选模型成为主要模型种类。本讲稿第三十八页，共八十五页C.化学发光检测化学发光检测化学发光指生色物质在酶促作用下，化学能以光子的形式释放出来。化学发光根据发光的形式和种类分为辉光型和闪光型发光两种。辉光型化学发光如以AMPPD、CDPS、ECL、Diagoxigein等为基础的发光反应。其发光时间较长且稳定。闪光型发光以发光蛋白、ATP、荧光素酶等为底物

22、的发光反应，其发光时间较短。由于时间分辨及偶合回路技术的使用，对于背景的去除更为有效，使得化学发光的检测灵敏度达到0.1pg数量级。在单孔多点单孔多点喷射技术喷射技术中，光导纤维末端带有一喷头，用来加入底物。反应性底物从100个小孔喷出，使反应性底物加入孔中后即可均匀混合。发光反应同时启动后，可立即进行测定，对于闪光性化学发光的测定更为有利。本讲稿第三十九页，共八十五页D.荧光检测技术荧光检测技术。美国学者GiulianokA，采用FLIPR荧光检测法，可在短时间内同时测定荧光的强度和变化，可测定细胞内钙离子流及测定细胞内pH和细胞内钠离子流等。本讲稿第四十页，共八十五页激发荧光检测激发荧光检

23、测是新型激发荧光检测仪。用连续的激发光谱取代固定光谱。因为多数荧光基团都有短暂的半衰期，即使用较弱的激发光源也能获得大量的光子流。这种特性以及多种可采用的荧光模式，使得荧光检测技术成为高通量筛选必不可少的应用手段。荧光技术在均相筛选分析中广为应用。其中，包括荧光共振能量转移(FRET)，荧光偏振(FP)，时间分辨荧光(TRET)荧光相关谱(FCS)等技术。本讲稿第四十一页，共八十五页E、多功能微板检测系统多功能微板检测系统。由西安交通大学药学院研制的1536孔板高通量多功能微板检测系统，是目前国际上先进的高通量检测系统，它可使筛选量进一步提高，现已在该院投入使用。本讲稿第四十二页，共八十五页(

24、4)数据库管理系统数据库管理系统高通量药物筛选的特点是对数以万计的化合物样品进行多模型的筛选。与高通量药物筛选相适应的数据库管理系统主要承担4个方面的功能。本讲稿第四十三页，共八十五页样品库的管理功能样品库的管理功能：化合物样品库对进行高通量药物筛选的化合物样品的各种理化性质进行存储管理。对每一个新入库的化合物进行新颖性分析，排除结构雷同的化合物，避免不必要的筛选。由于反应性基团增加了假阳性出现的机率，样品库对新入库的化合物进行反应基团检测以去除这类化合物。本讲稿第四十四页，共八十五页生物活性信息的管理功能：生物活性信息的管理功能：生物活性库存贮每一化合物都要经过不同模型检测，并根据多个模型的

25、检测结果对化合物的生物活性进行综合评价。本讲稿第四十五页，共八十五页对高通量药物筛选的服务功能对高通量药物筛选的服务功能：高通量药物筛选的工作量大，自动化程度高，也涉及到许多繁琐的工作。高通量药物筛选数据库管理系统对与药物筛选相关的业务往来通讯业务往来通讯、档案管理档案管理以及各种样品标签样品标签的打印的打印进行管理，使高通量药物筛选的各个环节程序化、标准化。本讲稿第四十六页，共八十五页药物设计与药物发现功能药物设计与药物发现功能：高通量药物筛选产生大量的化合物结构信息，随着筛选的进行，生物活性信息也特大幅度提高。高通量药物筛选数据库管理系统通过对同一模型不同的呈现阳性反应的化对同一模型不同的

26、呈现阳性反应的化合物结构进行分析，找出其构效关系，从而合物结构进行分析，找出其构效关系，从而为药物设计提供参考为药物设计提供参考。本讲稿第四十七页，共八十五页(5)筛选模型筛选模型指用于检测药物作用的实验方法。由于高通量筛选要求反应总体积小，而且，反应具有较高特异性和敏感性，因此对于筛选模型也要求较高，常用的筛选模型都在分子水平分子水平和细胞水平细胞水平，观察的是药物与分子靶点的相互作用，能够直接认识药物的基本作用机制。目前这些模型主要集中在受体、酶、通道以及各种细胞反应方面。近年也出现了基因水平基因水平的药物筛选模型，使药物筛选模型的范围更广泛。本讲稿第四十八页，共八十五页（一）分子水平的药

27、物高通量筛选模型（一）分子水平的药物高通量筛选模型a.以酶为靶的高通量筛选以酶为靶的高通量筛选以酶为作用靶的高通量筛选方法，绝大多数是直接检测酶活性。具体方法根据酶的不同而不同，主要有放射性的方法和比色、荧光的方法。本讲稿第四十九页，共八十五页 基于放射性的方法基于放射性的方法多是将底物标记，测定放射性产物的生成。Taft等建立了(1,3)-葡聚糖合酶抑制剂(抗真菌)的高通量筛选方法。将含有酶的菌丝提取物、-淀粉酶和UDP葡萄糖加入96孔板的孔中，温孵、反应。终止反应后，滤去未被合成进入的底物。闪烁计数检测滤器上保留的(1,3)-葡聚糖，指示酶活性大小。本讲稿第五十页，共八十五页也有将酶标记，

28、测定被特异结合的酶的方法酶标记，测定被特异结合的酶的方法。Vollmer等建立了一种以青霉素结合蛋白(PBP)为靶的抗生素的高通量筛选方法。PBP既是糖基转移酶又是肽转移酶，该法是筛选其糖基转移结构域的活性位点上的可结合物。将莫诺霉素(moenomycin)结合于一种小球上，制成混悬液，加入96孔板，然后加入3标记的PBP(细菌膜粗提物)和受试化合物，孵育、过滤去掉非结合的放射性，闪烁计数测得的放射性指示PBP与莫诺霉素结合的情况及受试化合物对其影响。本讲稿第五十一页，共八十五页 基于放射性而无需过滤分离的基于放射性而无需过滤分离的SPA也有应用。Brown等建立了内源性肽酶的水解活性检测方法

29、，用以研究其抑制剂。用3标记的肽底物，通过生物素(biotin)与抗生物素蛋白(avidin)包裹的SPA闪烁球相连。酶解使3随肽的断裂而离开闪烁球。测定3放射性作用于闪烁球产生的闪烁信号的丢失量，即指示酶活性大小。本讲稿第五十二页，共八十五页基于基于比色、荧光比色、荧光等的方法有一些报道。等的方法有一些报道。Waslidge等建立了脂氧合酶抑制剂的筛选方法。酸性条件下，脂的过氧化物能把Fe2+氧化为Fe3+，然后氧化二甲酚橙(xylenolorange)，产物在可见光区620nm有强烈吸收。在96孔板上测定。Zhang等建立了HIV逆转录酶抑制剂(抗病毒药物)的高通量筛选方法。该方法基于逆转

30、录酶能很容易地将核苷酸类似物(如生物素-dUTP)引入新生DNA链。在96或384孔板上，将生物素化的引物/模板与抗生蛋白链菌素在板孔中混合孵育，加入逆转录酶，再加入生物素-dUTP和d-TTP混合物启动反应。反应60min后，加入亲和素-别藻蓝蛋白孵育，用HTRF分析仪读取数据。该法也可用于多种其他的核酸聚合酶。本讲稿第五十三页，共八十五页b.以受体为靶的高通量筛选以受体为靶的高通量筛选以受体为作用靶的高通量筛选法，包括检测功能反应、第二检测功能反应、第二信使生成信使生成和标记配体与受体相互作用标记配体与受体相互作用等不同类型。优点是易于区分激动剂和拮抗剂。经典的功能检测方法通量低，而引入基

31、于重组技术的报告基因引入基于重组技术的报告基因检测方法极大地提高了筛选通量检测方法极大地提高了筛选通量，既高效且节省成本。检测第二信使或下游机制如磷酸化，传统方法也比较麻烦，不适于高通量检测，但将这些机制与报告基因相偶联则能克服。本讲稿第五十四页，共八十五页c.以离子通道为靶的高通量筛选以离子通道为靶的高通量筛选Negri等建立了贝类动物毒素的高通量筛选方法。其作用靶为Na+通道上的蛤蚌毒素(STX)结合位点，用放射性配体(3H-STX)进行竞争性结合试验考察受试样品。Yong等用酵母双杂交的方法高通量筛选干扰N型钙通道3亚单位与1亚单位相互作用的小分子，寻找寻找新型钙通道拮抗剂。新型钙通道拮

32、抗剂。本讲稿第五十五页，共八十五页 d.以核酸为靶的高通量筛选以核酸为靶的高通量筛选Hamasaki等建立了以16SrRNA编码区结构和HIV-RRERNA结构为靶的抑制剂的高通量筛选方法。寻找类似寻找类似氨基糖甙类抗生素而亲和力更高氨基糖甙类抗生素而亲和力更高或作用于相同核酸的其他作用于相同核酸的其他位点的新化合物，位点的新化合物，以及不易被代谢失活的新化合物不易被代谢失活的新化合物。方法基于当含芘的氨基甙类似物结合于RNA时，芘的荧光被淬灭的原理。在96孔板上，将芘碳酰巴龙霉素(PCP)，RNA配成溶液后加入有受试化合物的板孔中，用荧光读板器考察荧光恢复的程度。本讲稿第五十六页，共八十五页

33、（二）细胞水平的药物高通量筛选模型二）细胞水平的药物高通量筛选模型 1、选择蛋白、选择蛋白(selectins)选择蛋白是膜整合糖蛋白的一个家族，它能够识别从另外一个细胞表面伸展出来的特异的糖基团，并与之特异性结合，因此它也是细胞表面受体。选择蛋白有一个小的细胞质结构域，一个单次跨膜的结构域，一个大的细胞外片段，在这个片段上可分为几个结构域，包括最外端的具有凝集素作用的结构域。本讲稿第五十七页，共八十五页本讲稿第五十八页，共八十五页已知有三种类型的选择蛋白E-选择蛋白，它在内皮细胞表达；P-选择蛋白，在血小板和内皮细胞表达；L-选择蛋白，在各种类型的白细胞中表达。这三种选择蛋白都是识别小的出现

34、在某些糖蛋白或糖脂的四糖基团，选择蛋白同糖配体的结合是Ca2+依赖性的。选择蛋白主要介导循环中的白细胞在有炎症和血块的血管壁部位暂时性相互作用。与选择蛋白起作用的靶细胞上的蛋白通常称为粘蛋白(mucin)。本讲稿第五十九页，共八十五页2.ELISA2.1.ELISA的原理的原理ELISA的基础是抗原或抗体的固相化及抗原或抗体的酶标记。结合在固相载体表面的抗原或抗体仍保持其免疫学活性，酶标记的抗原或抗体既保留其免疫学活性，又保留酶的活性。在测定时，受检标本（测定其中的抗体或抗原）与固相载体表面的抗原或抗体起反应。用洗涤的方法使固相载体上形成的抗原抗体复合物与液体中的其他物质分开。再加入酶标记的抗

35、原或抗体，也通过反应而结合在固相载体上。此时固相上的酶量与标本中受检物质的量呈一定的比例。加入酶反应的底物后，底物被酶催化成为有色产物，产物的量与标本中受检物质的量直接相关，故可根据呈色的深浅进行定性或定量分析。由于酶的催化效率很高，间接地放大了免疫反应的结果，使测定方法达到很高的敏感度。本讲稿第六十页，共八十五页2.2ELISA的类型的类型ELISA可用于测定抗原，也可用于测定抗体。在这种测定方法中有三个必要的试剂：（1）固相的抗菌素原或抗体，即“免疫吸附剂”（immunosorbent）；（2）酶标记的抗原或抗体，称为“结合物”（conjugate）；（3）酶反应的底物。用于临床检验的EL

36、ISA主要有以下几种类型：本讲稿第六十一页，共八十五页（1）间接法测抗体）间接法测抗体间接法是检测抗体常用的方法。原理为利用酶标记的抗抗体，检测与固相抗原结合的受检抗体，故称为间接法。常用于临床血清中自身抗体的检测，以及杂交瘤上清特异性抗体的筛选。本讲稿第六十二页，共八十五页(2)双抗体夹心法测抗原双抗体夹心法测抗原是检测抗原最常用的方法。只要获得针对受检抗原的特异性抗体，就可用于包被固相载体和制备酶结合物。用途：测定二价或二价以上的大分子抗原，但不适用于测定半抗原及小分子单价抗原，因其不能形成两位点夹心。双抗体夹心法测抗原的方法：捕获抗体包被封闭（3BSA）待测抗原洗涤（含0.1Tween的

37、PBS)酶标单抗或多抗洗涤显色检测本讲稿第六十三页，共八十五页(3)竞争法测抗原竞争法测抗原1）抗体固相测抗原小分子抗原或半抗原因缺乏可作夹心法的两个以上的位点，因此不能用双抗体夹心法进行测定，可以采用竞争法模式。原理是标本中的抗原和一定量的酶标抗原竞争与固相抗体结合。标本中抗原量含量愈多，结合在固相上的酶标抗原愈少，最后的显色也愈浅。方法：抗体包被封闭同时加入待测抗原和酶标抗原洗涤酶底物显色检测2）抗原固相测抗原原理是标本中的抗原和固相抗原与一定量的抗体竞争结合。标本中抗原含量愈多，结合在固相上的抗体愈少，最后的显色也愈浅。方法:a:抗原包被96孔板；b:封闭;c:待测抗原与抗体反应一定时间

38、；d:加入96孔板e:洗涤f：加入酶标二抗g：洗涤h：显色和检测本讲稿第六十四页，共八十五页本讲稿第六十五页，共八十五页本讲稿第六十六页，共八十五页本讲稿第六十七页，共八十五页（二）细胞水平的药物高通量筛选模型（二）细胞水平的药物高通量筛选模型a.内皮细胞激活内皮细胞激活内皮细胞激活是急慢性炎症过程中重要环节。Rice等以选择蛋白在细胞表面的表达作为标以选择蛋白在细胞表面的表达作为标志，建立了内皮细胞激活抑制剂的高通量筛选方法志，建立了内皮细胞激活抑制剂的高通量筛选方法。建立人脐静脉内皮细胞培养系统。IL-1刺激下，选择蛋白在内皮细胞表面的表达用ELISA方法定量。方法包括细胞固定、加液、加受

39、试化合物等操作，能保持细胞完整，不昂贵，可重复，筛选速度可达每星期1000种化合物。能够较早地发现细胞对化合物的摄取及化合物的细胞毒性。本讲稿第六十八页，共八十五页b.细胞凋亡细胞凋亡 Erusalimsky等建立。细胞预先用3胸苷标记，与凋亡诱导物孵育后，连续经过两种玻璃滤器。一个是中性的，捕获完整的染色质和高分子量。另一个装有DEAE活性基团，捕获低分子量DNA碎片。通过对滤器上放射性的测量，可以对DNA的破碎情况定量。本讲稿第六十九页，共八十五页c.抗肿瘤活性抗肿瘤活性Lu等建立“生物活性指纹”筛选抗肺癌药物的方法，考察受试分子(类维生素及类维生素相关分子)对许多不同细胞系的效应特点。检

40、测指标包括：(1)肺癌细胞生长抑制检测肺癌细胞生长抑制检测。选择了约50种肿瘤和非肿瘤细胞，包括了大量不同的组织和(或)肿瘤来源。细胞暴露于受试化合物5后，用标准比色法测定存活细胞百分率。20%生长抑制率指示有活性。(2)集落形成抑制检测集落形成抑制检测，用以区分细胞生长抑制作用和细胞杀伤作用。6孔板上加NCI-H292肺癌细胞，暴露于受试物一定时间。然后对细胞进行清洗，植于无受试物的培养介质共7d。用结晶紫对细胞染色，考察集落形成情况。(3)凋亡检测凋亡检测，用ELISA方法测量细胞DNA破碎。(4)转录调控检测转录调控检测，用以考察受试化合物是否有类维生素受体介导的转录抑制作用。方法是将H

41、eLaTK-细胞用73Col-CAT报告基因连同受体的表达载体转染，与受试物一起培养，用ELISA方法检测CAT活性。本讲稿第七十页，共八十五页d.G2检查点检查点(G2checkpoint)Roberge等建立了G2期检查点抑制剂的高通量筛选方法。将MCF-7mp53细胞培养，种在96孔聚苯乙烯组织培养板上。照射使细胞进入G2静止期，加入受试化合物用ELISA方法检测核仁蛋白(nucleolin)的磷酸化形式，从而得到从G2期释放进入期的细胞数量，即抑制G2检查点程度。细胞周期分为四个阶段：即G1期(DNA合成前期)、s期(DNA合成期)、G2期(DNA合成后期)和M期(有丝分裂期)。G0期

42、细胞也称休眠细胞。本讲稿第七十一页，共八十五页e.信号转导通路信号转导通路Su等建立了TGF3通路作用物的高通量筛选方法。构建融合报告基因，转染细胞，选择虫荧光素酶表达能被TGF高诱导的克隆。将细胞植于96孔板，与受试化合物孵育后，稀释并加入Steady-Glo底物测虫荧光素酶活力，与对照比较，计算相对酶活性增加值。本讲稿第七十二页，共八十五页f.细菌蛋白分泌细菌蛋白分泌Alksne等建立了以抑制细菌蛋白分泌为作用方式的新型抗生素的高通量筛选方法。该方法基于SecA-lacZ融合报告基因。SecA是一种自我调控翻译的蛋白，当细菌蛋白分泌被干扰时，该报告基因被诱导。本讲稿第七十三页，共八十五页g

43、.细菌生长细菌生长Chung等建立了抑制分枝杆菌生长化合物的高通量筛选方法。选择了一种腐生性分枝杆菌代替结核分枝杆菌，因其具有生长迅速以及非感染性的特点。通过测定细胞摄入放射性标记的尿嘧啶，考察受试化合物对分枝杆菌活力的作用。本讲稿第七十四页，共八十五页2生药活性成分的高通量筛选生药活性成分的高通量筛选样品库来源的化学多样性是决定高通量筛选技术能否成功的关键因素之一。从天然产物分离出来的化合物，其母核结构和活性基团是长期的自然选择形成的，它们通过高通量筛选所表现出来的生物活性在药物发现中具有人工合成化合物所不能比拟的优势。本讲稿第七十五页，共八十五页我国拥有非常丰富的药材资源。仅仅依靠传统的药

44、理实验方法筛选，既耗时，劳动强度又大，还需要使用大量实验动物，显然不能适应大量样品的同时筛选。使大量分离出的化合物得不到充分的利用，造成了化合物资源的极大浪费。将高通量筛选技术应用于生药的活性成分研究，既是对高通量筛选技术的不断完善，又是将这一技术应用于中药现代化研究的有益尝试。如何对生药的活性成分进行高通量筛选呢？其原理、方法和人工合成化合物的高通量筛选基本一致，区别主要在于筛选前筛选前需要从生药中将化合物提取出来并进行适当的分离和化学多样性的评价。相同的就不再赘述，这里主要谈一下提取、分离和多样性评价的问题。本讲稿第七十六页，共八十五页(1)提取提取由于高通量筛选需要大量的样品来源，常规的

45、提取方法显然不能满足这一要求。寻找一个快速、高效、连续、自动化的提取方法显得迫在眉睫。加速溶剂提取技术加速溶剂提取技术是近年来发展起来的一个新的提取技术，在准备好样品和对提取方法（或程序）进行设定后，自动进样和自动收集装置就可以连续对最多24个不同样品自动完成样品的提取和提取液的收集，简单方便。应用这一技术，可以得到大量的生药的提取物。本讲稿第七十七页，共八十五页加速溶剂萃取(ASE)是采用常规溶剂,在较高的温度(50200)和压力(10003000psi或10.320.6MPa)下对固体或半固体样品进行萃取的新颖的样品前处理技术,具有操作简便、省时、省溶剂、减少有机溶剂对环境的污染、萃取操作

46、自动化的特点本讲稿第七十八页，共八十五页(2)分离分离生药的化学成分相当复杂，通过提取得到的提取物往往是大量单体混合物，所以筛选前需要对生药的提取物进行适当的分离。在众多的分离手段中，制备型HPLC应该是最为理想的，它具有快速、高效、自动化等诸多优点。本讲稿第七十九页，共八十五页 （3）化学多样性评价）化学多样性评价 分离完成后还需要对分离的物质进行化学多样性的评价，以提高高通量筛选的效率。以前，这种评价多是基于物种的地理分布、生物学分类、化学分类等关系，近年来，随着科技的进步，多种现代化手段开始应用于化学多样性的评价。本讲稿第八十页，共八十五页色谱-电喷雾-质谱联用（HPLC-ESI-MS）

47、技术做出了有力的尝试。首先，它做出成分的离子信号（m/z）对保留时间的平面图平面图，然后对这些数据进行统计学的相似度评估相似度评估对样品的多样性进行定量的评价。接着，三维的HPLC数据被转换数据被转换为CDF文件格式并传输到UNIX工作站。数据文件中的每一个离子（包括保留时间、质量、离子强度等数据）被定位在一个二维图谱中，保留时间和质量分占一个轴，离子强度数据储存在位点中。滤除噪声以后，离子的中心时间和中心质量被计算出来。根据对LCMS的数据处理，混合物间的相似度被定量地计算出来。这种数据处理表征了样品1中的离子i和样品2中的离子j的“化学空间”距离。本讲稿第八十一页，共八十五页其中，ti表示

48、离子i的色谱保留时间，mi表示离子i的质荷比（m/z），wt是保留时间的权重系数，wm是质量的权重系数。dij是离子i和离子j的欧几里的距离，n1和n2分别是样品1和样品2中确认的离子数。sij是离子i和离子j之间的相似度（0-1），相似度值为1表明是相同样品，相反，相似度值接近0则表明样品具有很高的化学多样性。通过这种方法，可以很好的解决样品化学多样性的评价问题。本讲稿第八十二页，共八十五页3高通量筛选的局限性高通量筛选是药物筛选的一种方法，它并不是一种万能的手段，特别是在中药研究方面，其局限性也是十分明显的。本讲稿第八十三页，共八十五页首先，高通量筛选所采用的主要是分子、细胞水平的体外实验

49、模型，因此任何模型都不可能充分反映药物的全面药理作用；其次，用于高通量筛选的模型是有限的和不断发展的，要建立反映机体全部生理机能或药物对整个机体作用的理想模型，也是不现实的。但我们应该相信，任何技术的进步，都将为科学的发展起到促进作用。随着我们对高通量筛选研究的不断深入，随着对筛选模型的评价标准、新的药物作用靶点的研究以及对筛选模型的新颖性和实用性的统一，高通量筛选这一药物筛选新技术必将在未来的药物研究中发挥越来越重要的作用。本讲稿第八十四页，共八十五页第八章1、什么叫HTS2、HTS由那几部分组成3、如何进行HTS4、有哪些HTS模型5、HTS样品库有哪些6、HTS有哪些检测方法7、HTS数据库有哪些功能8、生药活性成分的HTS有什么特点本讲稿第八十五页，共八十五页