海洋真菌的分离_抗肿瘤活性筛选与发酵条件研究_于垂亮.docx

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1、 研究报告。 海洋真菌的分离、抗肿瘤活性筛选与发酵条件研宄 于垂亮 崔承彬 h2 *，朱天骄 顾谦群 刘红兵 方玉春 韩冰 2,蔡兵 2 a.海洋药物教育部重点实验室，山东省海洋药物重点实验室，中国海洋大学海洋药物研究所， 山东青岛， 266003;2.天津生物医药研究所，天津， 300384) t商要：目的对青岛海域海水、海泥样品进行真菌选择性分离培养，并对其发酵物进行抗肿瘤活性筛选及 活性菌株发酵条件的研究。方法采用温敏型小鼠乳腺癌 tsFT210细胞系，运用流式细胞术结合显微镜镜检， 以细胞周期抑制和细胞凋亡诱导为活性筛选指标，并通过该活性指标对培养基、发酵条件及提取分离条件进 行考查。

2、结果添加青霉素、链霉素构成的土豆培养基具有很好的培养真菌选择性；共分离得到真菌 207株， 活性筛选得到阳性菌19株，其中编号 Zs3200的真菌具有显著的细胞凋亡活性。 关键词：海洋微生物；海洋真菌；细胞周期抑制；细胞凋亡；抗肿瘤 中图分类号： R931.771 R965.1 R979.1 文献标识码 :A 文章编号： 1002-3461 (2004)05-00CU-05 Study on the isolation of marine fungi, screening of their antitumor activity and fermentation conditions YU Ch

3、ui-liang， CUI Cheng-bin， ZHU Tian-jiao， GU Qian-qun， LIU Hong-bing， FANG Yu- chun，HAN Bing， CAI Bing (Key Laboratory of Marine Drugs Ministry of Education, Chinas Key Laboratory of Marine Drugs of Shangdong Province Marine Drug and Food Institute， Ocean University of China， Qingdao 266003? China ) A

4、bstract： Objective To isolate fungi from sea sediment and sea water samples collected from the neritic environment in Qingdao, screen their antitumor activity and study on their fermentation condition. Methods The antitumor activity was assayed by flow cytometry in mouse tsFT210 cells. Results The m

5、edium added penicillin and streptomycin possesses good selectivity. 207 strains of fungi were isolated and among them, 19 strains showed antitumor activity, and one fungus(Zg3200)pocesses strong cell apoptosis inducing activity. Key words： marine microorganisms； marine fungi； cell cycling inhibiting

6、； cell apoptosis； antitumor 细胞周期的调节失控或细胞凋亡被抑制 将引起肿瘤细胞的无限增殖，最终导致肿瘤 的产生和发展。从分子细胞生物学角度，肿 瘤可以看作是细胞周期和细胞凋亡的调控过 程发生了紊乱，致使肿瘤细胞盲目增殖的一 种状态，因此，以细胞周期抑制和细胞凋亡诱 导为活性指标进行细胞周期抑制剂或细胞凋 亡诱导剂筛选研究，有可能发现新的抗肿瘤 活性物质乃至抗肿瘤新药活性先导化合物。 鉴于此，我们利用小鼠乳腺癌温敏型 ts- 通讯作者： E-mail: cuicb shou. com FT210细胞活性筛选模型，从海洋微生物中 寻找相关活性物质 141。 由于海洋环境

7、十分独特，高压、低营养、 低温 (特别是深海）、无光照以及局部的高温、 高盐等所谓的生命极限环境，生存在这样环 境下的微生物与陆地微生物相比较，它们具 有一些独特的代谢途径和遗传背景，可能产 生特殊代谢产物，其化学结构类型多、活性显 著，是发现新活性先导化合物的重要源泉。 近年从海洋真菌代谢产物中发现许多结构新 颖的活性物质，引起广泛的关注 7。本文对 青岛海域海水、海泥样品中海洋真菌进行分 离培养、抗癌活性筛选及发酵条件研究，共分 离得到 207株真菌，经小鼠乳腺癌 tsFT210 细胞模型筛选发现 19株显示作用不同的细 胞周期抑制、细胞凋亡诱导及直接杀伤活性， 其中一株编号为 Z8320

8、0的真菌发酵产物显 示非常强的细胞凋亡诱导活性，该菌株经分 类学研究被鉴定属于真菌，并以活性为指标 进行了发酵条件研究，据此条件发酵生产得 到总浸膏。经活性追踪分离，己得到代表总 浸膏活性的化合物，该化合物的结构鉴定和 生物学评价研究工作目前正在进行中。 1材料和方法 1.1仪器与试剂 仪器： 试管摇床 TC-C-100R(日本高崎科学器 械株式会社 ）； 洁净工作台（苏净集团安泰公 司 ）；超声破碎仪 VC750 (Sonic & Mated- alsinc);显微镜 BX41 (Olympus 公司 ）； 真空 浓缩仪 SC50DDA(Savant公司 ） ;旋转薄膜蒸 发仪 EYELAN

9、-N 型 （ Tokyo Rikakikai co. ltd);动物细胞培养箱 Mcol75 (Sanyo公司 ）； 倒置显微镜 CK40 (Olympus公司）及流式细 胞仪 Facs Vantage 型（美国 Becton dicinson 公司）等。 试剂： 胎牛血清 （ FBS )为 Hyclone公司产品 (Cat. No. STF721); RPMI-1640 细胞培养 基 (Gibco 公司 ）； 碘化丙锭 Propidium Iodide (PI)和 Nonidet P-40 分别为 Sigma 和 Fluka 公司产品。 1.2菌株的分离培养 1.2.1样品来源 供培养的海水

10、、海泥样品采自青岛前海 和胶州湾海域。 1.2.2培养基 马铃薯 200g， 蔗糖 20g， 琼脂 20g， 陈海 水 1000mL。 120 C， 1. 5 kg cm2 下，灭菌 2h， 临用前分别加入青霉素 SOMgsmlT1， 链霉素 30MgmL 青霉素、链霉素各 30作。 1111 配成 3种培养基。 1.2.3菌株分尚与培养 无菌状态下称取海泥约 12,加入无菌海 水9mL， 振荡混匀，再分别稀释 10, 100倍共 制成 3个浓度梯度的样品，各取 0.2mL涂布 于固体培养基，每个梯度涂布多个平板。将 海水样品取 lmL同上操作， 28 C 培养，每天 观察并挑出单个生成菌落进

11、行再纯化后接种 于固体斜面培养基。 1.3初筛发酵 1.3.1培养基组成 山梨醇 2%，麦芽糖 2%，谷氨酰胺 1%， KH2P040.05%， MgS047 H20 0.03%， 色 氨酸 0.05%，酵母膏 0.3%， pH 6.5。 1.3.2初筛发酵及其样品制备 将上述所得菌种从固体斜面培养基取适 量接种到内盛 5mL上述液体培养基的试管 中，在 28 C， 240r。 min_1的条件下于试管摇 床中培养 7d， 将发酵物中的菌体超声破碎， 取 3 mL发酵液，加入 7 mL甲醇，室温搅拌 过夜， 4000r amirT1离心，取上清液真空低温 浓缩至干，干燥物加 0. 5 mL甲醇

12、溶解，供测 活性。 1.4生物活性测试 1.4.1样品配制 临用前将供测活性的样品分别用 MeOH 2 或含水 MeOH配制成所需各种浓度，供测活 性。 1.4.2细胞系与细胞培养 采用温敏型小鼠乳腺癌 tsFT210细胞 系，用含 10%胎牛血清的 RPMI-160培养 基，在 32 C，通入 5%C02的细胞培养箱中培 养继代。 1.4.3活性筛选方法 取对数生长期的 tsFT210细胞，用新鲜 RPMI-1640培养基配制成细胞密度为 2X 105个 /mL的细胞悬液，接种于 24孔板中，每 孔 0.5 mL。 各孔细胞中加入各种浓度的样 品液 5 ML， 并将细胞在培养箱中培养 17h

13、。 药物处理后的细胞直接于倒置显微镜下观察 细胞形态学变化，必要时进行拍照，再经 PI 染色后通过流式细胞仪测定细胞中 DNA的 含量分布。 1.5活性菌株 Z83200发酵生产条件考察 1.5.1发酵物稳定性试验 将液体发酵物超声破碎后加入甲醇提取 过夜后 OOrmirT1离心，取上清液真空低 温浓缩至干加入与原发酵液同体积的水，分 别取 0. 6mL调 pH为 2, 7, 9,密闭沸水浴 15min， 调 pH 7后浓缩至干，各加入 0. lmL 甲醇用于测活性。 1.5.2发酵培养基选择试验 选择下列 4种培养基分别接种，同等条 件培养后分别进行活性测试，以活性为指标 进行培养基选择。

14、I .山梨醇 2%，麦芽糖 2%，谷氨酰胺 1 %，KH2 P 4 o. 05% , MgS 4 7H2 O 0.03%,色氨酸 0.05%,酵母膏 0.3%, pH 6.5 II.甘露醇 2%,谷氨酰胺 1%, KH2P04 0.05%, MgS047 H20 0.03%，葡萄糖 0. 1%，酵母膏 0.3%，玉米浆 0.1%， pH 6.5 IILPDA， 葡萄糖 2%，麦芽糖 2%，麦芽 糖 1%，谷氨酰胺 1%，多种蛋白胨 0.5%， 酵母浸膏 0.3%， pH 6.0 IV.甘露醇 2%，葡萄糖 2%，酵母膏 0.5%，蛋白胨 1%， KH2P040.05%， MgS04 。 7氏

15、00.03%，玉米浆 0.1%，维生素溶液 1%， pH 6.0 1.5.3发酵条件考察 将 283200从固体斜面培养基取适量接 种到一个内盛 100 mL液体培养基的三角烧 瓶中，在28 C， 120r WiiT1摇床培养 24h， 作 为种子培养液，将该培养液按 10%接种量接 种于另外几个内盛 100 mL培养基的三角烧 瓶中，在与种子培养相同的条件下发酵培养 10d。 在发酵培养过程中，每天取样 5 10 mL， 监测发酵液 pH、菌体干重以及发酵物 样品的生物活性，并分别绘制相关曲线。用 于活性测试的发酵物样品制备方法与初筛发 酵样品的制备方法相同。 1.5.4溶剂萃取试验 将该菌

16、液体培养物 (确认有活性 )超声破 碎后，用 2只小离心管各取 0. 6mL该匀浆 液，分别用 0. lmoPlT1的盐酸调匀浆液 pH 至 2.0, 7.0,每个 pH值的样品再依次用等体 积的环己烷、醋酸乙酯、正丁醇超声萃取 2 次，将水层、有 机层共8个样品分别调 pH 7 后浓缩至干，分别加 0.6mL甲醇测活性。 1.6生产发酵 首先按上述相同方法和条件进行种子培 养，获种子培养液。将该种子培养液按 10% 接种量接种于 100个内盛 100 mL液体培养 基的三角烧瓶中，在 28 C， I20r lirT1摇床 培养 6d， 第 7天终止培养，发酵物用于分离 制备活性物质。 1.7

17、提取分离 提取分离的所有步骤均以活性为指标， 采用跟踪活性分离的实验操作。取经生产发 酵得到的发酵物（菌体与发酵液混合物 )，超 声破碎菌体，加入等体积的醋酸乙酯，室温搅 拌过夜，分 取醋酸乙酯层，相同提取重复 3 次，将所得醋酸乙酯合并、浓缩，得到有活性 的醋酸乙酯提取总浸膏（约 20 g)。 2 结果与分析 2.1菌株分离、培养与活性初筛结果 实验研究表明，含有青霉素、链霉素的土 豆培养基具有很好的选择性。从海泥、海水 样品中共分离得到真菌 207株，对这 207株 海洋真菌发酵产物进行相关活性的筛选，结 果发现共有19株具有抗肿瘤活性。其中一 株编号为 Z83200的真囷发酵样品显不有极

18、 强的细胞凋亡诱导活性。该菌株的发酵物样 品对 tsFT210细胞处理后的显微形态学观测 结果和所测得的流式细胞术直方图分别如图 1和图 2所示： 空白对照 给药 17h 图 1 tsFT210细胞的显微照片 空白对照 给药 17h 图 2 tsFT210细胞的流式细胞术直方图 图 1所示经样品处理后的细胞形态以及 图 2所示流式细胞术直方图中显著的 G /Gi峰均表明，经该样品处理 17 h后的 ts_ FT210细胞绝大多数己发生了凋亡 本实验各样品所得菌数与活性筛选结果 如表 1和表 2所不，可以看出，不同的样品培 养分离得到的真菌数量有明显差异，活性菌 的筛出几率也存在较大差别。提示我

19、们采集 样品要选择不同自然环境和地理区域，增加 样品的多样性，以提高菌株获得率与活性菌 的发现几率。 表 1海水样品中真 菌菌株 分离与活性测试结果 样品代号 J1 J2 J3 J4 J5 J6 J7 J8 菌株种数 32 3 19 9 8 11 5 25 活性菌数 2 3 2 1 0 0 0 3 表 2海泥样品中真 菌菌株 分离与活性测试结果 样品代号 Z1 Z2 Z3 Z4 Z5 Z6 Z7 Z8 Z9 Z10 Z11 Z12 菌株种数 11 19 11 3 8 5 20 4 5 0 4 4 活性菌数 0 1 0 1 0 0 3 2 1 0 0 0 注：表中不同的代号样品分别采集自不同的地

20、点 . 2.2发酵物稳定性试验结果 细胞活性测试镜检观察显示 ： pH 2和 pH 7条件下发酵物与未经处理样品具同等 活性 ， pH 9条件下的发酵物活性丧失，提示 后续实验中应避免碱性环境。 2.3培养基选择试验结果 细胞活性测试镜检观察显示 :4种培养 基发酵物均有活性，但浓缩相同倍数时培养 基 I的发酵物活性更强且菌体量更多，所以 选择培养基 I为大量发酵培养基。 2.4 发酵时效曲线测定结果 在进行大量生产发酵以前，首先考察了 Z83200株发酵生产活性物质的发酵条件 (pH、菌体干重、发酵样品的生物活性 )，结 果如图 3、 4和表 3所示。由图 3、 4和表 3所 示结果可以看出

21、，当发酵到第 6至 7天时，无 论菌体量还是生物活性都达到高峰，而此 后均有所下降。与此相应，发酵液的 pH值 在第 6至 7天达到和保持一定值，第 8天开 始又有升高。据此结果，生产发酵于发酵第 6天结束。 图 3 发酵液 pH随时间变化曲线 4 0 2.5溶剂萃取试验结果 不同溶剂按极性由小到大依次萃取时， 环己烷层有弱活性，醋酸乙酯层有较强活性， 图 4 菌丝体重量随时间变化曲线 正丁醇层和水层均无活性，因此确定用醋酸 乙酯进行萃取。 表 3 发酵样品对 tsFT210细胞的细胞凋亡诱导活性随发酵时间变化的测试结果 时间 （ d) 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 活性强弱 十

22、十十 十十十十十十十十十十十十十十 十十十 十十十 注：一， +， +， +十 +，十十十 +表不调亡活性强弱 2.6生产发酵总浸膏的活性 由生产发酵所得发酵物经醋酸乙酯提取 得到总浸膏和剩余水层，分别进行活性测试， 在相同浓度下只有总浸膏显示极强的细胞凋 亡诱导活性，而水层无活性。图 5中给出了 用不同浓度的总浸膏处理 tsFT210细胞并经 流式细胞术分析得到的部分直方图。 由图 5可见，该总浸膏的活性呈很好的剂量 依赖性，同时，重现了该菌株初筛发酵样品的 活性测试结果 (参见图 2)。 3 讨论 研究表明，在分离海洋真菌时加入青霉 素、链霉素的土豆培养基具有很好的选择培 养效果，同时还发

23、现样品采集的不同时间、地 点对于真菌的菌种多样性及活性菌株的发现 几率有很大关系，提示我们要增加样品采集 的多样性来提高活性菌的发现几率。活性筛 选结果表明海洋真菌在该筛选模型下活性率 为 10 %左右，是寻找和发现活性物质的重要 资源。 本研究所使用温敏型小鼠乳腺癌 ts- FT210细胞系，结合细胞形态学显微观察及 流式细胞术，可以直接确定待筛样品是否具 有细胞周期抑制、细胞凋亡诱导或对肿瘤细 胞的直接杀伤等抗肿瘤活性。这一模型及筛 选方法具有微量、快速、准确、直观、特异性强 等优点，为抗肿瘤活性物质的筛选及活性追 踪分离研究提供很好的检测手段。 本实验应用该方法不但获得具有极强细 胞凋亡

24、诱导活性的菌株 terrews Z83200株，并以活性为指标发酵培养条件研 究，为获得更多的活性物质及以后合理活性 追踪分离研究提供准确信息。目前总浸膏中 的活性化合物的活性追踪分离与鉴定工作正 在进行中。 图 5 tsFT210细胞经总浸膏处理 17 h 后的流式细胞术直方图 复方花刺参黏多糖对球囊血管成形术兔血浆 内皮素及血清一氧化氮的影响 4 王华亭，蔡生业，姚成芳，朱宗涛，王丽 (山东省医学科学院基础医学研究所，山东济南 250062) t商要：目的探讨复方花刺参黏多糖对家兔髂动脉腔内成形术 （ TA)后血浆内皮素及血清一氧化氮的影 响。方法 50只新西兰家兔随机分为 4组：花刺参组

25、、辛伐他汀组、模型组和正常组。花刺参组、辛伐他汀组和 模型组用球囊导管剥脱损伤髂动脉内皮后，喂高脂饲料 6wk， 髂动脉造影显示形成粥样硬化狭窄 .行 TA后， 即日均停喂高脂饲料改普通饲料，花刺参组和辛伐他汀组经胃管给药，模型组给等量生理盐水，分笼喂养，自 由饮水。正常组仅给予普通饮食及假手术。各组动物于 TA后 4wk空腹颈动脉同步采血行血浆内皮素、血清 一氧化氮浓度测定。结果 TA后 4wk， 模型组与正常组相比血浆 ET浓度明显升高，而血清 NO浓度明显降 低，花刺参组和辛伐 他汀组血浆 ET浓度显著低于模型组，而血清 NO浓度显著高于模型组。结论家兔髂动 脉 TA后 ET增多， NO

26、减少，存在血管内皮功能失调，而复方花刺参黏多糖通过调整 ET和 NO的平衡改善血 管内皮功能。 关键词：复方花刺参黏多糖；血管成形术；内皮素；一氧化氮 中图分类号： R282740. 5文献标识码 :A文章编号 ： 1002-3461 (2004)05-0006-05 致谢：日本理化学研究所长田裕之博士 提供 tsFT210细胞。本研究得到国家自然科 学基金项目（ 30171102)、国家高技术研究发 展计划 （ 863计划）项目 （ 2001AA624020)、山 东省科技攻关计划项目（ 0121100107)、山东 省自然科学基金重点项目 （ Z2001C01)、 国家 杰出青年科学基金项

27、目（ 39825126)、国家重 点 基 础 研 究 发展规划 （ 9 7 3 ) 项目 (G1998051113)以及国家教育部长江学者奖 励计划相关基金资助。 参考文献： ij欧阳高亮，李祺福，洪水根 .细胞凋亡与肿瘤发生发展 和治疗 IJJ .国外医学肿瘤学分册， 2000, 27(5): 266. 2 Cui CB, Kakeya H, OkadaG, etal. Novel mammalian cell cycle inhibitors， tryprostatin A, B and other diketopiperaz- ines produced by Aspergillus f

28、unnigatus I ： Taxonomy, fermentation, isolation and biological properties J . J Antibiotj 1996, 49(6)： 527. 3 Wang H, Cui CR Han B, etal. Elaiophylins, new cell cycle inhibitor and apoptosis inducers, produced by Strepto- myces pseudoverticillus I ： Taxonomy, production and isola- tionJ.中国抗生素杂志， 200

29、1， 26(1): 19. 4 Cui CB, Wang H, Han B, etal. Elaiophylins, new cell cycle inhibitor and apoptosis inducers, produced by Strepto- myces pseudoverticillus II ： Structures and biological properties J.中国抗生素杂志， 2001， 26(3): 165. 5 Tatjana V, Achenbach EP, Slater, et al. Inhibition of Cyclin-Dependent Kinase Activity and Induction of Apoptosis by Preussin in Human Tumor Cells J . Antimicrobial agent and chemotherapy-, 2000, 44(10)： 2794. 6 朱天骄，崔承彬，顾谦群，等 .海洋微生物的分离培养 及抗肿瘤活性初筛 J.青岛海洋大学学报， 2002, 32(1): 123. 7 徐怀恕，张晓华 .海洋微生物技术 .青岛海洋大学 学报， 1998, 28(4): 573. (收稿日期： 2004-03-02)