蛋白质化学蛋白质结构与功能的关系精选PPT.ppt

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1、关于蛋白质化学蛋白质结构与功能的关系第1页，讲稿共76张，创作于星期三第二章 蛋白质protein第2页，讲稿共76张，创作于星期三第五节第五节蛋白质结构与功能的关系蛋白质结构与功能的关系（The Relation of Structure and Function of Protein）第3页，讲稿共76张，创作于星期三（一）一级结构是空间构象的基础（一）一级结构是空间构象的基础 一、蛋白质一级结构与功能的关系一、蛋白质一级结构与功能的关系 牛胰核糖核酸牛胰核糖核酸酶的一级结构酶的一级结构二二硫硫键键第4页，讲稿共76张，创作于星期三 天然状态，天然状态，有催化活性有催化活性 尿素、尿素、-

2、巯基乙醇巯基乙醇 去除尿素、去除尿素、-巯基乙醇巯基乙醇非折叠状态，无活性非折叠状态，无活性第5页，讲稿共76张，创作于星期三v多肽链中氨基酸的排列顺序决定了肽多肽链中氨基酸的排列顺序决定了肽链的折叠和卷曲方式链的折叠和卷曲方式部分氨基酸残基在蛋白质空间结构中处于部分氨基酸残基在蛋白质空间结构中处于关键位置关键位置第6页，讲稿共76张，创作于星期三1、种属差异、种属差异同源蛋白同源蛋白（homologous protein)在不同生物体中行使相同或相似功能在不同生物体中行使相同或相似功能的蛋白质。的蛋白质。同源蛋白质的氨基酸顺序具同源蛋白质的氨基酸顺序具有明显的相似性即为序列同源。有明显的相似

3、性即为序列同源。（二）一级结构与功能的关系（二）一级结构与功能的关系 第7页，讲稿共76张，创作于星期三如不同哺乳动物的胰岛素如不同哺乳动物的胰岛素分子结构都由分子结构都由A A和和B B两条链组成，两条链组成，且二硫键的配对和空间构象极其相似。一级结构也相似，且二硫键的配对和空间构象极其相似。一级结构也相似，仅有个别氨基酸有差异，因此它们都执行着相同的仅有个别氨基酸有差异，因此它们都执行着相同的调节调节糖代谢糖代谢的生理功能。的生理功能。同源蛋白的一级结构中有许多位置的氨基酸对所有同源蛋白的一级结构中有许多位置的氨基酸对所有种属来说都是相同的，称为种属来说都是相同的，称为不变残基不变残基（i

4、nvariant residue）。其他位置的氨基酸差异较大，称为。其他位置的氨基酸差异较大，称为可可变残基变残基（variable residue）。第8页，讲稿共76张，创作于星期三哺乳动物胰岛素氨基酸序列差异哺乳动物胰岛素氨基酸序列差异胰岛素胰岛素人人猪猪狗狗兔兔牛牛羊羊马马 氨基酸残基序列号氨基酸残基序列号A5ThrThrThrThrAlaAlaThrA6Ser SerSerGlyGlySerSerA10 Ile Ile Ile IleValValIleB30ThrAlaAlaSerAlaAlaAla第9页，讲稿共76张，创作于星期三 是一种与血红素辅基共价结合的单链蛋白，存在于是一种

5、与血红素辅基共价结合的单链蛋白，存在于真核生物线粒体中。相对分子量约为真核生物线粒体中。相对分子量约为13,00013,000，含有，含有104104个氨基酸残基。近个氨基酸残基。近100100个种属的细胞色素个种属的细胞色素c c氨基酸氨基酸顺序已被测定。顺序已被测定。肽链中肽链中2828个位置的氨基酸个位置的氨基酸对所有已对所有已测试的种属都相同的，测试的种属都相同的，表明，这些残基是规定细胞色表明，这些残基是规定细胞色素素c c功能所必需的。功能所必需的。细胞色素细胞色素c（cytochrome c,Cyt.c）第10页，讲稿共76张，创作于星期三生物名称生物名称与人不同的氨与人不同的氨

6、基酸参加数目基酸参加数目生物名称生物名称与人不同的氨与人不同的氨基酸参加数目基酸参加数目黑猩猩黑猩猩0响尾蛇响尾蛇14恒河猴恒河猴1海海龟龟15兔兔9金金枪鱼枪鱼21袋鼠袋鼠10角角鲛鲛23牛、猪、羊牛、猪、羊10小小蝇蝇25狗狗11蛾蛾31驴驴11小麦小麦35马马12粗糙粗糙链孢链孢菌菌43鸡鸡、火、火鸡鸡13酵母菌酵母菌44不同生物与人细胞色素不同生物与人细胞色素c的氨基酸数目比较的氨基酸数目比较第11页，讲稿共76张，创作于星期三 狗狗人人猴猴 马马骡骡 鲸鲸 兔兔猪猪袋鼠袋鼠企鹅企鹅鸡鸡 鸭鸭响尾蛇响尾蛇龟龟苍蝇苍蝇 蛾蛾脉孢菌属脉孢菌属念珠菌属念珠菌属面包酵母菌面包酵母菌小麦小麦牛牛

7、 蛙蛙金枪鱼金枪鱼动动 物物爬行动物爬行动物两栖动物两栖动物鱼鱼哺乳动物哺乳动物鸟鸟昆昆 虫虫植植 物物脊椎动物脊椎动物从细胞色素从细胞色素C的一级结构看生物进化的一级结构看生物进化生物进化生物进化第12页，讲稿共76张，创作于星期三2、一级结构改变引起分子病、一级结构改变引起分子病 例：镰刀形红细胞贫血例：镰刀形红细胞贫血N-val his leu thr pro glu glu C(146)HbS 肽链肽链HbA 肽肽 链链N-val his leu thr pro val glu C(146)基因突变导致蛋白质一级结构的突变，导致基因突变导致蛋白质一级结构的突变，导致蛋白质生物功能的下降

8、或丧失，蛋白质生物功能的下降或丧失，这种由蛋白质分这种由蛋白质分子发生变异所导致的疾病，子发生变异所导致的疾病，称为称为“分子病分子病（molecular disease）”。第13页，讲稿共76张，创作于星期三 最早从分子水平证最早从分子水平证明的先天性遗传病明的先天性遗传病镰刀形红细胞贫血镰刀形红细胞贫血症症(sickle-cell anemia)。镰刀形红细胞镰刀形红细胞正常血细胞正常血细胞hemoglobin 6:GAA(Glu)-GTA(Val)第14页，讲稿共76张，创作于星期三3、蛋白质前体的激活、蛋白质前体的激活 一些蛋白质或酶在细胞中一些蛋白质或酶在细胞中首先合成的是其前体首

9、先合成的是其前体,在成为在成为有功能的蛋白质或酶之前有功能的蛋白质或酶之前需要激活需要激活.例如例如,胰岛素胰岛素(insulin).的的前体是胰岛素原前体是胰岛素原(proinsulin),要在切除要在切除C肽肽之后才转变为活性的胰岛之后才转变为活性的胰岛素素胰岛素原的一级结构胰岛素原的一级结构第16页，讲稿共76张，创作于星期三一级结构差异越小，功能相关性越大。一级结构差异越小，功能相关性越大。一级结构上的细微变化可直接影响其功能一级结构上的细微变化可直接影响其功能第17页，讲稿共76张，创作于星期三（一）血红蛋白与肌红蛋白的结构（一）血红蛋白与肌红蛋白的结构 二、蛋白质空间结构与功能的关

10、系二、蛋白质空间结构与功能的关系 第18页，讲稿共76张，创作于星期三1 1、血红素、血红素 肌红蛋白肌红蛋白(myoglobin,Mb)与血与血红蛋白都是含有红蛋白都是含有血红素血红素辅基的蛋辅基的蛋白质。血红素是铁卟啉化合物，白质。血红素是铁卟啉化合物，由由4个甲炔基相连成为一个环形，个甲炔基相连成为一个环形，Fe2+居于环中。居于环中。铁离子有铁离子有6个配位个配位键，其中键，其中4个与吡咯环的个与吡咯环的N配位结配位结合，合，1个配位键和肌红蛋白的个配位键和肌红蛋白的93位位组氨酸残基结合，氧则与组氨酸残基结合，氧则与Fe2+形形成第成第6个配位键，接近第个配位键，接近第64位位（E7

11、)组氨酸组氨酸。第19页，讲稿共76张，创作于星期三肌红蛋白（肌红蛋白（myoglobin,Mb）肌红蛋白是一个肌红蛋白是一个只有三级结只有三级结构构的蛋白质，有的蛋白质，有8段段-螺旋结构，螺旋结构，分别成为分别成为A B C D E F G H肽段。肽段。整条多肽链折叠成紧密球状分整条多肽链折叠成紧密球状分子，氨基酸残基上的疏水侧链子，氨基酸残基上的疏水侧链大都在分子内部，富极性及电大都在分子内部，富极性及电荷的则在分子表面，因此水溶荷的则在分子表面，因此水溶性较好。性较好。Mb分子内部有个袋分子内部有个袋形空穴，血红素居于其中。形空穴，血红素居于其中。第20页，讲稿共76张，创作于星期三

12、血红蛋白（血红蛋白（hemoglobin,Hb）血红蛋白具有四个亚基组成血红蛋白具有四个亚基组成的四级结构，每个亚基中间有一的四级结构，每个亚基中间有一个疏水局部，可携带一个血红素个疏水局部，可携带一个血红素并携带一分子氧，并携带一分子氧，因此因此1分子分子Hb共结合四分子氧共结合四分子氧。Hb各亚基的各亚基的三级结构与三级结构与Mb极为相似。极为相似。Hb亚亚基之间通过八对盐键，使四个基之间通过八对盐键，使四个亚基紧密结合而形成亲水的球亚基紧密结合而形成亲水的球状蛋白。状蛋白。第21页，讲稿共76张，创作于星期三Hb与与Mb一一样样能能可可逆逆地地与与O2结结合合，Hb与与O2结结合合后后称

13、称为为氧氧合合Hb。氧氧合合Hb占占总总Hb的的百百分分数数（称称百百分分饱饱和和度度）随随O2浓浓度度变变化化而改变。而改变。2、血红蛋白的构象变化与结合氧、血红蛋白的构象变化与结合氧 第22页，讲稿共76张，创作于星期三*协同效应协同效应(cooperativity)一个寡聚体蛋白质的一个亚基与其配体结合后，能一个寡聚体蛋白质的一个亚基与其配体结合后，能影响此寡聚体中另一个亚基与配体结合能力的现象，称影响此寡聚体中另一个亚基与配体结合能力的现象，称为为协同效应协同效应。如果是促进作用则称为如果是促进作用则称为正协同效应正协同效应 (positive cooperativity)如果是抑制作

14、用则称为如果是抑制作用则称为负协同效应负协同效应 (negative cooperativity)第23页，讲稿共76张，创作于星期三抗体抗体生物体内最奇妙的分子生物体内最奇妙的分子无限的多样性（无限的多样性（diversity)功能与结构的双重性功能与结构的双重性 可变区可变区抗原结合抗原结合 恒定区恒定区生物学效应功能生物学效应功能（二）免疫球蛋白的结构与功能（二）免疫球蛋白的结构与功能第24页，讲稿共76张，创作于星期三（1）抗体的基本结构）抗体的基本结构Ig分子基本结构分子基本结构是由四个肽链组是由四个肽链组成的。成的。包括二条较小的包括二条较小的轻链和二条较大轻链和二条较大的重链。的

15、重链。轻链与重链之间轻链与重链之间是由二硫键连接是由二硫键连接形成形成Ig分子单体。分子单体。第25页，讲稿共76张，创作于星期三（1）抗体的基本结构）抗体的基本结构第26页，讲稿共76张，创作于星期三（2）可变区和恒定区）可变区和恒定区可变区可变区和抗原识别有关，决定抗体识别的特异性，而和抗原识别有关，决定抗体识别的特异性，而恒定区恒定区和效应功能相关。和效应功能相关。此外在此外在Y形分子伸出的两臂和主干之间还有个可弯曲的形分子伸出的两臂和主干之间还有个可弯曲的铰链区铰链区(hinge R)，能改变两个结合抗原的，能改变两个结合抗原的Y形臂之形臂之间的距离。间的距离。两臂之间的角度可有自两臂

16、之间的角度可有自0到到90的变化，这样有利于的变化，这样有利于两臂同时结合位于抗原上分布于不同位置的表位。两臂同时结合位于抗原上分布于不同位置的表位。第27页，讲稿共76张，创作于星期三铰链区第28页，讲稿共76张，创作于星期三Ig的铰链区及其功能第29页，讲稿共76张，创作于星期三（三）蛋白质构象改变与疾病（三）蛋白质构象改变与疾病 蛋蛋白白质质构构象象疾疾病病：若若蛋蛋白白质质的的折折叠叠发发生生错错误误，尽尽管管其其一一级级结结构构不不变变，但但蛋蛋白白质质的的构构象象发发生生改改变变，仍仍可可影影响响其其功功能能，严严重重时可导致疾病发生。时可导致疾病发生。第30页，讲稿共76张，创作

17、于星期三蛋白质构象改变导致疾病的机理：蛋白质构象改变导致疾病的机理：有些蛋白质错有些蛋白质错误折叠后相互聚集，常形成抗蛋白水解酶的淀粉样误折叠后相互聚集，常形成抗蛋白水解酶的淀粉样纤维沉淀，产生毒性而致病，表现为蛋白质淀粉样纤维沉淀，产生毒性而致病，表现为蛋白质淀粉样纤维沉淀的病理改变。纤维沉淀的病理改变。这类疾病包括：这类疾病包括：人纹状体脊髓变性病、老年人纹状体脊髓变性病、老年痴呆症、亨停顿舞蹈病、疯牛病等。痴呆症、亨停顿舞蹈病、疯牛病等。第31页，讲稿共76张，创作于星期三疯牛病中的蛋白质构象改变疯牛病中的蛋白质构象改变疯牛病是由朊病毒蛋白疯牛病是由朊病毒蛋白(prion protein

18、,PrP)引引起的一组人和动物神经退行性病变。起的一组人和动物神经退行性病变。正常的正常的PrP富含富含-螺旋，称为螺旋，称为PrPc。PrPc在某种未知蛋白质的作用下可转变成全为在某种未知蛋白质的作用下可转变成全为-折叠的折叠的PrPsc，从而致病。，从而致病。PrPc-螺旋螺旋PrPsc-折叠折叠正常正常疯牛病疯牛病第32页，讲稿共76张，创作于星期三第六节第六节蛋白质的性质与分离、分析技术蛋白质的性质与分离、分析技术第33页，讲稿共76张，创作于星期三一、蛋白质的性质一、蛋白质的性质相对分子质量很大，一般介于相对分子质量很大，一般介于10 000-1 000 000道尔道尔顿顿之间，也有

19、更大的。之间，也有更大的。测定分子量的方法很多：测定分子量的方法很多：渗透压法、超离心法、凝胶渗透压法、超离心法、凝胶过滤法、聚丙烯酰胺凝胶电泳等。过滤法、聚丙烯酰胺凝胶电泳等。（一）蛋白质相对分子质量（一）蛋白质相对分子质量第34页，讲稿共76张，创作于星期三（二）蛋白质的两性性质及等电点（二）蛋白质的两性性质及等电点蛋蛋白白质质分分子子除除两两端端的的氨氨基基和和羧羧基基可可解解离离外外，氨氨基基酸酸残残基基侧侧链链中中某某些些基基团团，在在一一定定的的溶溶液液pHpH条条件件下下都都可可解解离成带负电荷或正电荷的基团。离成带负电荷或正电荷的基团。蛋白质的等电点蛋白质的等电点(isoele

20、ctric point,pI)当当蛋蛋白白质质溶溶液液处处于于某某一一pH时时，蛋蛋白白质质解解离离成成正正、负负离离子子的的趋趋势势相相等等，即即成成为为兼兼性性离离子子，净净电电荷荷为为零零，此此时溶液的时溶液的pH称为称为蛋白质的等电点。蛋白质的等电点。第35页，讲稿共76张，创作于星期三 各各种种蛋蛋白白质质有有特特定定的的等等电电点点，和和它它所所含含的的氨氨基基酸酸种种类类和数量有关。和数量有关。例：含有碱性氨基酸较多，则例：含有碱性氨基酸较多，则pI偏碱（偏大）偏碱（偏大）含有酸性氨基酸较多，则含有酸性氨基酸较多，则pI偏酸（偏小）；偏酸（偏小）；含含有有酸酸、碱碱氨氨基基酸酸数

21、数目目相相近近时时，pI为为中中性性偏偏酸酸，约为约为5.0左右。左右。pHpI，蛋蛋白白质质带带负负电电，体体内内蛋蛋白白质质的的pI大大多多为为5.0左右，故生理条件下一般以左右，故生理条件下一般以负离子负离子形式存在。形式存在。第36页，讲稿共76张，创作于星期三蛋白质蛋白质 酸性氨基酸数酸性氨基酸数 碱性氨基酸数碱性氨基酸数 pIpI胃蛋白酶胃蛋白酶 37 6 1.037 6 1.0胰岛素胰岛素 4 4 5.354 4 5.35RNARNA酶酶 10 18 7.8 10 18 7.8细胞色素细胞色素c 12 25 9.8c 12 25 9.810.810.8等电点时，蛋白质以两性离子存

22、在，最不稳定，等电点时，蛋白质以两性离子存在，最不稳定，溶解度最小，溶解度最小，易沉淀析出易沉淀析出（用于蛋白质的分离提纯）；蛋白质的粘度、（用于蛋白质的分离提纯）；蛋白质的粘度、渗透压、膨胀性以及导电能力均最小。渗透压、膨胀性以及导电能力均最小。第37页，讲稿共76张，创作于星期三（三）蛋白质的变性与复性（三）蛋白质的变性与复性 *蛋白质的变性蛋白质的变性(denaturation)在某些物理和化学因素作用下，其特定的在某些物理和化学因素作用下，其特定的空空间构象被破坏间构象被破坏（即有序的空间结构变成无序的空（即有序的空间结构变成无序的空间结构），从而导致其间结构），从而导致其理化性质改变

23、和生物活性理化性质改变和生物活性的丧失的丧失。第38页，讲稿共76张，创作于星期三造成变性的因素造成变性的因素物理因素：物理因素：加热、紫外线、加热、紫外线、X线、超声波线、超声波化学因素：化学因素：乙醇等有机溶剂、强酸、强乙醇等有机溶剂、强酸、强 碱、重金属离子及生物碱试剂等碱、重金属离子及生物碱试剂等。变性的本质变性的本质 破坏非共价键和二硫键，破坏非共价键和二硫键，不改变蛋白不改变蛋白质的一级结构。质的一级结构。第39页，讲稿共76张，创作于星期三变性特征：变性特征：生物活性丧失；生物活性丧失；理化性质改变：理化性质改变：溶解度降低、球状蛋白质的不对称溶解度降低、球状蛋白质的不对称性增加

24、、粘度增加、扩散系数降低，某些蛋白质不能性增加、粘度增加、扩散系数降低，某些蛋白质不能够再形成结晶够再形成结晶,变性后分子结构松散、易被水解，变性后分子结构松散、易被水解，变性蛋白易被酶消化。变性蛋白易被酶消化。组成和相对分子质量不变组成和相对分子质量不变第40页，讲稿共76张，创作于星期三若若蛋蛋白白质质变变性性程程度度较较轻轻，去去除除变变性性因因素素后后，蛋蛋白白质质仍仍可可恢恢复复或或部部分分恢恢复复其其原原有有的构象和功能，称为的构象和功能，称为复性复性。蛋白质的复性蛋白质的复性(renaturation)第41页，讲稿共76张，创作于星期三Anfinsen实验实验-牛胰核糖核酸酶的

25、变性和复性牛胰核糖核酸酶的变性和复性结论：结论：蛋白质的变性是可逆的；一级结构决定三维结蛋白质的变性是可逆的；一级结构决定三维结构；形成三维结构所需要的所有信息都包含在一级结构；形成三维结构所需要的所有信息都包含在一级结构中。构中。第42页，讲稿共76张，创作于星期三（四）蛋白质的胶体性质（四）蛋白质的胶体性质 蛋蛋白白质质属属于于生生物物大大分分子子之之一一，分分子子量量可可自自1万万至至100万万之之巨巨，其其分分子子的的直直径径可可达达1100nm，为为胶粒范围之内。胶粒范围之内。*蛋白质胶体稳定的因素蛋白质胶体稳定的因素颗粒表面电荷颗粒表面电荷水化膜水化膜第43页，讲稿共76张，创作于

26、星期三+带正电荷的蛋白质带正电荷的蛋白质带负电荷的蛋白质带负电荷的蛋白质在等电点的蛋白质在等电点的蛋白质水化膜水化膜+带正电荷的蛋白质带正电荷的蛋白质带负电荷的蛋白质带负电荷的蛋白质不稳定的蛋白质颗粒不稳定的蛋白质颗粒酸酸碱碱酸酸碱碱酸酸碱碱脱水作用脱水作用脱水作用脱水作用脱水作用脱水作用溶液中蛋白质的聚沉溶液中蛋白质的聚沉第44页，讲稿共76张，创作于星期三蛋蛋白白质质由由于于带带有有电电荷荷和和水水膜膜，因因此此在在水水溶溶液液中中能能成成为为稳稳定定的的胶胶体体。如如果果在在蛋蛋白白质质溶溶液液中中加加入入某某种种电电解解质质或或调调节节溶溶液液pHpH，破破坏坏了了蛋蛋白白质质的的水水

27、化化膜膜及及中中和和了了蛋蛋白白质质的的电电荷荷，则则蛋蛋白白质质从从溶溶液液中中析析出出的的作作用用，称称为蛋白质的沉淀作用。为蛋白质的沉淀作用。变变性性的的蛋蛋白白质质易易于于沉沉淀淀，有有时时蛋蛋白白质质发发生生沉沉淀淀，但但并不变性。并不变性。根据反应的可逆性分为根据反应的可逆性分为可逆沉淀可逆沉淀和和不可逆沉淀不可逆沉淀两种。两种。（五）蛋白质的沉淀反应（五）蛋白质的沉淀反应第45页，讲稿共76张，创作于星期三1、可逆的沉淀作用、可逆的沉淀作用定义：定义：蛋白质发生沉淀后，用透析等方法除去沉淀剂，蛋白质发生沉淀后，用透析等方法除去沉淀剂，可使蛋白质重新溶于原来的溶液中。可使蛋白质重新

28、溶于原来的溶液中。在沉淀过程中，在沉淀过程中，结构和性质都没有发生变化，结构和性质都没有发生变化，在适当在适当的条件下，可以重新溶解形成溶液，所以这种沉淀又的条件下，可以重新溶解形成溶液，所以这种沉淀又称为称为非变性沉淀非变性沉淀。可逆沉淀是分离和纯化蛋白质的基本方法，可逆沉淀是分离和纯化蛋白质的基本方法，如如等电点沉等电点沉淀法、盐析法和有机溶剂沉淀法淀法、盐析法和有机溶剂沉淀法等。等。第46页，讲稿共76张，创作于星期三反应类型：反应类型：（1）加高浓度盐类）加高浓度盐类:如硫酸铵、硫酸钠、氯化钠等如硫酸铵、硫酸钠、氯化钠等 盐析：盐析：加盐使蛋白质沉淀析出的现象加盐使蛋白质沉淀析出的现象

29、 不不同同的的蛋蛋白白质质盐盐析析时时所所需需的的盐盐浓浓度度不不同同，调调节节盐盐浓度可将混合蛋白质分段析出（分段盐析）。浓度可将混合蛋白质分段析出（分段盐析）。例：例：半饱和的半饱和的(NH4)2SO4可使球蛋白沉淀；可使球蛋白沉淀；饱和的饱和的(NH4)2SO4可使清蛋白析出。可使清蛋白析出。应用：应用：利用此性质可分离和制备各种蛋白质和酶制品利用此性质可分离和制备各种蛋白质和酶制品第47页，讲稿共76张，创作于星期三（2）加有机溶剂：）加有机溶剂：如酒精、丙酮等如酒精、丙酮等机机理理：有有机机溶溶剂剂和和水水有有较较强强的的作作用用，破破坏坏了了蛋蛋白质分子周围的水膜，因此发生沉淀反应

30、。白质分子周围的水膜，因此发生沉淀反应。（3）等电点沉淀）等电点沉淀 利利用用蛋蛋白白质质的的两两性性性性质质，在在等等电电点点时时溶溶解解度度最最小的特点。小的特点。在在pI时时，加加入入这这些些有有机机溶溶剂剂可可加加速速蛋蛋白白质质的的沉沉淀淀，可用于蛋白质的分离纯化。可用于蛋白质的分离纯化。第48页，讲稿共76张，创作于星期三定义：定义：蛋白质发生沉淀后，不能用透析等方法除去沉淀蛋白质发生沉淀后，不能用透析等方法除去沉淀剂而使蛋白质重新溶解的现象剂而使蛋白质重新溶解的现象在强烈沉淀条件下，不仅在强烈沉淀条件下，不仅破坏了蛋白质胶体溶液的稳定破坏了蛋白质胶体溶液的稳定性，性，而且也而且也

31、破坏了蛋白质的结构和性质，破坏了蛋白质的结构和性质，产生的蛋白质产生的蛋白质沉淀不可能再重新溶解于水。沉淀不可能再重新溶解于水。由于沉淀过程发生了由于沉淀过程发生了蛋白质的结构和性质的变化蛋白质的结构和性质的变化，所以，所以又称为变性沉淀。又称为变性沉淀。如如加热沉淀、强酸碱沉淀、重金属盐沉淀和生物碱加热沉淀、强酸碱沉淀、重金属盐沉淀和生物碱沉淀等沉淀等都属于不可逆沉淀。都属于不可逆沉淀。2、不可逆沉淀、不可逆沉淀第49页，讲稿共76张，创作于星期三（六）蛋白质的颜色反应（六）蛋白质的颜色反应1、双缩脲反应、双缩脲反应(biuret reaction)蛋白质和多肽分子中肽键在稀碱溶液中与硫酸铜

32、蛋白质和多肽分子中肽键在稀碱溶液中与硫酸铜共热，呈现紫色或红色，此反应称为共热，呈现紫色或红色，此反应称为双缩脲反应双缩脲反应，双，双缩脲反应可用来检测蛋白质水解程度。缩脲反应可用来检测蛋白质水解程度。2、米伦氏反应（酚基）、米伦氏反应（酚基）米伦试剂为米伦试剂为硝酸汞、亚硝酸汞、硝酸和亚硝酸的硝酸汞、亚硝酸汞、硝酸和亚硝酸的混合物混合物，蛋白质溶液加入此试剂后即产生，蛋白质溶液加入此试剂后即产生白色沉淀白色沉淀，加热后沉淀变为加热后沉淀变为红色红色。酪氨酸含有酚基，故含酪氨酸。酪氨酸含有酚基，故含酪氨酸的蛋白质都有此反应。的蛋白质都有此反应。第50页，讲稿共76张，创作于星期三3、乙醛酸反应

33、（吲哚基）、乙醛酸反应（吲哚基）在蛋白质溶液中加入在蛋白质溶液中加入乙醛酸乙醛酸，并沿试管壁慢慢注入，并沿试管壁慢慢注入浓硫酸，在两层之间就会出现浓硫酸，在两层之间就会出现紫色环紫色环。色氨酸及含有色。色氨酸及含有色氨酸的蛋白质有此反应。氨酸的蛋白质有此反应。4、坂口反应、坂口反应 精氨酸分子含有精氨酸分子含有胍基胍基，能与次氯酸钠及，能与次氯酸钠及-萘酚在氢萘酚在氢氧化钠溶液中产生氧化钠溶液中产生红色产物红色产物。5 5、酚试剂（福林试剂）反应、酚试剂（福林试剂）反应 酪氨酸中的酚基能将福林试剂中的磷钼酸及磷钨酸酪氨酸中的酚基能将福林试剂中的磷钼酸及磷钨酸还原成蓝色化合物。还原成蓝色化合物。

34、该反应常用蛋白质的定量测定。该反应常用蛋白质的定量测定。第51页，讲稿共76张，创作于星期三（五）蛋白质的紫外吸收（五）蛋白质的紫外吸收由由于于蛋蛋白白质质分分子子中中含含有有共共轭轭双双键键的的酪酪氨氨酸酸和和色色氨氨酸酸，因因此此在在280nm波波长长处处有有特特征征性性吸吸收收峰峰。蛋蛋白白质质的的OD280与与其其浓浓度度呈呈正正比比关关系系，因因此此可可作作蛋蛋白白质质定量测定定量测定。第52页，讲稿共76张，创作于星期三前处理及抽提：前处理及抽提：选材、破碎、匀浆、溶解、离心或差速离选材、破碎、匀浆、溶解、离心或差速离心、（心、（pH、温度、酶的抑制剂等保证蛋白质的稳定）。、温度、

35、酶的抑制剂等保证蛋白质的稳定）。粗制品获得（粗分级分离）：粗制品获得（粗分级分离）：盐析、等电点沉淀、有机溶盐析、等电点沉淀、有机溶剂分级分离，离心。剂分级分离，离心。纯化（细分级分离）：纯化（细分级分离）：层折法。层折法。鉴定和测定：鉴定和测定：纯度和含量。纯度和含量。二、蛋白质的分离和分析技术二、蛋白质的分离和分析技术（一）蛋白质分离纯化的一般原则（一）蛋白质分离纯化的一般原则第53页，讲稿共76张，创作于星期三1 1、透析及超滤、透析及超滤*透析透析(dialysis)利用透析袋把大分子蛋白质与小分子化合物分开利用透析袋把大分子蛋白质与小分子化合物分开的方法。的方法。只用于除盐类和小分子

36、杂质只用于除盐类和小分子杂质（二）常见分离纯化技术（二）常见分离纯化技术第54页，讲稿共76张，创作于星期三透析透析(dialysis):磁力搅拌器磁力搅拌器透析前透析前透析后透析后透析袋透析袋通过透析，小分子通过透析袋，散布于透析液通过透析，小分子通过透析袋，散布于透析液中，大分子量的蛋白质不能通过透析袋，留在透析中，大分子量的蛋白质不能通过透析袋，留在透析袋内。从而，蛋白质溶液中的小分子物质通过透析袋内。从而，蛋白质溶液中的小分子物质通过透析被分离除去。被分离除去。第55页，讲稿共76张，创作于星期三超过滤超过滤（ultrafiltration）加压加压蛋白质溶液蛋白质溶液半透膜半透膜支持

37、膜的栅板支持膜的栅板超滤液超滤液原理原理:是利用压力是利用压力或离心力，强行或离心力，强行使水和其他小分使水和其他小分子溶质通过半透子溶质通过半透膜，而蛋白质留膜，而蛋白质留在半透膜上，以在半透膜上，以达到浓缩和脱盐达到浓缩和脱盐的目的的目的第56页，讲稿共76张，创作于星期三2 2、盐析和盐溶、盐析和盐溶*盐盐析析(salt precipitation)：将将高高浓浓度度的的中中性性盐盐，如如硫硫酸酸铵铵、硫硫酸酸钠钠或或氯氯化化钠钠等等加加入入蛋蛋白白质质溶溶液液，使使蛋蛋白白质质表表面面电电荷荷被被中中和和以以及及水水化化膜膜被被破破坏坏，导导致致蛋蛋白白质质沉淀。沉淀。盐溶（盐溶（sa

38、lt solution）：）：低浓度的中性盐可以使蛋白质低浓度的中性盐可以使蛋白质溶解度增加。溶解度增加。第57页，讲稿共76张，创作于星期三等电点沉淀法：等电点沉淀法：不同蛋白质、氨基酸组成不同，等不同蛋白质、氨基酸组成不同，等电点不同，可利用等电点沉淀方法进行分离。电点不同，可利用等电点沉淀方法进行分离。等电点特点：等电点特点：蛋白溶解度最低蛋白溶解度最低3 3、等电点沉淀法、等电点沉淀法第58页，讲稿共76张，创作于星期三4 4、低温有机溶剂沉淀法、低温有机溶剂沉淀法*常用有机溶剂：常用有机溶剂：乙醇、丙酮乙醇、丙酮*丙丙酮酮沉沉淀淀：使使用用丙丙酮酮沉沉淀淀时时，必必须须在在04低低温

39、温下下进进行行，丙丙酮酮用用量量一一般般10倍倍于于蛋蛋白白质质溶溶液液体体积积。蛋蛋白白质质被被丙丙酮酮沉沉淀淀后后，应应立立即即分分离离，否否则则蛋蛋白白易易变变性性。除除了了丙丙酮酮以以外，也可用乙醇沉淀。外，也可用乙醇沉淀。以上几种方法只能分离得到蛋白质的粗制品，还无以上几种方法只能分离得到蛋白质的粗制品，还无法得到具有一定纯度的蛋白质。法得到具有一定纯度的蛋白质。第59页，讲稿共76张，创作于星期三5 5、电泳、电泳根据电荷不同进行纯化的方法根据电荷不同进行纯化的方法蛋蛋白白质质在在高高于于或或低低于于其其pI的的溶溶液液中中为为带带电电的的颗颗粒粒，在在电电场场中中能能向向正正极极

40、或或负负极极移移动动。这这种种通通过过蛋蛋白白质质在在电电场场中中泳泳动动而而达达到到分分离离各各种种蛋蛋白白质质的的技技术术,称称为为电泳电泳(elctrophoresis)。根根据据支支撑撑物物的的不不同同，可可分分为为薄薄膜膜电电泳泳、凝凝胶胶电电泳泳等。等。第60页，讲稿共76张，创作于星期三原点原点带负电荷蛋白质的泳动方向带负电荷蛋白质的泳动方向滤纸、醋酸纤维素滤纸、醋酸纤维素薄膜或其他支持物薄膜或其他支持物阳阳极极阴极阴极电极缓冲液电极缓冲液电极缓冲液电极缓冲液电泳示意图电泳示意图薄膜电泳薄膜电泳第61页，讲稿共76张，创作于星期三几种重要的蛋白质电泳几种重要的蛋白质电泳*SDS-

41、聚丙烯酰胺凝胶电泳，聚丙烯酰胺凝胶电泳，常用于蛋白质分子常用于蛋白质分子量的测定。量的测定。*等电聚焦电泳，等电聚焦电泳，通过蛋白质等电点的差异而分离通过蛋白质等电点的差异而分离蛋白质的电泳方法。蛋白质的电泳方法。*双向凝胶电泳，双向凝胶电泳，以上两种方法相结合，是蛋白质以上两种方法相结合，是蛋白质组学研究的重要技术。组学研究的重要技术。第62页，讲稿共76张，创作于星期三凝胶电泳凝胶电泳第63页，讲稿共76张，创作于星期三（四）层析（色谱）（四）层析（色谱）层析层析(chromatography)分离蛋白质的原理分离蛋白质的原理当流动相带着待分离蛋白质溶液经过一个固态当流动相带着待分离蛋白质

42、溶液经过一个固态物质（固定相）时，根据溶液中待分离的蛋白质颗物质（固定相）时，根据溶液中待分离的蛋白质颗粒大小、电荷多少及亲和力等，使待分离的蛋白质粒大小、电荷多少及亲和力等，使待分离的蛋白质组分在两相中反复分配，并以不同速度流经固定相组分在两相中反复分配，并以不同速度流经固定相而达到分离蛋白质的目的而达到分离蛋白质的目的。第64页，讲稿共76张，创作于星期三蛋白质分离常用的层析方法蛋白质分离常用的层析方法*离子交换层析：离子交换层析：利用各蛋白质的电荷量及性质不利用各蛋白质的电荷量及性质不同进行分离。同进行分离。凝胶过滤凝胶过滤(gel filtration)又称分子筛层析、分子排阻又称分子

43、筛层析、分子排阻色谱等，是色谱等，是利用各蛋白质分子大小的不同进行分离利用各蛋白质分子大小的不同进行分离的。的。亲和层析：亲和层析：是是吸附吸附层析，依赖于层析，依赖于蛋白质和其配体蛋白质和其配体（ligand）之间的相互作用来实现分离的。）之间的相互作用来实现分离的。第65页，讲稿共76张，创作于星期三阳阳离离子子交交换换层层析析过过程程离子交离子交换树脂换树脂蛋白质蛋白质高离子强高离子强度洗脱液度洗脱液洗洗高离子强高离子强度洗脱液度洗脱液洗洗加加样样平平衡衡液液洗洗收集收集第66页，讲稿共76张，创作于星期三凝胶过滤层析过程凝胶过滤层析过程第67页，讲稿共76张，创作于星期三第68页，讲稿

44、共76张，创作于星期三亲和层析过程亲和层析过程第69页，讲稿共76张，创作于星期三混合物中各组分在混合物中各组分在固定相固定相和和流动相流动相之间会之间会发生发生吸附、溶解或其他亲和作用吸附、溶解或其他亲和作用，这种作，这种作用存在差异，从而使各组分在色谱柱中的用存在差异，从而使各组分在色谱柱中的迁移速度不同迁移速度不同得到分离得到分离分配层析（色谱）分配层析（色谱）根据流动相当不同可以分为根据流动相当不同可以分为气相色谱和液相色谱，气相色谱和液相色谱，液液相色谱中最常用的是相色谱中最常用的是高压液相色谱高压液相色谱第70页，讲稿共76张，创作于星期三高效液相色谱法高效液相色谱法(high p

45、erformance liquid chromatography,HPLC)也称也称高压液相层析（高压液相层析（high pressure liquid chromatography）。这是近二十年内发展起来的一项。这是近二十年内发展起来的一项快速、灵敏、高效快速、灵敏、高效的分离技术。它是在经典液相层析法的分离技术。它是在经典液相层析法基础上，引进了气相层析的理论，利用高压输送流动相，基础上，引进了气相层析的理论，利用高压输送流动相，拥有高效固定相及高灵敏度检测器，具有气相层析的全拥有高效固定相及高灵敏度检测器，具有气相层析的全部优点。部优点。第71页，讲稿共76张，创作于星期三（五）超速离

46、心（五）超速离心*超超速速离离心心法法(ultracentrifugation)既既可可以以用用来来分分离离纯纯化化蛋蛋白白质质也也可可以以用用作作测测定定蛋蛋白白质质的的分分子量。子量。*蛋蛋白白质质在在离离心心场场中中的的行行为为用用沉沉降降系系数数(sedimentation coefficient,S)表表示示,沉沉降降系系数数与蛋白质的密度和形状相关与蛋白质的密度和形状相关。第72页，讲稿共76张，创作于星期三因因为为沉沉降降系系数数S大大体体上上和和分分子子量量成成正正比比关关系系，故故可可应应用用超超速速离离心心法法测测定定蛋蛋白白质质分分子子量量，但但对对分分子子形形状状的的高

47、高度度不不对对称称的的大大多多数数纤纤维维状状蛋蛋白白质质不不适适用。用。第73页，讲稿共76张，创作于星期三2、渗透压法、渗透压法3、超速离心法超速离心法4、凝胶过滤法、凝胶过滤法5、SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳蛋白质分子量的测定蛋白质分子量的测定1、最小分子量测定法：、最小分子量测定法：第74页，讲稿共76张，创作于星期三蛋白质含量的测定蛋白质含量的测定 1、凯氏定氮法、凯氏定氮法 2、双缩脲反应、双缩脲反应 3、Folin-酚试剂反应酚试剂反应 4、紫外吸收法、紫外吸收法 5、考马斯亮蓝法、考马斯亮蓝法第75页，讲稿共76张，创作于星期三感感谢谢大大家家观观看看第76页，讲稿共76张，创作于星期三