金华市科技计划.docx

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1、金华市科技计划 划 金 华 市 科 技 计 划项目申请表说明书 项 目 名 称 ：幼年哮喘大鼠 IKK/- κ信号传导通路的调控探讨第一申请单位：金华职业技术学院 内容 1、立题依据(国内外相关探讨工作现状和存在的主要问题及本项目的创新之处) 2、探讨内容(探讨目标、探讨内容和拟解决的问题) 3、探讨方法和技术线路(采纳的探讨方法和技术线路及可行性分析) 4、预期结果(科学价值、社会效益、经济效益分析) 5、现有工作基础和条件 6、探讨工作的总体支配及进度 7、经费概算 一、立题依据（国内外相关探讨工作现状和存在的主要问题及本项目的创新之处） 近 10 年来，小儿哮喘患病率在全球范

2、围内尤其东南亚呈显著上升趋势，支气管哮喘是一种免疫反应介导的最常见的儿童慢性炎症性疾病，严峻威逼着儿童身心健康和生活质量，使患儿家庭、社会造成极大负担，因此，探讨本病机理和有关药物防治哮喘具有特别重要的意义。哮喘是一种以嗜酸性粒细胞（EOS）、肥大细胞反应为主的气道变应性炎症与气道反应性增高为特性的疾病，其本质是一种气道炎症，EOS 在此种炎症中起关键作用。Woolly KL 等发觉哮喘发作时患者外周血及气道内 EOS 均明显增加，随着病情改善，EOS 水平又明显回落，EOS 的削减主要是凋亡所致 1 。EOS 在气道局部的聚集与嗜酸性粒细胞的特异性趋化因子 Eotaxin,RANTES及 I

3、L- 5、IL-8、GM-CSF 等有关，Bcl-2 在细胞膜上的表达增加可抑制 EOS 的凋亡。其中 Eotaxin,被认为是能特异性地募集、趋化和激活作用最强的一种趋化因子 2 。Bandeira-Meloc 等用免疫组化方法探讨过敏性鼻炎患者的鼻粘膜上皮细胞中发觉有 EotaxinmRNA 表达,赐予动物吸入 Eotaxin,引起气道 Eos 浸润 3 ,.诱发哮喘发作的众多因素包括病毒感染、细菌脂多糖、氧化刺激、炎症介质等作用于机体通过丝裂素活化蛋白激酶（MAPK）和蛋白激酶 C(PKC)等信号转导通路促发众多致炎症细胞因子 Eotaxin,PAF,IL-1IL-2、 IL- 5、IL

4、-6、IL-8、IL-12、TGF 等的基因表达与合成。核转录因子（ κ）是上述众多细胞因子在基因水平调整表达和合成的关键上游信号因子，是哮喘、肿瘤、类风湿性关节炎、爱滋病等疾病发病机制探讨的热点之一 4 。核因子κB(NF-κB)是年 Sen 和 Baltimore首次发觉的为调整小鼠 B淋巴细胞中κ轻链表达的转录因子, NF-κB 是普遍存在于细胞浆中的一种快反应转录因子,它与一抑制性蛋白 IκB 结合而为非活性状态。它可以被很多刺激剂激活,例如氧化剂,细胞因子、蛋白激酶 C 激活剂、病毒、免疫刺激剂以及脂多糖、紫外线

5、等。被激活的 NF-κB 与 NF-κB 抑制蛋白(IκB)解离,转入核内与靶基因的κB 基序结合,增加其表达。NF-κB 调整的蛋白包括细胞因子(IL-1,IL-2,IL-5,IL-8 等)、趋化因子(Eotaxin,AP-1,RANTENS 等)、生长因子(TGF,C-CSF,GM-CSF 等)、粘附分子(ICAM-1,CCAM-1)、免疫受体(TCR)、转录因子、氧化应激相关酶(iNOs,cox-2, 5-脂氧化酶)以及急性期蛋白等 4 。众多的探讨表明 NF-κB 参加炎症和免疫反应、某些疾病的病理产生、急性期反应

6、、细胞周期限制与分化以及对病毒感染的反应等。所以 NF-κB 是特别重要的转录因子,与药物探讨有亲密的关系。NF-κB 是 NF-κB/Rel 家族的一员,哺乳动物有 5 种NF-κB/Rel 蛋白,p50(又称为 NF-κB1)和 p52 又称为 NF-κB2)由前体蛋白 p105和 p100 水解产生(p105 和 p100 还分别产生 IκBγ和 IκBδ),而 RelA(p65),RelB和 c-Rel 并非由前体蛋白产生。NF-κB 是由 p50 和 R

7、elA 组成的异源二聚体。在哺乳动物已克隆出 5 种 IκB 蛋白,分别为 IκBα,IκBβ,p105/IκBγ,p100/IκBδ和 IκBε。在胞浆中,NF-κB 因与抑制性蛋白 IκB 结合而以非活性异寡聚体的形式存在,目前发觉两种 Rel 蛋白复合物,一种为 Rel 同源或异源二聚体(例如p50和p65)与抑制性蛋白IκB家族成员(IκBα,IκBβ,IκB&

8、gamma;和IκBε),另一种为成熟的 Rel 与一未加工过 Rel 蛋白前体(例如 p105)结合成异源二聚体1,最普遍的组成好像是 p50、RelA(p65)和 IκB 按 1:1:1 组成的三聚体 5 。- κ激活机制有 2 条通路：1)κ磷酸化- 泛素- 降解通路：受刺激后,κ被磷酸化、泛素化,进而被 26的蛋白酶小体降解,从而解除了对核定位信号（）的限制,-κ得以转位到核内并与含有基因转录序列的结合,促进基因表达；κ受κ激酶(1、2)催化磷酸化,是细胞内信号转导变异(tr

9、amsduction)酶。1、2 激活受有丝分裂蛋白激酶系统()调整,- κ诱导激酶()是成员之一,属上游激活酶 6 ；2)氧化刺激通路：-κ是一个氧化还原敏感的转录因子,在机体代谢过程中体内各种氧化酶如、450、脂质氧化酶、细胞氧化酶、辅酶/泛醌复合物调整反应产生很多反应氧()包括超氧离子(-2)、过氧化氢(22)、氢氧化根离子(-)等,可导致破坏、蛋白碎解、脂质过氧化等,参加包括哮喘在内的各种疾病的形成。在急慢性炎症、空气污染、药物刺激等状况下,也可形成。α、- 1、和离子放射都可使细胞产生高水平,说明可能是- κ激活的共同调整因子,有文献提

10、到22 可引起κα过磷酸化形成,提示通过作用于上游对复合物来激活；同时重要的支持依据是,各种抗氧化剂如、或抗氧化酶(超氧歧化酶,谷胱甘肽过氧化酶)都有能阻挡 -κ通路。探讨证明可能是通过激活复合物而激活- κ信号转录链锁的一个重要成分,氧化/抗氧化平衡确定了- κ通路的激活 7 。近年来还发觉核转录因子 -κ是抑制细胞凋亡的一个关键性因子， - κ通过诱导或上调抗凋亡基因抑制凋亡，其中- 2 是一种结合于核膜、线粒体膜和内质网膜外表面的蛋白质,它通过变更膜对一些离子、小分子或蛋白质的通透性而参加细胞凋亡的调控。

11、- 2 可分为- 2 和cl两大亚族,前者抗细胞凋亡而后者促细胞凋亡 89 。 10 等发觉- κ能够通过激活 2 家族中的/- 1 而抑制由 -α引起的细胞凋亡。An-Soo Jang 等发觉哮喘病人痰液中 EOS 上 Bcl-2 的表达较正常人明显增高，Yasui等发觉氨茶碱是通过下调EOS上Bcl-2的表达而促进EOS的凋亡的，所以 EOS 上的 Bcl-2 表达增加可抑制 EOS 凋亡 11 。由此可推想，-κ的过度激活使 EOS 的凋亡受抑制而参加哮喘的发病。由以上综述可见核转录因子 -κ在哮喘发病机制中扮演着特别重要的角色，不但参加

12、EOS 在气道局部的聚集也参加 EOS 在局部的消退。针对 IKK/ -κ活性的激活和抑制，从不同的环节找寻药物用于预防和治疗支气管哮喘是抗哮喘药物探讨的一个新靶点，具有广袤的探讨前景。已证明糖皮质激素能下调核转录因子 -κ，但由于众所周知的糖皮质激素长期运用的副作用使得糖皮质激素在治疗哮喘时乃显美中不足而受到限制，尤其是可能给儿童造成的生长发育障碍让家长难以接受。吸入型糖皮质激素能否有效抑制 IKK/NF-κB 的激活国内尚无类似探讨，找寻到一个既能有效抑制核转录因子- κ的表达又没有明显的副作用的药物来治疗哮喘已显得特别迫切！银杏为古代遗子植

13、物，为银杏科银杏属多年生落叶乔木，在地球上存在约 2亿多年，素有自然活化石之称。银杏叶又称白果叶，银杏叶入药始于明代，其药用最早载于神农本草经。我国药典中记载银杏叶有润肺、平喘、止痛，用于肺虚咳嗽、冠心病心绞痛等。银杏在我国分布很广，资源非常丰富，我国的银杏资源占全球的 70%以上。探讨证明 EGb 具有广泛的药理作用:拮抗血小板活化因子、清除自由基、抗炎、抗过敏等 13 。EGb 是一类抗氧化剂，其主要活性成分为 24%黄酮苷和 6%银杏内酯 14 。黄酮苷是有效的自由基清除剂，其分子中含有还原性羟基(-OH)功能基团、可干脆发挥抗氧化作用，捕获和清除超氧阴离子等自由基和过氧化氢，通过对其起

14、一种氢原子供体的作用而阻断和终止自由基连锁反应链，从而阻挡和抑制氧自由基反应和脂质过氧化反应病理性加剧，削减代谢产物 MDA 和共轭二烯等毒副物质的生成。银杏内酯是自然的特异性血小板活化因子(PAF)拮抗剂 14 ，可以降低血粘度，有抑制血小板聚集和改善微循环的特性。当前有关银杏叶制剂应用性基础探讨主要集中在心脑血管病领域，而应用于哮喘病的基础探讨相对较少。虽然国内外有学者以银杏叶提取物作为自然的血小板活化因子 PAF 的拮抗剂来治疗哮喘大鼠，发觉能减轻 EOS 在呼吸道局部的聚集而减轻哮喘症状 15 。但国内外未见有关银杏叶提取物（EGb）与核因子（- κ）及其上游激酶IKK 关

15、系的报道，而国外有学者探讨发觉核因子作为一个众多炎症因子的转录激活因子可能也是血小板活化因子的一个上游因子，那么我们可以推想银杏叶提取物治疗哮喘的机理可能不仅仅是通过拮抗血小板活化因子（PAF）而发挥作用的。另一方面银杏叶提取物（EGb）作为一种抗氧化剂的作用越来越受到人们的关注，Chen,-J-W 等探讨发觉银杏提取物能抑制人主动脉内皮细胞中肿瘤坏死因子介到导的活性氧的生成 16 ；Rimbach,-G 等发觉银杏提取物（Egb761）能诱导人角质细胞的谷胱甘肽的合成 17 。这些探讨均提示银杏提取物有强大的抗氧自由基和诱导体内还原性物质生成的作用，但探讨领域集中在心血管病范围，对哮喘病分子

16、水平的探讨无论国内外均极少报道。假如本探讨能证明银杏叶提取物（EGb）能利用其强大的抗氧化作用而下调哮喘大鼠肺组织中κ激酶()和核因子（- κ）的表达进而削减嗜酸粒细胞趋化因子（Eotaxin）等的合成，削减 EOS 在局部的聚集同时又能促使 EOS 的凋亡，那么银杏叶提取物（EGb）治疗哮喘意义就会得到扩大和充溢。我省是中医药大省，尤其我市有着悠久的银杏种植历史，银杏资源丰富，银杏叶制剂开发有肯定的基础，如浙江康恩贝制药公司开发的天保宁在全国心血管病领域有很高的声誉，但在开发抗哮喘作用的银杏叶制剂在全国尚未有特别胜利的例子，进一步探讨银杏叶制剂抗哮喘的机理，以期望分别

17、并提高其中有效的抗哮喘成分，其成果将会产生巨大的社会效益和经济效益。本课题为这一有着迷人发展前景的药物开发探讨供应理论基依据 参考文献 1. Woolley KL,Gibson PC.Carty k,et.al. Eosinophil apoptosis and the resolution of aiway inflammation in asthma.Am J Reespir Care Med,1996:154:237-243 2. Lilly CM,nakamura H.Belostotsky OI, Haley KJ,Garcia-Zepeda EA,Luster AD,Israel

18、E.eotaxin expression after segmental allergen challenge in subjects with atopic asthmaJ. AM J Respir Crit Care Med,2001;163(7):1669-1675 3. Bandeira-MeloC,HerbstA,WellerPF.Eotaxins:Contributing to the diversity of eosinophil recruitment and activationJ.Am J Respir Cell MolBiol,2001;24(6):653-657. 4.

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23、讨进展.中国新药与临床杂志,1999,18(5):315-317 15. Adamus WC,Hener HO Mcadc CJ et al. inhibitory effect of the new PAF acether antagonist WEB –2085 on pharmacologic changes induced byPAF inhalation in human being .Clin Pharm Ther,1998;42:15646216.Chen,-J-W.Ginkgo bilobaextract inhibitstumornecrosis factorac

24、tivation, and cell adhesion molecule expression in human aoritic endothelial cell. 17.Rimbach,-G. Induction of glutathionesynthesis in human keratinocytes byGinkgobilobaextract(Egb761). 本课题创新之处：本课题经过查阅大量的国内外文献尤其是有关哮喘病发病机制的最新进展，认为核因子（- κ）及其上游激酶丝裂霉素活化蛋白激酶系统（MAPKKK）的成员之一 IKK 可能是与哮喘发病有关的一条关键的信号传导通道。国外有关I.