微波-酶法提取远志总皂苷的工艺研究_远志皂苷.docx

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1、微波-酶法提取远志总皂苷的工艺研究_远志皂苷 摘 要:目的:优选远志总皂苷的微波-酶法最佳提取工艺条件。方法:用乙醇和水为溶剂,以远志提取液中总皂苷提取物的收率为指标,采纳3因素3水平的正交设计法和单因素法对微波-复合酶法提取工艺条件进行优选。结果:试验条件下的最优工艺条件为:在pH=7,45条件下,酶解时间为1h,限制料液比125,微波功率255W,提取4min,乙醇浓度95%,酶浓度为0.30%,远志总皂苷的提取率达2.03%;用显微镜视察到微波、复合酶破坏了远志细胞壁的结构;薄层色谱分析表明微波未破坏皂苷结构。结论:与干脆传统乙醇回流提取法相比,微波-酶法提取能大大缩短提取时间,降低有机

2、溶剂用量,并能提高远志总皂苷的收率。 关键词:微波-酶提取法;远志;总皂苷;正交试验 中图分类号:R284.2 文献标识码:A 文章编号:1673-7717(2010)01-0097-04 Microwaveenzymatic Extraction Process of Total Saponins in Polygala WANG Yingli,WANG Yunting (Shanxi University of Traditional Chinese Medicine, Taiyuan 030024 ,Shanxi,China) Abstract:Objective:Optimizatio

3、n the extraction conditions of total saponins in Polygala using microwaveenzymatic extraction method.Methods:Using ethanol and water as solvent , the yields of total saponins in Polygala as indicator, using three factors and three levels of the orthogonal design and single-factor method of microwave

4、enzymatic extraction method, the extraction process conditions were optimized.Results:Under the experimental conditions the optimum process conditions are as follows: pH = 7,45 , 1h hydrolysis time, the ratio ofmaterial to liquid is 1:25, microwave power is 255W, extraction time is 4min, the concent

5、ration of ethanol is 95% , enzyme concentration is 0.30%, the total extraction rate of total saponins in Polygala is 2.03%; From the microscope view the microwave and enzyme destroyed the cell wall of polygala; through the thin-layer chromatography plate, the microwave did not damaged the structure

6、of saponins. Conclusion: Comparing to traditional method of direct ethanol extraction, microwave - enzymatic extraction method can greatly shorted the extraction time, reduce the amount of organic solvents and can improve the yields of total saponins in Polygala. Key words:microwaveenzymatic extract

7、ion method;Polygala;total saponins;orthogonal experiment 远志科远志属植物全世界有500多种,分布于欧亚大陆和美洲的亚热带和温带地区。我国有42种8变种,资源较丰富1。远志为常用中药之一,药用历史悠久,在神农本草经中列为上品。中国药典2005年版一部规定其来源为远志(Polygala tenuifolia Willd.)或卵叶远志(Polygala sibirica L.)的干燥根2。性苦、辛、温。归心、肾、肺经。有安神益智、祛痰开窍,消散臃肿的功效。远志中富含三萜皂苷、口山酮、寡糖酯类化合物,以及香豆素、木质素、黄酮、生物碱、酚类配糖体

8、等3。探讨表明,远志冷静、祛痰等功效的有效成分为远志皂苷。 皂苷的传统方法中渗漉法提取率较高,操作简洁,提取液杂质少,但是溶剂消耗过大,提取周期较长。乙醇回流法方法简便,工艺条件易于限制,但提取率较低。微波是一种非电离的电磁辐射,被辐射物质的极性分子在微波电磁场中快速转向及定向排列,从而产生撕裂和相互摩擦引起发热,微波提取技术具有快速、溶剂用量少、提取率高、成本低、质量好等很多优点4。纤维素酶能水解结构致密的植物细胞壁,有利于细胞内皂苷等有效成分的溶出。将微波提取法与生物酶提取法相结合用于提取远志总皂苷,由于提取温度低,提取时间短,在显著提高远志总皂苷提取率的同时,使远志中的有效成分得以溶出而

9、不分解,保持其中的药用功效。本文用微波一酶法提取远志总皂苷,用红外分光光度法测定远志总皂苷含量,优选出了最佳的提取工艺条件。 1 试验材料 1.1 主要仪器 VIS-723G可见分光光度计(北京瑞利分析仪器公司);FA/JA1004万分之一电子天平(上海精密科学仪器有限公司);ZF-90暗箱式紫外透射仪(=365,上海顾村电光仪器厂);KD-25B-C电脑烧烤微波炉(北京美的有限公司);PHG-9075A电热恒温鼓风干燥箱(上海一恒科学仪器有限公司);HX-200A高速中药粉碎机(浙江省永康市溪岸金具厂);HH-Z电热恒温水浴锅(北京科伟永兴仪器有限公司)。 1.2 药材及试剂 远志药材经GM

10、P认证(由安国市京兴药业有限责任公司供应),经本院中药鉴定教研室裴香萍老师鉴定;远志皂苷化学比照品,供含量测定用(编号111572200702,由中国药品生物制品鉴定所供应);SPE001复合酶(由夏盛实业集团有限公司供应,XPl500万);香草醛、高氯酸、冰醋酸、95%乙醇、甲醇、石油醚(3060)均为分析纯;硅胶G薄层板(厚度:0.200.25mm;规格:30mm100mm;青岛海洋化工厂分厂)。 2 分析测定方法 2.1 远志药材脱脂 取适量干燥的40目远志药材粉末,在常压,45水浴中用石油醚依次脱脂两次,料液比分别是15和13;连续回流脱脂回收废液石油醚。脱脂率均值为22%,脱脂后的远

11、志粉末备用。 2.2 远志总皂苷含量的分光光度法测定 2.2.1 远志总皂苷比照品和供试品溶液的制备 精密称取远志皂苷元比照品,加甲醇制成0.7mg/mL的溶液,定容于25mL容量瓶中作为比照品溶液。 称取已脱脂的远志粉末2g,置于三角烧瓶中,加入肯定浓度的乙醇溶液50mL,用微波辐射30s,间隔lmin,再辐射30s,重复至总辐射时间达到试验规定时间,微波功率30%为255W。滤过后将提取液用蒸发皿蒸干,用甲醇将其溶解,过滤定容于25mL容量瓶中,作为供试品溶液。 2.2.2 标准曲线的制备 精密吸取供试品溶液和比照品溶液20L分别置于具塞试管中,经显色后,在400600nm扫描测定最大吸光

12、度。经测定两溶液均在568nm处有最大汲取波长。 精密吸取20L,40L,60L,80L,100L,120L比照品溶液于6支具塞试管中,与60水浴加热挥发干,再分别向试管中加入0.2mL,5%香草醛-冰醋酸(簇新配制),0.8mL高氯酸,密塞。将试管放入60的水浴锅中恒温15min,再将其放入冰水混合物中冷却5min,取出各加5ml冰醋酸摇匀静置15min。在568nm波特长测定吸光度,随行试剂作空白参比5。以吸光度A为横坐标,远志皂苷元含量C(mg)为纵坐标绘制标准曲线,求得回来方程C=0.0594A+0.0045,r2=0.9864。 2.2.3 样品溶液的含量测定 精密吸取上述配制好的样

13、品溶液20L于具塞试管中,根据比照品显色方法配制,测定吸光度,用回来方程计算浓度,即远志总皂苷含量以远志皂苷元计。 3 试验结果与分析 3.1 远志总皂苷提取的单因素试验 3.1.1 料液比的选择 在微波功率255W时,微波提取时间2min,乙醇浓度95%的条件下,考察料液比对总皂苷提取率的影响,结果如图1。 图1表明,料液比为125时总皂苷的提取率较大,提取较充分,因此料液比选125比较合适。 3.1.2 提取时间的影响 在微波功率255W,料液比125,乙醇浓度65%的条件下,变更微波时间考察远志皂苷提取效果,结果如图2。 由图2可以看出,从2min到4min,提取率有很大提高,4min后

14、,提取率的增幅很小,说明微波4min时提取的远志总皂苷已经比较彻底,再进一步提取不会有很大的提高。所以从节能方面考虑,提取时间4min最佳。 3.1.3 酶用量的选择 在微波功率255W,微波时间2min,乙醇浓度95%的条件下,变更酶用量考察远志皂苷提取效果,酶用量一般为原药材干物质重量0.1%1%之间,试验结果如图3。 由图3可以得出,随着酶用量的增大,总皂苷提取率有渐渐下降的趋势。所以酶浓度为0.3%时,提取率最佳。 3.2 微波一酶法提取工艺正交试验 在单因素试验的基础上,选取酶用量(A)、提取时间(B)、乙醇浓度(C)3个因素,每个因素3个水平,按L9(34)正交表进行试验,因素水平

15、支配见表1。称取40目已除脂的远志粉末2g,在45水中浸泡30min,再缓缓加入活化后的酶溶液(酶浓度为0.003g/mL,在45水浴中活化10min,加2mL酶溶液为药材干重的0.3%,4mL即为0.6%),并轻轻搅拌,在45水浴中酶解1h。考察酶对提取效率的影响。正交试验结果如表2,方差分析见表3。 由表2、表3可知,各因素对远志提取液中皂苷的影响程度为CAB,即乙醇浓度酶用量提取时间;酶用量、提取时间和乙醇浓度都具有显著性。最佳提取方案为A2B2C3,即酶用量2ml,提取时间4min,乙醇浓度95%,总皂苷提取率为2.028%。 3.3 微波一酶法对远志细胞显微结构的影响 远志总皂苷分布

16、于远志韧皮薄壁细胞中6,在显微镜下对远志原药粉末,脱脂后远志粉末、微波及微波一酶法提取后的残渣进行视察,其显微结构改变如图4所示。 由图4a视察到,未经处理的远志药材粉末的薄壁细胞中,含有很多油脂滴。经脱脂后的远志薄壁细胞中油脂滴已经很少(如图4b所示),用石油醚脱脂可将远志中的其它无用成分脱去,有利于进一步提取。由图4c视察到,脱脂后的远志细胞,经微波提取后,由于微波的破坏作用使大多细胞壁都裂开,有利于细胞中远志总皂苷的提取。再经酶处理后的细胞壁受到更大的破坏(如图4d所示)。 微波场能使细胞壁裂开,细胞膜的透过选择性消逝,细胞中皂苷能自由通过细胞膜。复合酶也可以分解细胞的纤维素,这样使细胞

17、中皂苷成分易于被溶剂溶出,从而更进一步提高远志总皂苷的提取效率。 3.4 远志总皂苷的薄层色谱鉴定 将传统回流提取和微波一酶法提取的总皂苷做薄层色谱鉴定,分别吸取两种远志总皂苷供试品溶液6uL,点于同一硅胶G薄层板,以氯仿甲醇水(653510)10以下分液漏斗萃取后,静置,取下层溶液为绽开剂,在立式绽开槽中饱和20min,绽开,展距为8cm,取出,晾干,喷以20%H2SO4乙醇溶液,在105烘箱中加热至斑点显色清楚,置紫外光灯(365nm)下检视,视察可知两种方法提取效果基本一样,两种提取方法提取出的皂苷成分一样,微波-酶法对总皂苷无影响,见图5。 4 结 论 通过试验,得到了微波-酶提取远志

18、总皂苷的最佳工艺条件:取脱脂后远志粗粉,加入95%乙醇,料液比为125,在微波功率为255W,辐射时间为4min,远志总皂苷提取率达2.03%。 用显微镜观查到微波、酶都肯定程度破坏了远志细胞壁,从而提高远志总皂苷提取率;通过薄层色谱板视察到微波提取和传统提取法一样,说明未破坏皂苷结构。 微波-酶法提取远志总皂苷,不仅能缩短提取时间、提高皂苷产率,而且能削减试验器材,降低试验成本,在许多方面优于传统的干脆乙醇回流加热提取法。对于工业化提取具有主动的指导意义。 参考文献 1 张培轩,段瑞,黄鹏.中国远志属药用植物资源及地理分布J.基层中药,2002,16(6):42-43. 2 国家药典委员会.中华人民共和国药典•一部S.北京:化学工业出版社,2005:107. 3 傅晶,张东明,陈若芸.远志属植物的皂苷类成分及其药理作用探讨进展J.中草药,2006,37(1):144. 4 龚盛昭,杨卓如.微波提取黄芩苷的协同效应探讨J.精细化工,2003,20(7):435-437. 5 梁戈亮,林书玉,刘东.超声提取一分光光度法测定远志总皂苷的含量J.现代生物医学进展,2008,8(1):104-105. 6 滕红梅,李金亭,胡正海.远志根的发育解剖学探讨J.西北植物,2008,28(1):90-96.