高山红景天叶肉原生质体分离培养与植株再生精选文档.ppt

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1、高山红景天叶肉原生质体分离培养与植株再生2022/10/202022/10/201 1本讲稿第一页，共二十四页目的：利用高山红景天组培苗叶片分离得到原生质体，经培养后获得再生植株。方法：研究外植体前期预处理、外植体的大小、酶液配比、酶液中甘露醇浓度等影响原生质体的相关因素，确定最优条件。2022/10/202022/10/202 2本讲稿第二页，共二十四页 高山红景天2022/10/202022/10/203 3本讲稿第三页，共二十四页高山红景天人工高山红景天人工栽培利用的研究栽培利用的研究高山红景天2022/10/202022/10/204 4本讲稿第四页，共二十四页高山红景天：为景天科红景

2、天属多年生草本植物，是长白山珍稀药用植物之一，具有抗缺氧、抗寒冷、抗疲劳、抗微波辐射等显著功能。2022/10/202022/10/205 5本讲稿第五页，共二十四页 一一 材料和方法材料和方法 1.材料 高山红景天组 培苗叶片2022/10/202022/10/206 6本讲稿第六页，共二十四页2.原生质体分离：取材：幼嫩叶片取材：幼嫩叶片(长长 0.50.53 3）切成宽）切成宽1.01.02.0 mm 2.0 mm 的的条状条状酶液配制：酶液配制：0.5%0.5%2%2%纤维素酶纤维素酶 +0.3%0.3%1%1%果胶果胶酶酶 +10 mmol/L CaCl2 10 mmol/L CaC

3、l2 2H2O 2H2O+0.1%MES 0.1%MES+0.7 0.7 mmol/L KH2 PO4 mmol/L KH2 PO4+0.40.40.6mol/L 0.6mol/L 甘露醇甘露醇,p H=,p H=5.85.8酶解处理：以酶解处理：以1 1 10 10 的量将材料放入的量将材料放入酶液酶液。于。于25 25,黑黑暗条件下振荡酶解暗条件下振荡酶解1 15h,5h,转速为转速为80 r/min 80 r/min。2022/10/202022/10/207 7本讲稿第七页，共二十四页3.原生质体纯化：酶解后的原生质体和酶混合液经250 目的尼龙网滤过后以800 r/min 离心8mi

4、n 沉降原生质体。向沉降的原生质体中再加入洗涤液和液体培养基各清洗1 次备用。洗涤液：10mmol/L CaCl2 2H2O +0.1%MES +0.7mmol/LKH2 PO4 +0.4 mol/L 甘露醇,p H=5.8液体培养基：液体培养基：1/2MS+1 mg/L 2,42D +0.5 mg/L ZT +0.5 mol/L 甘露醇 +5 00 mg/L 水解酪蛋白。2022/10/202022/10/208 8本讲稿第八页，共二十四页4.原生质体存活率及产量的测定：活力测定:采用EvansBlue 染色法，存活率=(未染蓝细胞数/细胞总数)100%。原生质体产量:用血球计数板进行计数,

5、以每克鲜质量组织获得的原生质体个数(个/g)来表示.2022/10/202022/10/209 9本讲稿第九页，共二十四页5.原生质体培养：将原生质体密度调到210 105 个/mL,转入原生质体液体培养基中进行液体浅层黑暗静置培养。在培养过程中每10 d 以3 1(原生质体培养基无渗透压调节剂培养基)比例加入无渗透压调节剂培养基,逐步降低渗透压。2022/10/202022/10/201010本讲稿第十页，共二十四页6.愈伤培养与植株再生:当多细胞团进一步增大当多细胞团进一步增大,形成肉眼可见的小愈伤组织时形成肉眼可见的小愈伤组织时,挑出并转移到愈伤组织培养基挑出并转移到愈伤组织培养基MS+

6、6-BA 2 mg/L+NAA 0.5 MS+6-BA 2 mg/L+NAA 0.5 mg/L,mg/L,转为光照培养之前转为光照培养之前,首先经过首先经过2 23 d 3 d 的弱光培养锻炼的弱光培养锻炼阶段阶段,然后转入光照培养然后转入光照培养,继续培养约继续培养约1 1 个月时间。个月时间。经经3 3 次继代培养后次继代培养后,挑选鲜绿色愈伤组织转入芽分化培养挑选鲜绿色愈伤组织转入芽分化培养基基MS+1 mg/L 6-BA+0.1 mg/L NAA,MS+1 mg/L 6-BA+0.1 mg/L NAA,待小芽长至待小芽长至2.0 2.0 cm cm 左右左右,切下转入生根培养基上形成完

7、整植株切下转入生根培养基上形成完整植株,生根培养基生根培养基为为1/2MS1/2MS。培养基。培养基p H=5.8-6.0,p H=5.8-6.0,琼脂琼脂6 g/L,6 g/L,蔗糖蔗糖25 g/L 25 g/L,在在1.2 kg/cm21.2 kg/cm2压力下灭菌压力下灭菌20 min,20 min,培养温度培养温度(25 2)(25 2),光光照强度为照强度为2 0002 0003 000 lx,3 000 lx,每天光照每天光照12 h 12 h。2022/10/202022/10/201111本讲稿第十一页，共二十四页 二、结果与分析影响天原生质影响天原生质体分离的因素体分离的因素

8、光光叶片大小叶片大小酶类组合酶类组合2022/10/202022/10/201212本讲稿第十二页，共二十四页1.光照与黑暗2022/10/202022/10/201313本讲稿第十三页，共二十四页结果表明：在相同酶解条件下，光照与黑暗处理对高山红景天原生质体产量间差异不显著，因此，在进行原生质体分离以前，对组培苗是否光照不是影响原生质体产量的关键因素。在此实验中，直接采取没有进行黑暗预培养的组培苗进行原生质体分离。2022/10/202022/10/201414本讲稿第十四页，共二十四页2.叶片大小2022/10/202022/10/201515本讲稿第十五页，共二十四页在相同酶解条件下，长

9、度大于1.5cm的叶片原生质体产量显著高于长度小于1.5cm的处理，因此，选用长度大于1.5cm的叶片为宜。2022/10/202022/10/201616本讲稿第十六页，共二十四页3.酶类组合 纤维素酶与果胶酶组合2022/10/202022/10/201717本讲稿第十七页，共二十四页 各处理存活率大小顺序为:1 4 5 2 7 3 8 6 9 各处理产量大小顺序为:5 3 6 2 7 4 8 1 9综合来看，处理5的产量显著高于其他处理，因此，采用处理5 的酶液组合（1%纤维素酶+0.5%果胶酶）可获得最大存活原生质体产量。2022/10/202022/10/201818本讲稿第十八页，

10、共二十四页4.酶解时间与酶液中甘露醇浓度对高山红景天原生质体产量的影响：2022/10/202022/10/201919本讲稿第十九页，共二十四页时间影响：14 h随酶解时间的延长，原生质体产量递增，在4 h时达到最高值，以后随时间的延长，产量下降。酶解后期的产量和存活率下降，是由于酶解液长时间浸泡造成部分原生质体破裂和损伤引起的。2022/10/202022/10/202020本讲稿第二十页，共二十四页酶液中甘露醇对原生质体产量和存活率的影响：酶液中采用0.5 mol/L 甘露醇的处理经纯化后呈圆球型，可观察到大量叶绿体的存在。因此，酶液采用0.5 mol/L 的甘露醇用于维持原生质体渗透压

11、效果较好。2022/10/202022/10/202121本讲稿第二十一页，共二十四页高山红景天原生质体培养与植株再生：将纯化的原生质体密度调到2105 5个/mL,在黑暗条件下进行液体浅层培养，经3天可见第一次细胞分裂，约40d时，可形成肉眼可见的愈伤组织。经过23d 的弱光培养，将愈伤组织转移到培养基MS+2mg/L NAA上精心光照培养。继续培养约45d时，愈伤组织生长旺盛，并有少量芽体萌发，挑选鲜绿色愈伤组织转入芽分化培养基MS+1mg/L6-BA NAA进行芽诱导，待芽长到2.0cm 左右，切下转入1/2生根培养基上形成完整植株。2022/10/202022/10/202222本讲稿第二十二页，共二十四页高山红景天原生质体分离纯化、培养分化与植株再生2022/10/202022/10/202323本讲稿第二十三页，共二十四页到此结束，谢谢！2022/10/202022/10/202424本讲稿第二十四页，共二十四页