荧光定量PCR技术用于食品肉类种源掺假鉴定.doc

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1、荧光定量PCR技术用于食品肉类种掺假鉴定在国内及国际贸易中，我国肉制品掺杂、以次充好的欺骗行为屡见不鲜，严重损害了消费者的利益，并且对我国出口肉制品在国际市场上的声誉造成损害。要杜绝这些掺杂使假的现象，关键手段是要建立一种能快速准确鉴别动物种成分的检测方法，为上述产品的质量做本质上的把关，进步执法的科学性和高效性，进一步进步检验检疫通关速度。因此，建立一种快速、灵敏、特异的检测肉类种的检测方法一直是有待解决的难题。目前，动物性成分鉴别的主要方法有物理、化学、免疫学和分子生物学方法。物理学鉴别方法常用镜检法，通过观察来区分禽类、哺乳动物和鱼类，但该方法本身却并不能区分动物的种类。在检测的过程中，

2、需要有经历的检验员进展操作，可以定量检测0.1%以下的骨片段。化学方法进展动物性分析p 主要有色谱法和光谱法两种，但是化学方法的样品制备比拟复杂，检测仪器相对较贵，无法分析p 高度处理过的样品。免疫学方法以检测蛋白质为根底，主要有同工酶检测、酶联免疫吸附分析p ELISA以及电泳方法等，但其由于缺乏较高重现性和灵敏度以及受样品性质影响而受到限制。免疫学鉴别方法主要用于鉴别粗加工肉类的动物种类，只有少数的方法可以用于检测蒸煮肉类的蛋白质，因此很多的免疫学鉴别方法都不能用于热处理肉品。分子生物学方法主要有常规PCR、多重PCR、实时荧光PCR等，同时DNA杂交技术、PCR-电泳、PCR-限制性片段

3、长度多态分析p 技术、随机引物的扩增法、环介导等温扩增技术、DNA基因检测手段式PCR技术等也是目前开展较为领先的几种分子生物学方法。荧光定量PCR通过荧光染料或荧光标记的特异性探针，对PCR产物进展标记跟踪，实时在线监控反响过程，结合相应的软件可以对产物进展分析p ，计算待测样品模板的初始浓度。本方法检测原理主要利用一对动物线粒体基因保守区域特异性引物，配以FQ-Buffer、耐热DNA聚合酶Taq酶、四种核苷酸单体dNTPs等成分，通过聚合酶链反响PCR-荧光法进展体外扩增，从而到达快速检测的目的。基于荧光定量分析p 技术，根据常见动物如猪、驴、牛、羊的DNA序列，设计并最后确定了特异引物

4、，建立了荧光定量PCR检测方法，可以用于猪、驴、牛、羊肉及肉制品的种成分快速鉴定检测分析p ，具有高效、快速、准确的特点，可进展批量样本快速检测。方法主要用于检测动物组织、血液以及食品、肉类制品、饲料中有动物种性特定成份鉴定，是适用于政府检测机构、食品加工企业、进出口贸易企业的优秀的检测分析p 方法。并且检测结果可以到达与国家要求的行业检测标准相一致，与欧盟、美国FDA检测标准相符合。荧光定量PCR技术用于食品肉类种检测方法建立1 检测原理本检测方法用一对线粒体基因保守区域特异性引物，配以FQ-Buffer、耐热DNA聚合酶Taq 酶、四种核苷酸单体dNTPs等成分，通过聚合酶链反响PCR-荧

5、光法进展体外扩增，从而到达快速检测的目的，实现对动物组织、血液以及食品、肉类制品、饲料中动物性成分的定性、定量分析p 。2 荧光定量PCR检测方法建立对猪、驴、牛、羊等动物样品进展预处理，进而对引物和探针设计、合成及使用，经过对动物样品进展DNA提取与测定，构建荧光定量PCR反响体系，并在荧光定量PCR仪中进展反响，通过对反响体系、检测手段的不断优化，最终形成完善的荧光定量PCR检测方法。3 荧光定量PCR检测方法验证以驴检测方法为例，进展荧光定量PCR检测方法验证。将动物组织经过匀浆、离心等预处理，进展DNA提取。应用荧光定量PCR快速检测方法对动物组织中驴成分进展检测。取出驴-qPCR M

6、I_、Taq酶系，配制测试反响体系。向每管中参加处理后样品或驴-阳性质控品和阴性质控品，并将各反响管放入定量PCR仪器的反响槽内，按对应顺序设置阴性控品，阳性质控品以及未知标本，并设置样品名称和循环条件，进展梯度循环反响，并对方法的特异性、灵敏性进展验证。反响完毕后，判断反响结果。检测结果说明，本研究建立的荧光定量PCR方法具有良好的特异性，与国标方法的检测结果符合率为100%，未出现假阳性或假阴性结果。用试剂盒分别检测不同浓度驴肉组织的样品，分别为：约1/2检测限浓度0.05%样品10个、检测限浓度0.1%样品10个和2倍高于检测限浓度0.2%样品10个测定见表1。检测结果：1/2检测限浓度

7、0.05%样品的阳性率为40%4/10；检测限浓度0.1%样品的阳性率为100%10/10；2倍检测限浓度0.2%样品的阳性率为100%10/10。结果说明，该试剂盒对驴性成分的检测限能到达的0.1%。利用本方法检测阴性样品20份，包括猪肉、羊肉、牛肉、驴肉样本各5份，对出现阳性结果的样本重复检测一次，通过阴阳性来判断试剂盒的特异性。检测结果说明，该方法对猪肉、羊肉、牛肉、驴肉性成分的检测假阳率为0。同时，检测含量等于或大于检测限的猪肉、羊肉、牛肉、驴肉样品30份，计算出假阴性率。对可疑阴性样本重复检测一次，统计假阴性数，计算假阴性率。按照以下公式计算假阴性率：假阴性率=假阴性数/30100%

8、，结果显示该方法对猪肉、羊肉、牛肉、驴肉性成分的检测假阴性率为0。此外，通过建立20多种动物样本的物种资库包括：大鼠、小鼠、豚鼠、猫、鸡、鸭、鹅、鹌鹑、牦牛、马、狐狸、貂、貉、兔、猫、猪、羊、驴、鹿等，利用荧光定量PCR检测方法进展物种间鉴定识别，结果显示，本方法可以有效识别样本物种来，种属间特异性检测结果表现良好。4 方法比照通过实验验证可得，荧光定量PCR技术检测动物性食品中驴性成分具有较高的准确性与稳定性，通过荧光信号的检测可以直接对产物进展定量。相比拟于传统的检测方法，荧光定量 PCR检测方法具有高通量和低本钱的优势，具有广阔的应用前景。维德维康保障食品种平安北京维德维康生物技术是一家

9、专业从事食品平安检测、兽药残留快速检测技术、动物疫病快速诊断技术研究及产品开发的高新技术企业，在兽药、非法添加剂、毒素、细菌蛋白等化合物的抗原和抗体制备方面具有丰富的理论根底和理论经历。公司坚持自主创新，现已建成了针对小分子化合物的抗体资库，库容量近千种，整合自身的工艺优势，实现了产品的高效产业化，迅速推出了当前市场紧缺的检测产品，为食品平安检测市场提供了更多更优的选择。目前，北京维德维康生物技术已获得完备的荧光定量PCR技术成果：提取制备了相应的猪、驴、牛、羊DNA模版，设计并合成出匹配的引物、探针，形成了完善的荧光定量PCR检测方法，并对其特异性、稳定性、灵敏性等指标进展了检验，为国内肉及肉制品行业食品平安保驾护航。第 7 页 共 7 页