有丝分裂激酶PBKTOPK结构和功能的研究.docx

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1、南开大学硕士学位论文有丝分裂激酶PBK/TOPK结构和功能的研究姓名：邹庆薇申请学位级别：硕士专业：生物学；生物化学与分子生物学指导教师：龙加福201105PDZ-binding-kinase /T-LAK cell-originated protein kinase(PBK/TOPK)是近年 来新发现的种Ser/Thr激酶，在很多肿瘤細胞中高表达，与这些肿瘤细胞的快 速增殖密切相关，并在细胞的恶性转化中起作用。PBK/TOPK在细胞有丝分裂 期也高表达，被磷酸化激活并参与细胞周期调控。但是有关PBK /TOPK的活性 调控机理及其在癌細胞恶性转化中的具体作用机制目前都不十分清楚。本文通过构建

2、表达质粒，利用原核表达系统大量表达PBK/TOPK及其突变 体蛋白，经亲和层析、凝胶过滤层析和离子交换层析分离纯化出较纯净的重组 蛋白，应用晶体筛选试剂盒在4和20分别筛选蛋白质晶体。初筛的晶体经 过优化，通过X射线衍射收集数据，表达纯化硒代甲硫氨酸蛋白并结晶用于确 定相位、解析晶体结构，获得了 PBK/TOPK的结构信息。应用FPLC分析了不 同pH条件下溶液中PBK/TOPK 的构象情況，发现野生型蛋白不发生聚集，但 突变体蛋白在pH 10.5的情况下可以发生聚集。通过荧光光谱法和等温滴定量热 法(ITC) 发现原核表达的 PBK/TOPK蛋白激酶不与底物及Mg 2和ATP结合。通 过变性

3、复性法纯化组蛋白H3,成功建立起了以组蛋白H 3为底物的激酶活性研 究体系，用来检测PBK/TOPK的激酶活性。培养293T细胞，通过瞬时转染在 293T细胞内表达PBK/TOPK,免疫沉淀获得表达的蛋白并用于激酶活性检测。 最后，利用昆虫表达系统表达纯化出了具有激酶活性的蛋白，为进步阐明 PBK/TOPK在有丝分裂和细胞增殖中的作用机理提供依据。关键词 ： PBK/TOPK;蛋白纯化；X光衍射与结构解析；组蛋白磷酸化摘要AbstractPBK/TOPK (PDZ-binding kinase/T-LAK-cell-originated protein kinase) is a novel s

4、erine/threonine kinase that is highly expressed in many txnnors and seems to play a key role in tumorigenesis or metastasis. The expression level of PBK/TOPK is increased during mitosis and phosphorylated in a cell cycle-dependent manner. The phosphorylation of PBK/TOPK is required for its activatio

5、n and function. However, the precise role and regulatory mechaxxism explaining the effects of PBK/TOPK in tumor cells still remains elusive.Here, we cloned and expressed the recombinant PBK/TOPK in E.colL Protein was purified tiirough affinity chromatography, gel filtration chromatography and ion ex

6、change chromatography for crystal screening at 4C and 20C using different conditions of kits. After optimization of primary screening crystal, data was collected through X-ray crystallography. Selenomethionine PBK/TOPK was expressed and purified for crystallization and phase determination. Then, we

7、got tiie structural information of PBK/TOPK. PBK/TOPK conformation in different pH buffer was analyzed by FPLC, finding that PBK/TOPK mutant was polymerized in pH 10.5, but not WT PBK/TOPK. Both fluorescence spectrum and isothermal titration calorimetry (ITC) detection all indicated that PBK/TOPK pu

8、rified from E.coli could not bind to substrate and M/ATP. Kinase assay was set up by using histone H3 purified through denaturation and renaturation as the substrate and PBK/TOPK immunoprecipitated from transient transfected 293T cells. Finally, we got the active PBK/TOPK protein from Sf9 cells expr

9、ession system. Together, all of tiiese data above may shed light on understanding of the role of PBK/TOPK in the regulation of mitosis and cellular proliferation.Key words: PBK/TOPK, protein purification, X-ray crystallography and structure elucidation, phosphorylation or histone H31引言1引 言U PBK/TOPK

10、蛋白研究现状研究癌细胞采取的逃脱细胞监督机制的通路及其发生恶性转化的调控方式 对于治疗癌症、开发药物和更好的预后有十分重要的意义。一个新发现的有丝 分裂激酶PBIOTOPK (以下简称为PBK)在许多肿瘤細胞中上调表达，可通过与 其他蛋白相互作用而介入细胞信号转导通路，调节细胞周期或細胞増殖，在细 胞恶性转化中起作用，有可能成为不同癌症中潜在的新治疗靶点 1， 2。近年来， 对于PBK 有不少研究，发现它参与很多細胞通路并起到不同作用，对于其功能有 了进步了解，但是PBK的结构和在細胞恶性转化中发挥作用的具体机制仍然不 够清楚。1.1.1 PBK的发现Gaudet等在酵母双杂交筛选中发现了一种

11、与人肿瘤抑制因子hDlg 的PDZ2结 构域相结合的蛋白，并从Hela細胞 cDNA文库中克隆出了其基因 3。另外个研 究小组Abe等在淋巴因子激活的杀伤性T (T-LAK)細胞中发现了一种类似 MAPKK (有丝分裂原活性蛋白激酶激酶）的蛋白激酶 4。后来通过序列分析发 现两者是同一种基因，于是命名为PDZ -binding-kinase/T-LAK cell-originated protein kinase (PBK/TOPK) 同源序列比对发现，PBK和MAPKK有很大的同源性，是MAPKK家族新的 成员。系统进化树显示它是MEK1/2和MKK7之间的分支，更接近与MEK1/2。PBK

12、 有322个氨基酸，含有所有蛋白激酶的特征性亚结构域和C端的PDZ结合模序 T/SXV3,4，缺失了部分MAPKK家族的典型氨基酸，如第七和第八个结构域之 间的(SyT)XXX(SAT)序列，该序列对于激酶活性非常重要 5,6。而且PBK 的NXXXT 序列中第一个ser或thr被asp取代。PBK的组织分布有很大不同，它在高度増殖的胎盘组织中十分丰富，在心肌、 胰腺中也有表达，在骨骼肌、肾、肝和肺中低水平表达， 71，在睾丸组织中上调 表达并參与精子发生 8,9。在没有细胞分裂的脑组织中，Northern blot 检测mRNA或PCR扩增脑组织cDNA文库均未发现PBK信号。但是，在许多肿

13、瘤组织，如白 血病、淋巴瘤、乳腺癌细胞等，PBK均有高水平表达 7， 1()， 11，可以作为种癌症 抗原。PBK在高度増殖的恶性細胞和特定的有増殖空间的正常组织細胞中表达上 调，提示其很可能在调节细胞增殖和細胞周期中起作用 1121,与细胞的恶性増殖 密切相关 13。1.1.2 PBK与细胞周期性调控PBK是一种Ser/Thr激酶，受细胞周期调节，只在有丝分裂期被磷酸化激活， 其磷酸化对于活性是必须的。PBK 的表达量在细胞有丝分裂期的 G2期到M期增 加，之后有所下调 7。间期，PBK 在胞质和細胞核中表达，与微管网络并无明显 结合。分裂期，PBK的Thr9被cdkl/cyclinB磷酸化

14、，并与有丝分裂纺锤体显著结 合 T9A突变体与cdkl/cyclin B和微管的结合明显降低，说明 Thr9的磷酸化正调 节PBK与 cdkl/cydin B的結合，且这种调节对于 PBK定位在纺锤体纤维至关重要 141516。PBK的234aa至266aa是与cdkl/cyclinB和微管的结合位点,其中从253aa 到265aa 的天冬氨酸重复序列DDDDEDKTFDESD是PBK独有的，这个酸性序列 可能对于结合有重要作用 1171。当PBK表达受抑制时，纺锤体中部变瘦变模糊，胞浆移动被扰乱。PBK 的敲 除将导致细胞中体结构的异常和胞质分裂的推迟。PBK很可能在纺锤体中部或者 中间体的

15、形成中起作用，也可能通过形成纺锤体中部而参与胞浆移动 18， 19。活 化的PBK 能够磷酸化组蛋白H3的SerlO位，而组蛋白H3的SerlO的磷酸化是哺乳 动物染色体凝集的开端，是进入细胞有丝分裂期的关键步骤 7，与細胞的正常有 丝分裂密切相关。因此，PBK可能通过对组蛋白 H3的修饰参与細胞周期进程的 调控，其具体的作用机制还有待进步研究。1.1.3 PBK与肿瘤早先发现PBK在血液肿瘤，比如白血病，淋巴瘤和骨髄瘤中高表达 2()， 21; 后来陆续发现PBK在乳腺癌、皮肤癌和大肠癌等肿瘤细胞中都是高表达的 1()， 11。 PBK在高度増殖的恶性细胞中表达上调，表明其很可能在调节细胞增

16、殖和细胞周 期中起作用，并与这些肿瘤的恶性潜能密切相关 22。关于PBK在细胞转化和肿瘤细胞恶性増殖中的分子机制己经做了些研究。 研究表明PBK是UVB诱导的JNK(Jun -NH2-kinase)激活的上游调节因子，PBK可以与JIPl(JNK -interactingproteinl)相互作用，增强其支架蛋白活性，从而提高 JNK1的活性。磷酸化激活的JNK1可以磷酸化许多底物，包括一些转录因子，例 如AP-1( activator protein-1)，从而影响基因表达和后续的细胞功能，可能是 PBK 在肿瘤发生中发挥作用的机制的基础 1()。PBK的过表达能够转化小鼠皮肤細胞 , 切断

17、PBK在大肠癌细胞中的表达将降低其致瘤性质。在体外和体内，PBK 都能磷 酸化ERK 2,反之亦然，这个在 PBK和ERK2之间的正反馈环提高了两个激酶的活 性，可能在PBK诱导的转化中起作用。正常细胞中， MEK从Ras或Raf传导細胞 信号，ERKs负反馈给Ras或Raf5t下调MAPK 通路从而维持正常細胞生长 23,24。 但是PBK在癌细胞中过表达，且 PBK通路的调节似乎不受Ra推影响，活性的 B-Ra域C -Raf都不能磷酸化PBK，PBK通路似乎只在癌细胞中激活而正常細胞 中的蛋白表量也非常低，因此PBK将是个非常好的癌症治疗药物靶点 t25l再者，癌细胞中高表达的PBK参与

18、p38介导的细胞运动性调节，当 PBK受抑 制时，生长因子诱导的p38的激活受到很大影响，同时这个缺陷与細胞运动的降 低相夫，PBK的敲除在降低“长时 ”（long -term)细胞生长和贴壁非依赖性生长 中的作用可以部分解释为p38介导的细胞运动的下降和細胞浸润潜能降低的结 果 26,27。这些都可能对肿瘤细胞的贴壁不依赖性生长作出贡献。PBK还可以通 过与衔接蛋白p47相互作用，磷酸化一种ATP酶p 9719，还可以在乳腺癌細胞中 磷酸化LGN /GPSM228，这些都能够影响癌細胞的胞浆移动。另一方面，PBK 激 活DNA损伤修复机器，为肿瘤细胞提供了更有效的修复应答，促进肿瘤細胞的 増

19、 殖 2629。 PBK还可以与肿瘤抑制蛋白 P53的DBD结构域相互作用，使p53下调 表达，导致細胞周期调节蛋白如p 21功能降低，染色体不稳定，中心体复制缺陷 和异常有丝分裂发生 18,3Q。1.1.4 PBK与細胞凋亡Y-H2AX负责DNA损伤反应蛋白被募集到损伤位点，y_H2AX水平的降低可 能导致DNA损伤的増加。证据表明PBK 通过磷酸化H2AX,导致 Y-H2AX的产生， 而在DNA损伤反应和修复中起作用 16,31,削弱G2/M检验点，使細胞越过与检验 点相关的正常监督机制而进入分裂期 26, 29。 PBK的表达受IGF -I和EGF的调节， 并參与DNA损伤修复途径 32

20、，因此， PBK是一个潜在的治疗靶点，被用于DNA 损伤药物或者以1GF-IR和EGFR为靶点的药物 33。1.1.5 PBK的转录调节PBK表达的細胞周期相关性是由于PBKmRNA 在细胞周期中G1和G2期的积 聚。其中，E2F和CREB/ATF在转录调节中起重要作用。 CREB因子与PBK 在不 同起源的组织中的分布相同，使用siRNA选择性削弱CREB、ATF2或E 2F转录因 子的表达，发现PBK表达依赖于这两个转录因子。转录控制基本上是由于在启动 子的两个不同位点结合了转录因子E2F和CREB/ATB经分析， PBK启动子不包 含 规 范 的 TATA” box，却在与RNA起始相关

21、的-30位置含有一个富含A-T的序 列。PBK 启动子的表达在阿霉素诱导的生长停滞中受到负调节，转录因子E 2F和 CREB参与其中 34。失去或结合属于这两个重要转录调节因子家族的正调节因子和负调节因子可以解释观察到的细胞周期特异性调节和生长抑制中PBK基因的负调节。1.1.6 PBK活性的探讨PBK是个有丝分裂激酶，在分裂期，PBK 的Thr9被cdkl /cyclinB磷酸化且 被认为与蛋白活性密切相关 35，但是体外实验表明，被cdkl/cyclinB磷酸化的 PBK并没有活性，可能在数量和程度上不同于体内的磷酸化，或者还需要其他的 翻译后修饰 3。Taketsugu等在研究PBK在精

22、子发生中的作用时发现，PBK的 Thrl98,一个ATP 结合口袋的关键位点，在L929cells中是被持续性磷酸化的并 与细胞周期无关 8。近年来的研究还发现，PPla(proteinphosphataselalpha)可 以灭活cdkl /cyclinB，使PBK自磷酸化增强，导致有丝分裂早期 PBK的激活，但 是PBK自磷酸化的机制和具体位点还不清楚 19,36。PBK 的活性可以受到无咖啡 因的咖啡、咖啡酸和绿原酸的抑制，其中咖啡酸的抑制效果最強，而且属于ATP 非竞争式抑制。抑制剂不可逆的结合在活性位点以外的变构位点，使ATP不能结 合到活性位点，从而抑制激酶的活性 37,38。但是

23、确切的抑制机理还需要PBK的 结构数据来分析。1.2研究意义目前己经发现很多激酶与肿瘤的发生发展密切相关，比如Aurora激 酶 ， 401， 研究这些相关的激酶对于更好的预后、开发药物和治疗肿瘤十分有意义。PBK 是个新发现的有丝分裂激酶，研究发现PBK在许多肿瘤细胞中高表达，比如血液肿瘤、乳腺癌、大肠癌、皮肤癌和胆管癌。另外，由于PBK在调节有丝分裂， 细胞增殖以及细胞恶性转化中都起着非常重要的作用 5, n， 13lPBK有可能成为不 同肿瘤潜在的药物开发靶点，因此对PBK三维结构的解析变得很重要，该课题致 于解析PBK三维结构，并在此基础上研究 PBK在细胞内发挥功能的分子机制， 从而

24、揭示PBK的活性调节与有丝分裂和細胞増殖的关系，也将深入理解PBK 在恶 性肿瘤的发生发展中的作用机理。为我们进行特异性抑制剂的筛选奠定基础， 并为将来开发以抑制PBK激酶活性为基础的先导化合物提供前期积累。2材 料 和 方 法 2.1试剂与设备2.1.1主要试剂表2.1主要试剂试剂名称 生产厂家Ampicillin(Amp) NewprobeIPTG BBITaq DNA polymerase 普博欣Pfu DNA polymerase Tiangenrestriction enzyme TakaraT4 DNA Ligase NEBAgarose 上海 YITOAgar JapanTRYP

25、TONE OXOE)YEAST EXTRACT OXOIDacrylamide SigmaTEMED Amresco酚：氯仿：异戊醇 Sangon硫苏糖醇（DTT) GenviewTris GenviewSDS SigmaEDTA GenviewImidazole BBIPMSF GenviewAntipain TemeculaLeupeptin TemeculaNaCl BBI表2.1主要试剂（续)浓盐酸 天津市江天化工技术有限公司盐酸胍 SigmaNiS04 天津市贏达稀贵试剂化工厂醋酸钠 天津市光复精细化工研究所冰 乙 酸 天津市北方天医化学试剂厂无水乙醇 天津市北方天医化学试剂厂无水甲

26、醇 天津市北方天医化学试剂厂考马斯亮蓝R-250 USB考马斯亮蓝G-250 普博欣异丙醇 BBINaOH 天津风船化学试剂科技有限公司dNTP TakaraDNA Maker 普博欣Protein Maker PromegaNi-NTA sepharose GE HealthcareGlycine 上海凌峰化学试剂厂ammonium persulfate(AP) Sigma丙三醇 天津市北方天医化学试剂厂溴化啶(EB) Sigma2.1.2主要设备表2.2主要设备设备名称 型号 生产厂家髙压灭菌锅 HVE-50 hirayama单人水平垂直两用净化工作台SW-CJ-1FB 苏州净化设备有限公司隔水式恒温培养箱 GHP-9160 上海一恒科技有限公司电热恒温鼓风干燥箱 DH-101 天津市中环实验电炉公司紫外分析仪 WD-9403F 北京六一仪器厂碎冰制冰机 SIM-F140 Sanyo