第六讲技术及其应用.ppt

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1、第六讲技术及其应用现在学习的是第1页，共35页PCR技术的基本原理技术的基本原理现在学习的是第2页，共35页PCR的反应动力学的反应动力学 PCR反应最终的反应最终的DNA 扩增量扩增量,Y(1X)n Y:DNA片段扩增后的拷贝数片段扩增后的拷贝数 X:每次扩增效率的平均值每次扩增效率的平均值 n:循环次数。循环次数。平均扩增效率的理论值为平均扩增效率的理论值为100%，但在实际反应，但在实际反应中平均效率达不到理论值。中平均效率达不到理论值。现在学习的是第3页，共35页平台期平台期(Plateau)反应初期，靶序列反应初期，靶序列DNA片段的增加呈指数形式，随着片段的增加呈指数形式，随着PC

2、R产物的逐渐积产物的逐渐积累，被扩增的累，被扩增的DNA 片段不再呈指数增加，而进入线性增长期或静止片段不再呈指数增加，而进入线性增长期或静止期，期，即出现即出现“停滞效应停滞效应”，这种效应称平台期，这种效应称平台期产生的因素产生的因素:dNTP和引物浓度下降和引物浓度下降酶与模板的比例下降，能参与反应的酶分子数下降酶与模板的比例下降，能参与反应的酶分子数下降多次循环后酶与多次循环后酶与dNTP的稳定性下降的稳定性下降非特异产物及引物二聚体比例增加非特异产物及引物二聚体比例增加产物浓度高时变性不完全，影响引物的延伸，产物浓度过高产物浓度高时变性不完全，影响引物的延伸，产物浓度过高108M时，

3、降低时，降低Taq酶的延伸与加工能力。酶的延伸与加工能力。大多数情况下，平台期的到来是不可避免的。大多数情况下，平台期的到来是不可避免的。PCR反应应在平台期前反应应在平台期前结束。结束。现在学习的是第4页，共35页PCR扩增产物扩增产物 长产物片段和短产物片段长产物片段和短产物片段 短产物片段的长度严格地限定在两个引物链短产物片段的长度严格地限定在两个引物链5端之间，是需要扩增的特定端之间，是需要扩增的特定片段。片段。短产物片段和长产物片段是由于引物所结合的模板不一样而形成短产物片段和长产物片段是由于引物所结合的模板不一样而形成.在一个反应周期中，在一个反应周期中，以两条互补的以两条互补的D

4、NA为模板，引物是从为模板，引物是从3端开始延端开始延伸，伸，其其5端是固定的，端是固定的，3 端则没有固定的止点，长短不一，这就是端则没有固定的止点，长短不一，这就是“长产物片段长产物片段”。第二周期后，引物除与原始模板结合外，还要同新合成的链第二周期后，引物除与原始模板结合外，还要同新合成的链(即即“长产物长产物片段片段”)结合。引物在与新链结合时，结合。引物在与新链结合时，由于新链模板的由于新链模板的5端序列是固定端序列是固定的，的，这就等于这次延伸的片段这就等于这次延伸的片段3端被固定了止点，端被固定了止点，保证了新片段的起点保证了新片段的起点和止点都限定于引物扩增序列以内、形成长短一

5、致的和止点都限定于引物扩增序列以内、形成长短一致的“短产物片段短产物片段”。“短产物片段短产物片段”是按指数倍数增加，是按指数倍数增加，而而“长产物片段长产物片段”则以算术倍数增则以算术倍数增加，加，几乎可以忽略不计几乎可以忽略不计现在学习的是第5页，共35页酶及其浓度酶及其浓度 Taq DNA聚合酶聚合酶,一种是从栖热水生杆菌中提纯的天然酶，另一种为一种是从栖热水生杆菌中提纯的天然酶，另一种为大肠菌合成的基因工程酶。大肠菌合成的基因工程酶。除除Taq DNA聚合酶，还有其它一些热稳定聚合酶。聚合酶，还有其它一些热稳定聚合酶。催化一典型的催化一典型的PCR反应约需酶量反应约需酶量5U(指总反应

6、体积为指总反应体积为100ul时时)，浓度过高可引起非特异性扩增，甚至浓度过高可引起非特异性扩增，甚至PCR产物为弥散，浓度过低则合产物为弥散，浓度过低则合成产物量减少。成产物量减少。现在学习的是第6页，共35页现在学习的是第7页，共35页dNTP的质量与浓度的质量与浓度 dNTP的质量与浓度和的质量与浓度和PCR扩增效率有密切关系，扩增效率有密切关系，dNTP保存不当易变性保存不当易变性失去生物学活性。失去生物学活性。dNTP溶液呈酸性，使用时应配成高浓度后，以溶液呈酸性，使用时应配成高浓度后，以1M NaOH或或1M TrisHCL的缓冲液将其的缓冲液将其PH调节到调节到7.07.5，小量

7、分装，小量分装，-20冰冻保存。冰冻保存。多次冻融会使多次冻融会使dNTP降解。降解。4种种dNTP的浓度要相等的浓度要相等(等摩尔配制等摩尔配制)，如其中任何一种浓度不同于，如其中任何一种浓度不同于其它几种时其它几种时(偏高或偏低偏高或偏低)，就会引起错配。，就会引起错配。在在PCR反应中，反应中，dNTP应为应为50200umol/L，浓度过低会降低，浓度过低会降低PCR产物的产物的产量。产量。dNTP能与能与Mg2+结合，因此浓度过高，使游离的结合，因此浓度过高，使游离的Mg2+浓度降低，并抑浓度降低，并抑制制Taq酶活性。酶活性。现在学习的是第8页，共35页Mg2+浓度浓度 Mg2+对

8、对PCR扩增的特异性和产量有显著的影响扩增的特异性和产量有显著的影响 Mg2+浓度要比浓度要比dNTP浓度高浓度高0.22.5mM。Mg2+浓度过高，反应特异性降低，出现非特异扩增，浓度过高，反应特异性降低，出现非特异扩增，浓度过低会降低浓度过低会降低Taq DNA聚合酶的活性，使反应产物聚合酶的活性，使反应产物减少。减少。2mMMgCl2在在dNTP为为0.7-0.8mM时时,对对Taq酶活性促酶活性促进最强进最强 10mM时对时对Taq酶抑制达酶抑制达40-50%模板和引物中磷酸根结合模板和引物中磷酸根结合Mg2+,将降低自由将降低自由Mg2+KCl(50mM)可使可使Taq酶活性增加酶活

9、性增加50-60%.现在学习的是第9页，共35页模板模板(靶基因靶基因)核酸核酸 DNA与与RNA均可成为均可成为PCR的模板。的模板。模板核酸的量与纯化程度，是模板核酸的量与纯化程度，是PCR成败与否成败与否的关键环节之一的关键环节之一 PCR的模板可以纯化也可以是粗提液。但不管的模板可以纯化也可以是粗提液。但不管是什么类型在模板中均不应存在是什么类型在模板中均不应存在Taq酶抑制剂。酶抑制剂。模板量要求为模板量要求为102105靶序列。一般对于单拷贝靶序列。一般对于单拷贝模板来讲，高等真核生物基因约需模板来讲，高等真核生物基因约需1ug,酵母约需酵母约需10ng，质粒或大肠杆菌需要量，质粒

10、或大肠杆菌需要量1ng。现在学习的是第10页，共35页引物引物：引物是引物是PCR特异性反应的关键，特异性反应的关键，PCR 产物的特异性取决于引产物的特异性取决于引物与模板物与模板DNA互补的程度。理论上，只要知道任何一段模板互补的程度。理论上，只要知道任何一段模板DNA序列，序列，就能按其设计互补的寡核苷酸链做引物。就能按其设计互补的寡核苷酸链做引物。设计引物应遵循以下原则：设计引物应遵循以下原则：引物长度：引物长度：15-30bp，常用为，常用为2027mer左右。引物的有左右。引物的有效长度用效长度用Ln表示，其数值为表示，其数值为2（GC）（）（AT）引物扩增跨度：引物扩增跨度：以以

11、2003000bp为宜，特定条件下可扩增为宜，特定条件下可扩增长至长至10kb的片段。的片段。引物碱基：引物碱基：G+C含量以含量以40-60%为宜，为宜，G+C太少扩增效果太少扩增效果不佳，不佳，G+C过多易出现非特异条带。过多易出现非特异条带。ATGC最好随机分布，避最好随机分布，避免免5个以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列。个以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列。现在学习的是第11页，共35页 避免引物内部出现二级结构，避免两条引物间互补，特别是避免引物内部出现二级结构，避免两条引物间互补，特别是3端的互补，端的互补，否则会形成引物二聚体，产生非特异的扩增条带。否则会形成引物二聚体，产生非特异

12、的扩增条带。引物引物3端的碱基，特别是最末及倒数第二个碱基，应严格要求配端的碱基，特别是最末及倒数第二个碱基，应严格要求配对，以避免因末端碱基不配对而导致对，以避免因末端碱基不配对而导致PCR失败。在失败。在3端不要出现端不要出现3个连个连续的续的G或或C。同时。同时3端不要出现端不要出现T尤其不要出现尤其不要出现2个或以上的个或以上的T。引物。引物3端最好端最好不要中止于密码子的第不要中止于密码子的第3位位.引物引物5端可加上合适的酶切位点，端可加上合适的酶切位点，被扩增的靶序列最好有适宜被扩增的靶序列最好有适宜的酶切位点，或各种标记物及待突变碱基。的酶切位点，或各种标记物及待突变碱基。引物

13、的特异性：引物应与核酸序列数据库的其它序列无明显同引物的特异性：引物应与核酸序列数据库的其它序列无明显同源性。源性。引物量：引物量：每条引物的浓度每条引物的浓度0.21umol或或20100pmol，以最低引物量，以最低引物量产生所需要的结果为好，引物浓度偏高会引起错配和非特异性扩增，且可增产生所需要的结果为好，引物浓度偏高会引起错配和非特异性扩增，且可增加引物之间形成二聚体的机会。但过低将降低反应产物。加引物之间形成二聚体的机会。但过低将降低反应产物。现在学习的是第12页，共35页引物二聚体引物二聚体(primer-dimer)在大部分引物二聚体中在大部分引物二聚体中,一个引物的延伸部分是另

14、一个引物的延伸部分是另一种引物的反向平行互补序列一种引物的反向平行互补序列,二聚体能被有效扩增二聚体能被有效扩增,并能成为主要并能成为主要PCR产物产物.一对引物间一对引物间3端互补能促进二聚体的形成端互补能促进二聚体的形成 一对引物间一对引物间3端无互补端无互补,但在低复性温度但在低复性温度,高酶浓度高酶浓度及高引物浓度及足够的循环数下仍能形成二聚体及高引物浓度及足够的循环数下仍能形成二聚体 Taq酶能非特异添加碱基酶能非特异添加碱基,当一条引物与酶的引物当一条引物与酶的引物位点结合位点结合,另一条引物与酶模板结合位点结合时另一条引物与酶模板结合位点结合时,第一条第一条引物的引物的3端即能以

15、第二条引物为模板添加碱基端即能以第二条引物为模板添加碱基,促成了促成了两引物间的反应两引物间的反应.现在学习的是第13页，共35页PCR反应条件的选择反应条件的选择PCR反应条件为温度、时间和循环次数。标准反应中采用三温度点法 9095变性，40 60，引物退火,7075，引物链沿模板延伸。对于较短靶基因(长度为100300bp时)可采用二温度点法，退火与延伸温度可合二为一，94变性，65左右退火与延伸。现在学习的是第14页，共35页变性温度与时间：变性温度低，解链不完全,导致PCR失败。一般情况下，939430sec-lmin足以使模板DNA变性。一般进行单向PCR或RAPD等循环数多的扩增

16、时,变性时间要求短。退火温度与时间：退火温度是影响PCR特异性的重要因素。复性温度 4060，可使引物和模板发生结合。由于模板DNA 比引物复杂得多，引物和模板之间的碰撞结合机会远远高于模板互补链之间的碰撞。退火温度与时间，取决于引物的长度、碱基组成及其浓度，还有靶基序列的长度。对于20个核苷酸，G+C含量约50%的引物，55为选择最适退火温度的起点较为理想。现在学习的是第15页，共35页 引物的复性温度可通过以下公式计算：Tm值(解链温度)=4(G+C)2(A+T)复性温度=Tm值-(510)或按照以下公式计算Tp=22+1.46Ln,Ln=2(G+C)+(A+T),复性温度为Tp2-5在复

17、性值允许范围内，选择较高的复性温度可大大减少引物和模板间的非特异性结合，提高PCR反应的特异性。复性时间一般为3060sec，足以使引物与模板之间完全结合，复性时间过长，将导致非特异性扩增增加。根据经验一般特异性PCR复性温度可从4856间实验选定，而RAPD、dd-PCR等复性温度采用3742现在学习的是第16页，共35页延伸温度与时间：Taq DNA聚合酶的生物学活性：7080 100核苷酸/S/酶分子70 60核苷酸/S/酶分子55 24核苷酸/S/酶分子高于90时，DNA合成几乎不能进行。PCR反应的延伸温度一般选择在7075之间，常用温度为72.过高的延伸温度不利于引物和模板的结合。

18、PCR延伸反应的时间，可根据待扩增片段的长度而定，2Kb以内的DNA片段，延伸时间1-2min是足够 的。34kb的靶序列需24min；10Kb需延伸至15min。延伸进间过长会导致非特异性扩增带的出现。但PCR延伸反应中前几个循环时，延伸时间可梢长。对低浓度模板的扩增，延伸时间要稍长些。现在学习的是第17页，共35页循环次数 循环次数决定PCR扩增程度。PCR循环次数主要取决于模板DNA的浓度。一般的循环次数选在3040次之间，循环次数越多，非特异性产物的量亦随之增多。循环数与模板拷贝数相关，一般初始靶序列为3105、1.5104、1103及50拷贝时，循环数应分别为2530，3035，35

19、40，4045。现在学习的是第18页，共35页影响PCR反应的其它因素1，高温启动，可减少非特异性产物及引物二聚体形成。对Tfu等高保真酶扩增时可减少对引物的降解。2，PCR促进剂DMSO（二甲基亚砜）有促进DNA变性作用，因此有时建议添加10的DMSO，但DMSO对Taq酶有抑制作用，一般PCR中不用，但复合PCR中可使用。甘油，520的甘油有助于PCR的复性过程，尤其对于GC含量高和二级结构多或长片段靶序列有用，但一般PCR中不加甘油。TMAC（氯化四甲基胺），PCR中加入0.01-0.1mM的TMAC可促进PCR去除非特异扩增。gp32(T4噬菌体基因32蛋白)加入1nM的gp32可使长

20、片段DNA扩增效率提高10倍。现在学习的是第19页，共35页PCR扩增产物的分析扩增产物的分析凝胶电泳分析：PCR产物电泳，初步判断产物的特异性。PCR产物片段的大小应与预计的一致，特别是多重PCR，应用多对引物，其产物片断都应符合预计的大小。琼脂糖凝胶电泳：通常应用12%的琼脂糖凝胶，供检测用。聚丙烯酰胺凝胶电泳：610%聚丙烯酰胺凝胶电泳分离效果比琼脂糖好，条带比较集中，可用于科研及检测分析。酶切分析：根据PCR产物中限制性内切酶的位点，用相应的酶切、电泳分离后，获得符合理论的片段，此法既能进行产物的鉴定，又能对靶基因分型，还能进行变异性研究。分子杂交：分子杂交是检测PCR产物特异性的有力

21、证据，也是检测PCR 产物碱基突变的有效方法。Southern印迹杂交：在两引物之间另合成一条寡核苷酸链(内部寡核苷酸)标记后做探针，与PCR产物杂交。此法既可作特异性鉴定，又可以提高检测PCR产物的灵敏度，还可知其分子量及条带形状。斑点杂交：将PCR产物点在硝酸纤维素膜或尼膜薄膜上，再用内部寡核苷酸探针杂交，观察有无着色斑点，主要用于PCR产物特异性鉴定及变异分析。核酸序列分析：是检测PCR产物特异性的最可靠方法。现在学习的是第20页，共35页原位PCR原位PCR就是在组织细胞里进行PCR反应，它结合了具有细胞定位能力的原位杂交和高度特异敏感的PCR技术.原位PCR是Hasse等于1990年

22、建立的 实验用的标本是新鲜组织、石蜡包埋组织、脱落细胞、血细胞等.其基本方法为固定组织或细胞:将组织细胞固定于预先用四氟乙烯包被的玻片上，并用多聚甲醛处理，再灭活除去细胞内源性过氧化物酶.蛋白酶K消化处理:用60ug/ml的蛋白酶K将固定好的组织细胞片55消化处理2h后，962min以灭活蛋白酶K.PCR扩增:在组织细胞片上，加PCR反应液，覆盖并加液体石蜡后，直接放在扩增仪的金属板上，进行PCR循环扩增.有的基因扩增仪带有专门用于原位PCR的装置.杂交:PCR扩增结束后，用标记的寡核苷酸探针进行原位杂交.显微镜观察结果.现在学习的是第21页，共35页连接酶链反应连接酶链反应连接酶链反应(Li

23、gase chain reaction，LCR)，主要用于点突变的研究及靶基因的扩增.1997年,Backman为检出靶基因序列中的点突变而设计发明.1988年Landegren也进行了该项研究.1988年Backman等分离热稳定的连接酶 1991年Backman和Barany分别用耐热DNA连接酶进行了LCR试验.耐热DNA连接酶可以在热循环中保持活性，提高连接反应的特异性，排除了背景扩增和免除了不断补充酶的繁琐程序.现在学习的是第22页，共35页LCR的基本原理 利用DNA连接酶.特异地将双链DNA片段连接，经变性-退火-连接三步骤反复循环，从而使靶基因序列大量扩增.其程序为:在模板DN

24、A、DNA连接酶、寡核苷酸引物以及相应的反应条件下，9495,DNA变性，双链打开，降温退火(65)，引物与之互补的模板DNA结合并留下一缺口，如果与靶序列杂交的相邻的寡核苷酸引物与靶序列完全互补，DNA连接酶即可连接封闭这一缺口，则LCR反应的三步骤(变性-退火-连接)就能反复进行，每次连接反应的产物又可在下一轮反应中作模板，使更多的寡核苷酸被连接与扩增.若连接处的靶序列有点突变，引物不能与靶序列精确结合，缺口附近核苷酸的空间结构发生变化，连接反应不能进行，也就不能形成连接产物.LCR的引物是两对分别互补的引物，引物长度为2026个，以保证引物与靶序列的特异性结合，LCR识别点突变的特异性高

25、于PCR，其特异性首先取决于引物与模板的特异性结合，其次是耐热连接酶的特异性.LCR连接反应温度接近寡苷酸的解链温度(Tm)，因而识别单核苷酸错配的特异性极高.LCR的扩增效率与PCR相当，用耐热连接酶做LCR只用两个温度循环，94min变性和65复性并连接，循环30次左右.其产物的检测也较方便灵敏.目前该方法主要用点突变的研究与检测、微生物病原体的检测及定向诱变等，还可用于单碱基遗传病多态性及单碱基遗传病的产物诊断，微生物的种型鉴定，癌基因的点突变研究等.现在学习的是第23页，共35页LCR的引物是两对分别互补的引物，引物长度为2026个，以保证引物与靶序列的特异性结合，LCR识别点突变的特

26、异性高于PCR，其特异性首先取决于引物与模板的特异性结合，其次是耐热连接酶的特异性.LCR连接反应温度接近寡苷酸的解链温度(Tm)，因而识别单核苷酸错配的特异性极高.LCR的扩增效率与PCR相当，用耐热连接酶做LCR只用两个温度循环，94min变性和65复性并连接，循环30次左右.其产物的检测也较方便灵敏.目前该方法主要用点突变的研究与检测、微生物病原体的检测及定向诱变等，还可用于单碱基遗传病多态性及单碱基遗传病的产物诊断，微生物的种型鉴定，癌基因的点突变研究等.现在学习的是第24页，共35页依赖核酸序列的扩增依赖核酸序列的扩增(Nucleic acid sequence-based ampl

27、ification，NASBA)，又称自主序列复制系统(self-sustainedsequence replication，3SR)或再生长序列复制技术.1990年Guatelli等首先报道了这一技术.NASBA主要用于RNA的扩增、检测及测序.该反应有赖于AMV逆转录酶，T7RNA多聚酶和核酸酶H(RNaseH)共同协作而完成.NASBA反应体系中除含有上述三种酶外，还含有dNTP，NTP,两种特殊的引物和缓冲液.引物I 3末端与靶序列互补，5端含T7RNA多聚酶的启动子，引物的碱基序列与cDNA的5未端互补.现在学习的是第25页，共35页在NASBA反应时，引物与RNA模板复性(结合)，

28、AMV逆转录酶催化合成cDNA，RNaseH水解cDNA上的RNA，形成一条单链的DNA;引物随即与此cDNA的5未端结合，逆转录酶在此DNA模板的指导下合成第二条DNA链.DNA双链含有T7RNA多聚酶的启动子.该酶即以此DNA为模板，转录出与样品RNA序列相同的RNA链，而且每条DNA模板在该酶的作用下可合成约100个拷贝的RNA.每条新的RNA又可作为逆录酶的模板合成cDNA.如此反复进行，将获得更多的RNA和cDNA.其基本方法为:将引物，标本加入扩增反应液，651min使RNA分子二级结构打开，降温至37加入逆转录酶，T7RNA聚合酶和RNaseH，并在37反应11.5小时 .NAS

29、BA的特点为操作简便，不需特殊仪器，不需温度循环.整个反应过程由三种酶控制，循环次数少，忠实性高，其扩增效率高于PCR，特异性好.现在学习的是第26页，共35页现在学习的是第27页，共35页现在学习的是第28页，共35页Q复制酶反应复制酶反应Kacian等于1972年首次报报Q复制酶(Q-beta replicase)催化RNA模板的自我复制功能.在常温30min，将其天然模板MDV-1RNA扩增至109.1986年Chu等报道用生物标记的靶序列特异性探针，可与亲和素联接的MDV-1RNA杂交，经洗脱未被结合的MDV-1后，再加入Q复制酶，扩增复制MDV-1拷贝，然后用溴乙锭染色检测或用同源性

30、的第二探针杂交.Q复制酶是一种RNA指导的RNA聚合酶，它有3个特点:不需寡核苷酸引物的引导就可启动RNA的合成.能特异地识别RNA基因中由于分子内碱基配对而形成的特有的RNA折叠结构.在Q复制酶的天然模板MDV-1RNA的非折叠结构区插入一短的核酸序列不影响该酶的复制.因而，如在此区插入核酸探针，则其序列照样可能被Q复制酶扩增.现在学习的是第29页，共35页1988年Lizardi等，将靶基因序列插进MDV-1质粒里，用T7RNA聚合酶催化转录出MDV-1RNA探针，这种RNA探针可与靶序列杂交，然后洗去非杂交的探针，加入Q复制酶来扩增探针，被扩增的探针又可作为模板进行扩增，并呈指数递增.其

31、产物按上述两种方法进行检测.现在该技术又发展了夹心杂交法，分子开关和靶依赖的复制等技术.现在学习的是第30页，共35页现在学习的是第31页，共35页免疫免疫-PCR免疫-PCR(immuno-PCR)利用抗原-抗体反应的特异性和PCR扩增反应的极高灵敏性来检测抗原，尤其适用于极微量抗原的检测.免疫-PCR试验的主要步骤有三个:抗原-抗体反应，与嵌合连接分子结合，PCR扩增嵌合连接分子中的DNA(一般为质粒DNA).该技术的关键环节是嵌合连接分子的制备.在免疫-PCR中，嵌合连接分子起着桥梁作用，它有两个结合位点，一个与抗原抗体复合物中的抗体结合，一个与质粒DNA结合，其基本原理与ELISA和免疫酶染色相似，不同之处在于其中的标记物不是酶而是质粒DNA，在操作反应中形成抗原抗体-连接分子-DNA复合物，通过PCR扩增DNA来判断是否存在特异性抗原.免疫PCR优点为:特异性较强，因为它建立在抗原抗体特异性反应的基础上.敏感度高，PCR具有惊人的扩增能力，免疫PCR比ELISA敏感度高105倍以上，可用于单个抗原的检测.操作简便，PCR扩增质粒DNA比扩增靶基因容易得多，一般实验室均能进行.现在学习的是第32页，共35页现在学习的是第33页，共35页现在学习的是第34页，共35页现在学习的是第35页，共35页