固定化酶及固定化技术讲稿.ppt

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1、关于固定化酶及固定化技术第一页，讲稿共一百二十五页哦酶：酶：l在水溶液中不稳定在水溶液中不稳定l一次性使用一次性使用-难回收，难连续化生产难回收，难连续化生产l用于医药用于医药/化学分析纯度要求高化学分析纯度要求高l产物的分离纯化困难产物的分离纯化困难l。l要求将酶变成不溶性要求将酶变成不溶性l实际上将酶限制在一定空间实际上将酶限制在一定空间 固定化固定化第二页，讲稿共一百二十五页哦固定酶具有催化活性固定酶具有催化活性l19161916年，美国科学家发现，年，美国科学家发现，酶和载体结合以后酶和载体结合以后，在水，在水中呈不溶解状态时，中呈不溶解状态时，仍然仍然具有生物催化活性具有生物催化活性

2、。固定化酶可重复使用固定化酶可重复使用操作稳定性操作稳定性 酶在固定化后其活力可以缓慢释放酶在固定化后其活力可以缓慢释放,酶的稳定性比天然酶的稳定性比天然状态高状态高,可重复多次使用可重复多次使用.第三页，讲稿共一百二十五页哦l结果如图所示:固定化酶的活力基本保持稳定活力损失15%,由此可见该固定化酶具有良好的操作稳定性例:将0.5g DEAE 纤维素固定化壳聚糖酶与10mL 1%壳聚糖溶液在60下连续反应10 次每次反应时间为6h 每次反应后分别测定酶活力第四页，讲稿共一百二十五页哦一、固定化酶（一、固定化酶（immobilized enzymeimmobilized enzyme）水溶性酶

3、水溶性酶水不溶性载体水不溶性载体固定化技术固定化技术水不溶性酶水不溶性酶（固定化酶）（固定化酶）什么是固定化酶？什么是固定化酶？第五页，讲稿共一百二十五页哦固定化酶：是指经物理或化学方法处理，限制固定化酶：是指经物理或化学方法处理，限制在一定的空间范围内，可以反复使用而又能发在一定的空间范围内，可以反复使用而又能发挥催化作用的酶制剂。挥催化作用的酶制剂。酶的固定化技术包括酶的固定化技术包括吸附、交联、共价结合吸附、交联、共价结合（化学偶联）及包埋（化学偶联）及包埋等多种方法。等多种方法。第六页，讲稿共一百二十五页哦与固定化酶技术相配套的是与固定化酶技术相配套的是酶生物反应器酶生物反应器同一般的

4、化工容器一样，需要对酶反应器温度同一般的化工容器一样，需要对酶反应器温度和和pHpH等条件进行严格的控制；不同的是，酶反应等条件进行严格的控制；不同的是，酶反应器必须进行无菌操作。器必须进行无菌操作。酶生物反应器酶生物反应器第七页，讲稿共一百二十五页哦简简 史史19161916年，年，Nelson&Griffin“Nelson&Griffin“酶不溶于水而具有活性酶不溶于水而具有活性”19481948年，年，Sumner Sumner 尿素酶制成非溶性酶尿素酶制成非溶性酶19531953年，年，Grubhofer&Schleith Grubhofer&Schleith 第一次实现了酶的固定化第

5、一次实现了酶的固定化19601960年，千细一郎，开始了氨基酰化酶固定化研究年，千细一郎，开始了氨基酰化酶固定化研究19691969年，千细一郎成功的将固定化氨基酰化酶应用于年，千细一郎成功的将固定化氨基酰化酶应用于DL-AADL-AA的的光学分析上光学分析上19711971年，固定化酶名称提出，年，固定化酶名称提出，Immobilized enzymeImmobilized enzyme第八页，讲稿共一百二十五页哦19731973年，固定化微生物的应用年，固定化微生物的应用固定化大肠杆菌中的天冬氨酸固定化大肠杆菌中的天冬氨酸酶，由反丁烯二酸连续生产酶，由反丁烯二酸连续生产L-L-天冬氨酸天冬

6、氨酸19761976年，固定化酵母细胞生产啤酒和酒精年，固定化酵母细胞生产啤酒和酒精19781978年，日本用固定化细胞生产酶年，日本用固定化细胞生产酶固定化枯草杆菌生产固定化枯草杆菌生产淀粉酶淀粉酶19791979年，固定化植物细胞和动物细胞开始研究年，固定化植物细胞和动物细胞开始研究19821982年，日本首次研究用固定化原生质生产氨基酸年，日本首次研究用固定化原生质生产氨基酸19861986年，郭勇等人固定化原生质研究年，郭勇等人固定化原生质研究第九页，讲稿共一百二十五页哦第十页，讲稿共一百二十五页哦二、固定化酶的优缺点：二、固定化酶的优缺点：稳定性高；稳定性高；酶可反复使用；酶可反复使

7、用；产物纯度高，极易将固定化酶与底物、产物分开；产物纯度高，极易将固定化酶与底物、产物分开；固定化酶的反应条件易于控制固定化酶的反应条件易于控制生产可连续化和自动化，节约劳动力；生产可连续化和自动化，节约劳动力；设备小型化、可节约能源。设备小型化、可节约能源。固定化酶同自由酶相比，具有以下优点：固定化酶同自由酶相比，具有以下优点：第十一页，讲稿共一百二十五页哦缺点：缺点：固定化所需载体和试剂较贵，成本高，投资大固定化所需载体和试剂较贵，成本高，投资大固定化时，酶活力有损失固定化时，酶活力有损失长期生产，易污染，载体易降解，酶易失活长期生产，易污染，载体易降解，酶易失活只能用于可溶性底物，较适用

8、于小分子底物，对大分子只能用于可溶性底物，较适用于小分子底物，对大分子底物不适宜底物不适宜与完整菌体相比不适宜于多酶反应，特别是需要辅助因子与完整菌体相比不适宜于多酶反应，特别是需要辅助因子的反应的反应第十二页，讲稿共一百二十五页哦三、固定化酶制备三、固定化酶制备l必须注意维持酶的催化活性及专一性。必须注意维持酶的催化活性及专一性。酶与载体的结合部位不应当是酶的活性部位（酶活性中心的氨基酸残基不发生变化）避免那些可能导致酶蛋白高级结构破坏的条件。由于酶蛋白的高级结构是凭借氢键、疏水键和离子键等弱键维持，所以固定化时要采取尽量温和的条件，尽可能保护好酶蛋白的活性基团。基本原则：基本原则：第十三页

9、，讲稿共一百二十五页哦l固定化应该有利于生产自动化、连续化。固定化应该有利于生产自动化、连续化。l载体能抗一定的机械力。l固定化酶应有最小的空间位阻。固定化酶应有最小的空间位阻。l酶与载体必须结合牢固，利于固定化酶的回收及反复使用。酶与载体必须结合牢固，利于固定化酶的回收及反复使用。l固定化酶应有最大的稳定性，所选载体不与废物、产物固定化酶应有最大的稳定性，所选载体不与废物、产物或反应液发生化学反应。或反应液发生化学反应。l固定化酶成本要低，以利于工业使用。固定化酶成本要低，以利于工业使用。第十四页，讲稿共一百二十五页哦酶的固定化方法酶的固定化方法四大类方法：四大类方法：吸附法（包括电吸附法）

10、吸附法（包括电吸附法）结合法（无机多孔材料）结合法（无机多孔材料）交联法（双功能试剂）交联法（双功能试剂）包埋法（微胶囊法）包埋法（微胶囊法）第十五页，讲稿共一百二十五页哦 指通过氢键、疏水作用、电子亲和力等物理作用，指通过氢键、疏水作用、电子亲和力等物理作用，将酶吸附到固体吸附剂表面的方法。将酶吸附到固体吸附剂表面的方法。优点：操作条件温和，固定化时酶分子的构象优点：操作条件温和，固定化时酶分子的构象较少或者不变化；载体廉价易得较少或者不变化；载体廉价易得缺点：结合力弱，易解吸附缺点：结合力弱，易解吸附选择载体的原则选择载体的原则 （1 1）要有巨大的比表面积）要有巨大的比表面积 （2 2）

11、要有活泼的表面要有活泼的表面 （3 3）便于装柱进行连续反应便于装柱进行连续反应。1.1.物理吸附法物理吸附法SMS:一种硅酸盐载体有机载体：纤维素、骨胶原、火棉胶有机载体：纤维素、骨胶原、火棉胶无机载体：氧化铅、皂土、白土、无机载体：氧化铅、皂土、白土、高岭土、多孔玻璃、高岭土、多孔玻璃、硅藻土、二氧化钛等硅藻土、二氧化钛等第十六页，讲稿共一百二十五页哦2.2.结合法结合法离子键结合法l是指通过离子键将酶结合到具有离子交换基团的非水溶性载体上的方是指通过离子键将酶结合到具有离子交换基团的非水溶性载体上的方法。法。l阴离子交换剂：阴离子交换剂：DEAE-DEAE-纤维素，纤维素，DEAE-DE

12、AE-葡聚糖凝胶，葡聚糖凝胶，Amberlite IRA-Amberlite IRA-9393，410410，900900；阳离子交换剂：阳离子交换剂：CM-CM-纤维素，纤维素，Amberlite CG-50Amberlite CG-50，IRC-50IRC-50，IR-120IR-120，Dowex-50Dowex-50等。等。第十七页，讲稿共一百二十五页哦l使用注意使用注意：pHpH、离子强度、温度、离子强度、温度l离子结合法的离子结合法的操作简单，处理条件温和操作简单，处理条件温和，酶的高级结，酶的高级结构和活性中心的氨基酸残基不易被破坏，能得到酶活回收构和活性中心的氨基酸残基不易被破

13、坏，能得到酶活回收率较高的固定化酶。率较高的固定化酶。l但是载体和酶的结合力比较弱，容易受缓冲液种类但是载体和酶的结合力比较弱，容易受缓冲液种类或或pHpH的影响，在的影响，在离子强度高的条件下进行反应时，离子强度高的条件下进行反应时，酶往往会从载体上脱落。酶往往会从载体上脱落。第十八页，讲稿共一百二十五页哦l这是酶与载体以共价键结合的固定化方法，是载这是酶与载体以共价键结合的固定化方法，是载体结合法中报道最多的方法。体结合法中报道最多的方法。l归纳起来有二类：归纳起来有二类：l将载体有关基团活化，然后与酶有关基团发生将载体有关基团活化，然后与酶有关基团发生偶联反应。偶联反应。l在载体上接上一

14、个双功能试剂，然后将酶偶联上去。在载体上接上一个双功能试剂，然后将酶偶联上去。(与交联法合用）与交联法合用）共价结合法共价结合法第十九页，讲稿共一百二十五页哦酶蛋白的侧链基团和载体表面上的功能基团之间形成共价酶蛋白的侧链基团和载体表面上的功能基团之间形成共价键而固定的方法。键而固定的方法。第二十页，讲稿共一百二十五页哦l可以形成共价键的基团：可以形成共价键的基团：游离氨基，游离氨基，游离羧基，游离羧基，巯基，巯基，咪唑基，咪唑基，酚基，酚基，羟基，羟基，甲硫基，甲硫基，吲哚基，二硫键吲哚基，二硫键l常用载体：天然高分子、人工合成的高聚物、无机载体常用载体：天然高分子、人工合成的高聚物、无机载体

15、第二十一页，讲稿共一百二十五页哦首先载体上引进活泼基团首先载体上引进活泼基团 然后活化该活泼基团然后活化该活泼基团 最后此活泼基团再与酶分子上某一基团形成共价键最后此活泼基团再与酶分子上某一基团形成共价键关键关键共价键结合法制备固定化酶的“通式”载体活化载体活化活化基团酶分子基团活化基团酶分子基团第二十二页，讲稿共一百二十五页哦酶分子和载体连接的功能基团：酶分子和载体连接的功能基团：l酶蛋白酶蛋白N-N-端的端的-氨基或赖氨酸残基的氨基氨基或赖氨酸残基的氨基l酶蛋白酶蛋白C-C-端的羧基以及端的羧基以及AspAsp残基的残基的-和和-羧基羧基lCysCys残基的巯基残基的巯基lSerSer、T

16、yrTyr、ThrThr残基的羟基残基的羟基lPhePhe、TyrTyr残基的苯环残基的苯环lHisHis残基的咪唑基残基的咪唑基lTrpTrp残基的吲哚基残基的吲哚基第二十三页，讲稿共一百二十五页哦第二十四页，讲稿共一百二十五页哦第二十五页，讲稿共一百二十五页哦lA A重氮法重氮法lB B叠氮法叠氮法lC C烷基化反应法烷基化反应法lD D硅烷化法硅烷化法lE E溴化氰法溴化氰法载体活化的方法载体活化的方法第二十六页，讲稿共一百二十五页哦共价结合法与离子结合法或物理吸附法相比：l优点：酶与载体结合牢固，一般不会因底物浓度高或优点：酶与载体结合牢固，一般不会因底物浓度高或存在盐类等原因而轻易脱

17、落。存在盐类等原因而轻易脱落。l缺点：缺点：l该方法反应条件苛刻，操作复杂；该方法反应条件苛刻，操作复杂；l由于采用了比较激烈的反应条件，会引起酶蛋白高级结由于采用了比较激烈的反应条件，会引起酶蛋白高级结构变化，因此往往不能得到比活高的固定化酶，酶活回构变化，因此往往不能得到比活高的固定化酶，酶活回收率一般为收率一般为3030左右，甚至底物的专一性等酶的性质也会左右，甚至底物的专一性等酶的性质也会发生变化。发生变化。l只能用于酶，不能用于微生物的固定化只能用于酶，不能用于微生物的固定化第二十七页，讲稿共一百二十五页哦3.3.交联法交联法是指通过双功能试剂，将酶和是指通过双功能试剂，将酶和酶联结

18、成网状结构的方法酶联结成网状结构的方法交联法使用的交联剂是戊二醛、己交联法使用的交联剂是戊二醛、己二胺、双偶氮苯等水溶性化合物。二胺、双偶氮苯等水溶性化合物。第二十八页，讲稿共一百二十五页哦戊二醛的两个醛基都可以与酶或者蛋白质的游离氨基酸反应，形成Schiff碱，从而使酶或者菌体蛋白交联，形成固定化酶或固定化菌体。第二十九页，讲稿共一百二十五页哦l例：采用天然高分子聚合物几丁质作载体，以戊二醛为交联剂，通过化学交联反应将纤维素酶固定在几丁质上，在戊二醛浓度1.25%，pH值4.0时固定纤维素酶，该固定化酶的半衰期为60天。用于降解壳聚糖，效果明显。第三十页，讲稿共一百二十五页哦l交联法反应条件

19、比较激烈，固定化的酶活回收率一交联法反应条件比较激烈，固定化的酶活回收率一般较低，但是尽可能降低交联剂浓度和缩短反应时般较低，但是尽可能降低交联剂浓度和缩短反应时间将有利于固定化酶比活的提高。间将有利于固定化酶比活的提高。l单独使用交联法所得到的固定化酶颗粒小、机械性单独使用交联法所得到的固定化酶颗粒小、机械性能差，酶活低，故常与其他方法联用能差，酶活低，故常与其他方法联用第三十一页，讲稿共一百二十五页哦酶分子之间共价交联和与水不溶性载体共价偶联酶分子之间共价交联和与水不溶性载体共价偶联 酶分子酶分子:（a a）酶分子之间用双功能基团的化学交联试剂相互交联成水不溶性的固定化酶）酶分子之间用双功

20、能基团的化学交联试剂相互交联成水不溶性的固定化酶（b b）酶分子被偶联到水不溶性载体上形成水不溶性的固定化酶）酶分子被偶联到水不溶性载体上形成水不溶性的固定化酶第三十二页，讲稿共一百二十五页哦4.4.包埋法包埋法是指将酶或含酶微生物包裹在多孔的载体中。是指将酶或含酶微生物包裹在多孔的载体中。网格型网格型；微囊型微囊型。第三十三页，讲稿共一百二十五页哦网格法网格法将酶分子或微生物包埋在凝胶格子里。将酶分子或微生物包埋在凝胶格子里。天然凝胶：琼脂凝胶、海藻酸钙凝胶、角叉菜胶、明胶等天然凝胶：琼脂凝胶、海藻酸钙凝胶、角叉菜胶、明胶等合成材料：聚丙烯酰胺、聚乙烯醇和光敏树脂等。合成材料：聚丙烯酰胺、聚

21、乙烯醇和光敏树脂等。网格型包埋法是固定化微生物中用得最多、最有效的方法。网格型包埋法是固定化微生物中用得最多、最有效的方法。第三十四页，讲稿共一百二十五页哦第三十五页，讲稿共一百二十五页哦微囊型半透膜包埋法（微囊化法）：半透膜包埋法（微囊化法）：将酶包埋在有各种高分子聚合物制成的小囊中，制成将酶包埋在有各种高分子聚合物制成的小囊中，制成固定化酶。固定化酶。半透膜：聚酰胺膜、火棉胶膜等半透膜：聚酰胺膜、火棉胶膜等第三十六页，讲稿共一百二十五页哦l微囊型固定化酶通常直径微囊型固定化酶通常直径为几微米到几百微米的球为几微米到几百微米的球状体，颗粒比网格型要小状体，颗粒比网格型要小得多，比较有利于底物

22、和得多，比较有利于底物和产物扩散，但是反应条件产物扩散，但是反应条件要求高，制备成本也高。要求高，制备成本也高。微囊发生器微囊发生器第三十七页，讲稿共一百二十五页哦第三十八页，讲稿共一百二十五页哦酶的固定化模式酶的固定化模式第三十九页，讲稿共一百二十五页哦各类固定化方法的特点比较:比较项目比较项目吸附法吸附法结合法结合法 交联法交联法包埋法包埋法物理吸附物理吸附.共价键结合共价键结合离子键结合离子键结合 制备难易制备难易易易难难易易 较难较难较难较难固定化程度固定化程度弱弱强强中等中等 强强强强活力回收率活力回收率较高较高低低高高 中等中等高高载体再生载体再生可能可能不可能不可能可能可能 不可

23、能不可能不可能不可能费用费用低低高高低低 中等中等低低底物专一性底物专一性不变不变可变可变不变不变 可变可变不变不变适用性适用性酶源多酶源多较广较广广泛广泛 较广较广小分子底小分子底物、药用物、药用酶酶第四十页，讲稿共一百二十五页哦其他固定化酶方法l结晶法：结晶法：l分散法：分散法：l热处理法热处理法l等等等等第四十二页，讲稿共一百二十五页哦判断固定化方法的优劣及其固定化酶的实用性的指标有判断固定化方法的优劣及其固定化酶的实用性的指标有:(1)(1)相对酶活力相对酶活力l具有相同酶蛋白量的固定化酶与游离酶活力的比值具有相同酶蛋白量的固定化酶与游离酶活力的比值l通常高于通常高于75%75%(2)

24、(2)酶的活力回收率酶的活力回收率l固定化酶的总活力与用于固定化的酶的活力之百分比称为酶的活力回收率。固定化酶的总活力与用于固定化的酶的活力之百分比称为酶的活力回收率。l一般情况下一般情况下,活力回收率应小于活力回收率应小于1,1,若大于若大于1,1,可能由于固定化活细胞增殖或某可能由于固定化活细胞增殖或某些抑制因素排除的结果些抑制因素排除的结果.(3)(3)固定化酶的半衰期固定化酶的半衰期 衡量操作稳定性的关键衡量操作稳定性的关键.第四十三页，讲稿共一百二十五页哦固定化酶的过程中还存在几个亟待解决解决的难题固定化酶的过程中还存在几个亟待解决解决的难题固定化酶的过程中还存在几个亟待解决解决的难

25、题固定化酶的过程中还存在几个亟待解决解决的难题 ：l酶的活性中心发生物理化学变化导致酶活力降低酶的活性中心发生物理化学变化导致酶活力降低l酶固定化后多了空间屏障酶固定化后多了空间屏障,增加了传质阻增加了传质阻力力l酶和载体结合不牢固酶和载体结合不牢固,容易脱落容易脱落,酶活力损失大酶活力损失大l固定化颗粒成型困难固定化颗粒成型困难 第四十四页，讲稿共一百二十五页哦固定化技术的改进固定化技术的改进l定点固定化技术定点固定化技术 l抗体偶联、生物素亲和素亲和、氨基酸置换（抗体偶联、生物素亲和素亲和、氨基酸置换（CysCys）l多酶系统的共固定化多酶系统的共固定化l多种酶同时固定在膜材料上多种酶同时

26、固定在膜材料上,利用各自的功能协同催化复杂的生物转化利用各自的功能协同催化复杂的生物转化过程过程l新型的固定化技术新型的固定化技术l高分子技术、纳米技术、光、辐射等作用高分子技术、纳米技术、光、辐射等作用 l加入表面活性剂加入表面活性剂 l可使酶活性大幅度提高，最高的达可使酶活性大幅度提高，最高的达100100倍，并增加了酶使用次数倍，并增加了酶使用次数l等等等等第四十五页，讲稿共一百二十五页哦固定化对反应系统的影响l不同制备方法，对酶反应系统产生的影响不同不同制备方法，对酶反应系统产生的影响不同l假定：假定：l酶固定化后，在载体表面或多孔介质中的分布完酶固定化后，在载体表面或多孔介质中的分布

27、完全均质全均质l整个系统各相同性整个系统各相同性四、固定化酶性质的变化：四、固定化酶性质的变化：第四十六页，讲稿共一百二十五页哦(一）影响固定化酶性能的因素一）影响固定化酶性能的因素l固定化酶制备物的性质取决于所用的酶及固定化酶制备物的性质取决于所用的酶及载体材料的性质及相互作用。载体材料的性质及相互作用。第四十七页，讲稿共一百二十五页哦成分成分参数参数酶酶生物化学性质：生物化学性质：分子量，辅基，蛋白质表面的功能基团，纯度（杂质的失活或保护作用）分子量，辅基，蛋白质表面的功能基团，纯度（杂质的失活或保护作用）动力学参数：动力学参数：专一性，专一性，pHpH及温度曲线，活性及抑制性的动力学参数

28、，对及温度曲线，活性及抑制性的动力学参数，对pHpH，温度，溶剂，去污剂及杂质，温度，溶剂，去污剂及杂质的稳定性的稳定性。载体载体化学特征：化学特征：化学组成，功能基，膨胀行为，基质的可及体积，微孔大小及载体的化学稳定性化学组成，功能基，膨胀行为，基质的可及体积，微孔大小及载体的化学稳定性 机械性质：机械性质：颗粒直径，单颗粒压缩行为，流动抗性（固定床反应器），沉降速率（流体床），对搅拌颗粒直径，单颗粒压缩行为，流动抗性（固定床反应器），沉降速率（流体床），对搅拌罐的磨损。罐的磨损。固定固定化酶化酶固定化方法：固定化方法：所结合的蛋白所结合的蛋白,活性酶的产量活性酶的产量,内在的动力学参数内在

29、的动力学参数质量转移效应质量转移效应:分配效应（催化剂颗粒内外不同的溶质浓度），外部或内部（微孔）扩散效应；这些给出分配效应（催化剂颗粒内外不同的溶质浓度），外部或内部（微孔）扩散效应；这些给出了游离酶在合适反应条件下的效率。了游离酶在合适反应条件下的效率。稳定性稳定性:操作稳定性操作稳定性(表示为工作条件下的活性降低表示为工作条件下的活性降低)，贮藏稳定性，贮藏稳定性效能效能:生产力（产品量生产力（产品量/单位活性或酶量），酶的消耗（酶单位数单位活性或酶量），酶的消耗（酶单位数/公斤产品）公斤产品）第四十八页，讲稿共一百二十五页哦包括：l酶本身的变化酶本身的变化:主要由于活性中心的氨基酸残基

30、、高级结构和电荷状态主要由于活性中心的氨基酸残基、高级结构和电荷状态等发生变化等发生变化;l载体的影响载体的影响：在固定化酶的周围，形成了能对底物产生立体影响的扩散层以及在固定化酶的周围，形成了能对底物产生立体影响的扩散层以及静电的相互作用等引起的变化。静电的相互作用等引起的变化。l载体与酶的相互作用：载体与酶的相互作用：载体与酶的直接作用可能表现为活力丧失、破坏酶结构、载体与酶的直接作用可能表现为活力丧失、破坏酶结构、封闭酶活性部位等。封闭酶活性部位等。第四十九页，讲稿共一百二十五页哦改变之一：构象改变、立体屏蔽l构象改变：构象改变：酶分子构象发生某种扭曲，导致酶与底酶分子构象发生某种扭曲，

31、导致酶与底物结合能力或催化能力下降物结合能力或催化能力下降l立体屏蔽：立体屏蔽：固定化后，使得酶的活性中心或调节部固定化后，使得酶的活性中心或调节部位造成某种空间障碍，使得效应物或者底物位造成某种空间障碍，使得效应物或者底物与酶的临近或者接触受到干扰与酶的临近或者接触受到干扰第五十页，讲稿共一百二十五页哦改变之二：分配效应、扩散限制l微环境：微环境：微环境微环境是指在固定化酶附近的局是指在固定化酶附近的局部环境，而把主体溶液称为部环境，而把主体溶液称为宏观环宏观环境境。l分配效应：分配效应：由于载体性质，造成底物和效应由于载体性质，造成底物和效应物等在微观体系和宏观体系之间物等在微观体系和宏观

32、体系之间的不等性分配，从而影响酶促反的不等性分配，从而影响酶促反应速度应速度第五十一页，讲稿共一百二十五页哦l扩散限制效应：底物、产物和效应物等，在环扩散限制效应：底物、产物和效应物等，在环境中的迁移运转速度收到限制境中的迁移运转速度收到限制DEAE 纤维素固定化壳聚糖酶纤维素固定化壳聚糖酶:以以DEAE DEAE 纤维素为载体戊二醛为交联剂固定壳纤维素为载体戊二醛为交联剂固定壳聚糖酶聚糖酶第五十二页，讲稿共一百二十五页哦改变之三：微扰l由于载体的亲水、疏水作用和介质的介电常数等性由于载体的亲水、疏水作用和介质的介电常数等性质质,直接影响酶的催化能力或酶对效应物作出反应直接影响酶的催化能力或酶

33、对效应物作出反应的能力的能力第五十三页，讲稿共一百二十五页哦1.1.固定化后酶活力的变化固定化后酶活力的变化l固定化酶的活力在固定化酶的活力在多数情况多数情况下比天然酶小，其专一性也能发生改变。下比天然酶小，其专一性也能发生改变。l例如：例如：用羧甲基纤维素载体固定的胰蛋白酶消化不同底物：用羧甲基纤维素载体固定的胰蛋白酶消化不同底物：酪蛋白（酪蛋白（高分子）原酶活力的高分子）原酶活力的3030%苯酞精氨酸苯酞精氨酸-对硝基酰替苯胺对硝基酰替苯胺(低分子低分子)原酶活力的原酶活力的8080%。一般认为高分子底物受到一般认为高分子底物受到空间位阻的影响空间位阻的影响比低分子底比低分子底物大。物大。

34、第五十四页，讲稿共一百二十五页哦l原因：原因：酶结构的变化酶结构的变化 空间位阻空间位阻l不过，也有个别情况，酶在固定化后反而不过，也有个别情况，酶在固定化后反而比原酶活力提高，原因可能是偶联过程中比原酶活力提高，原因可能是偶联过程中酶得到化学修饰，或固定化过程提高了酶酶得到化学修饰，或固定化过程提高了酶的稳定性。的稳定性。第五十五页，讲稿共一百二十五页哦lMerloseMerlose曾选择曾选择5050种固定化酶，就其稳定性与固定化前的酶进行比种固定化酶，就其稳定性与固定化前的酶进行比较，发现：较，发现：l3030种酶稳定性提高，种酶稳定性提高，l1212种酶无变化，种酶无变化，l8 8种酶

35、稳定性降低。种酶稳定性降低。l然而，由于目前尚未找到固定化方法与稳定性之间规律性，因此要然而，由于目前尚未找到固定化方法与稳定性之间规律性，因此要预测怎样才能提高稳定性还有一定困难，但预测怎样才能提高稳定性还有一定困难，但大多数情况下酶经过固大多数情况下酶经过固定化后稳定性提高了定化后稳定性提高了。2.2.固定化对酶稳定性的影响固定化对酶稳定性的影响第五十七页，讲稿共一百二十五页哦固定化后酶稳定性提高的原因固定化后酶稳定性提高的原因l可能有以下几点：可能有以下几点：l固定化后酶分子与载体多点连接，可防止酶固定化后酶分子与载体多点连接，可防止酶分子伸展变形。分子伸展变形。l酶活力的缓慢释放。酶活

36、力的缓慢释放。l抑制酶的自降解。将酶与固态载体结合后，抑制酶的自降解。将酶与固态载体结合后，由于酶失去了分子间相互作用的机会，从而抑由于酶失去了分子间相互作用的机会，从而抑制了降解制了降解第五十八页，讲稿共一百二十五页哦v固定化青霉素酰化酶固定化青霉素酰化酶v将酶于将酶于0.05 mol0.05 molL L的的PBSPBS（pH 7.5pH 7.5）中分别在不同）中分别在不同温度下保温温度下保温6 6小时，冷却后小时，冷却后测定酶活力。测定酶活力。v固定化酶的热稳定性优于固定化酶的热稳定性优于自然酶自然酶。固定化酶的稳定性变化固定化酶的稳定性变化1.1.固定化酶；固定化酶；2.2.自然酶自然

37、酶a.a.热稳定性提高热稳定性提高第五十九页，讲稿共一百二十五页哦l测试结果测试结果:5:5天后其活性仍可保留天后其活性仍可保留96%.96%.例例:将将DEAE 纤维素固定化壳聚糖酶纤维素固定化壳聚糖酶浸泡在浸泡在95%的的乙醇乙醇中，连续中，连续5天测其催化活性天测其催化活性 b.b.对有机试剂及酶抑制剂的稳定性提高对有机试剂及酶抑制剂的稳定性提高第六十页，讲稿共一百二十五页哦l提高固定化酶对各种有机溶剂的稳定性，使本来不提高固定化酶对各种有机溶剂的稳定性，使本来不能在有机溶剂中进行的酶反应成为可能。能在有机溶剂中进行的酶反应成为可能。l提高酶对某些抑制剂的稳定性提高酶对某些抑制剂的稳定性

38、l可以预计，今后固定化酶在有机合成中应用会进一可以预计，今后固定化酶在有机合成中应用会进一步发展。步发展。第六十一页，讲稿共一百二十五页哦c.c.对对pHpH的稳定性提高的稳定性提高l青霉素酰化酶在不同青霉素酰化酶在不同pHpH值值的缓冲液中，于的缓冲液中，于37 37 保保温温16 h16 h测定酶活力。测定酶活力。l固定化酶在固定化酶在pH 5.5-pH 5.5-10.310.3活力稳定；活力稳定；l游离酶则仅在游离酶则仅在 pH pH 7.0-9.07.0-9.0稳定。稳定。l固定化酶的固定化酶的pHpH稳定性明显稳定性明显优于游离酶。优于游离酶。第六十二页，讲稿共一百二十五页哦d.d.

39、对蛋白质水解酶的抗性对蛋白质水解酶的抗性 固定化后载体与酶的紧密连接对其起一定保护作用固定化后载体与酶的紧密连接对其起一定保护作用,并在空间上阻碍酶与大分子物质接近并在空间上阻碍酶与大分子物质接近,从而降低了酶与从而降低了酶与大分子物质结合的几率大分子物质结合的几率,防止酶被其他蛋白酶水解防止酶被其他蛋白酶水解.第六十三页，讲稿共一百二十五页哦此外：此外：l有些固定化酶经过贮藏，可以提高其活性。有些固定化酶经过贮藏，可以提高其活性。大多数酶经固定化后提高了贮藏的稳定性，如固定化木瓜蛋白酶（琼脂）在4下，120天酶活力无变化。第六十四页，讲稿共一百二十五页哦对操作稳定性都有影响对操作稳定性都有影

40、响第六十五页，讲稿共一百二十五页哦 如图：固定化酶的最适温如图：固定化酶的最适温度为度为60C 60C，而游离酶的最，而游离酶的最适温度为适温度为50C 50C 而固定化酶而固定化酶在在50-65C 50-65C 范围内都保持了范围内都保持了较高的酶活力较高的酶活力,这说明壳聚酶经这说明壳聚酶经固定化后其在较高温度下的适固定化后其在较高温度下的适应范围有了明显提高应范围有了明显提高3.3.固定化酶的最适温度的变化固定化酶的最适温度的变化固定化后，酶的热稳定性提高，所以固定化后，酶的热稳定性提高，所以固定化酶的最适温度提高固定化酶的最适温度提高当然，也有报道最适温度不变或下降的。当然，也有报道最

41、适温度不变或下降的。第六十六页，讲稿共一百二十五页哦4.4.最适最适pHpH值的变化值的变化l酶的催化能力对外部环境特别是酶的催化能力对外部环境特别是pHpH非常敏感。非常敏感。l酶固定化后，对底物作用的最适酶固定化后，对底物作用的最适pHpH和和pH-pH-活性曲活性曲线常常发生偏移。线常常发生偏移。第六十七页，讲稿共一百二十五页哦pH对固定化酶的影响l1 1）载体带负电荷，载体带负电荷，pHpH向碱性方向移动。向碱性方向移动。载体带正电荷，载体带正电荷，pHpH向酸性方向移动。向酸性方向移动。（2 2）产物性质对体系）产物性质对体系pHpH的影响的影响l催化反应的产物为酸性时，固定化酶的最

42、适催化反应的产物为酸性时，固定化酶的最适pHpH比比游离酶的最适游离酶的最适pHpH值；反之则低值；反之则低第六十八页，讲稿共一百二十五页哦l例例:取取0.2g DEAE 0.2g DEAE 纤维素固定化壳聚糖酶与纤维素固定化壳聚糖酶与5mL5mL壳聚壳聚糖酶液各糖酶液各8 8份分别于不同份分别于不同pHpH下测定固定化酶和游离下测定固定化酶和游离酶的活力酶的活力可见：固定化酶的最适可见：固定化酶的最适pH pH 向酸性偏移向酸性偏移第六十九页，讲稿共一百二十五页哦l例：取例：取0.15g0.15g固定化黄曲霉固定化黄曲霉毒素解毒酶毒素解毒酶 和和4ML4ML黄曲霉黄曲霉毒素解毒酶毒素解毒酶

43、液各液各8 8份，分份，分别于不同别于不同pHpH下测定固定化下测定固定化酶和游离酶的活力酶和游离酶的活力 可见：固定化酶的最适可见：固定化酶的最适pH pH 向碱性偏移向碱性偏移第七十页，讲稿共一百二十五页哦l影响固定化酶影响固定化酶K Km m的因素：的因素：1.1.酶的空间立体障碍酶的空间立体障碍l载体为电中性时，由于载体为电中性时，由于扩散限制扩散限制造成表观造成表观KmKm上升。上升。2.2.电荷效应电荷效应l（1 1）载体与底物带相同电荷，载体与底物带相同电荷，KmKmKmKml（2 2）载体与底物电荷相反，静电作用，载体与底物电荷相反，静电作用，KmKmKmKm 3.3.溶液的离

44、子强度溶液的离子强度5.5.固定化酶的米氏常数（固定化酶的米氏常数（KmKm）变化）变化 第七十一页，讲稿共一百二十五页哦l例：取例：取DEAE DEAE 纤维素固定化纤维素固定化壳聚糖酶壳聚糖酶0.2g 0.2g 与与1%1%壳聚糖壳聚糖酶液酶液5mL 5mL 各各6 6 份分别加入份分别加入2mL 2mL 不同浓度的不同浓度的壳聚糖溶壳聚糖溶液液(0.4%1.5%)(0.4%1.5%)于于50C 50C 水水浴中保温浴中保温60min 60min 测定还原测定还原糖浓度，用双倒数作图求糖浓度，用双倒数作图求得米氏常数得米氏常数如图如图 ：经线性拟合可求得：经线性拟合可求得K Km(m(固固

45、)=18.87g/L)=18.87g/LK Km(m(游游)=2.49g/L)=2.49g/L 第七十二页，讲稿共一百二十五页哦五、评价固定化酶的指标l一般评价：一般评价：l1 1 酶活定义（酶活定义（IU)IU)：在特定条件下，每一分钟：在特定条件下，每一分钟催化一个微摩尔底物转化为产物的酶量定义为催化一个微摩尔底物转化为产物的酶量定义为1 1个酶活单位。个酶活单位。l2.2.酶比活定义（游离）：每毫克所具有的酶活酶比活定义（游离）：每毫克所具有的酶活力单位力单位第七十四页，讲稿共一百二十五页哦固定化酶l1.1.固定化酶的比活：每（克）干固定化酶所具有固定化酶的比活：每（克）干固定化酶所具有

46、的酶活力单位。的酶活力单位。l或：单位面积（或：单位面积（cmcm2 2）的酶活力单位表示（酶膜、）的酶活力单位表示（酶膜、酶管、酶板）。酶管、酶板）。l2.2.操作半衰期：衡量稳定性的指标。操作半衰期：衡量稳定性的指标。l 连续测活条件下固定化酶活力下降为最初活力连续测活条件下固定化酶活力下降为最初活力一半所需要的时间（一半所需要的时间（t t1/21/2）第七十五页，讲稿共一百二十五页哦3.3.偶联效率以载体结合酶量偶联效率以载体结合酶量(或酶活力或酶活力)的百分数表示：的百分数表示：由于在偶联反应中酶往往会有些失活，因此，测定由于在偶联反应中酶往往会有些失活，因此，测定残留活力还不能正确

47、反映与载体结合的酶活力，所残留活力还不能正确反映与载体结合的酶活力，所以，仍以测定蛋白量较为难确。以，仍以测定蛋白量较为难确。第七十六页，讲稿共一百二十五页哦l4.活力回收 酶固定化般比溶液酶的活力下降，固定化酶活力占溶液酶活力的百分数称为活力回收率。5.相对酶活力：具有相同酶蛋白量的固定化酶活力与游离酶活力的比值称为相对酶活力第七十七页，讲稿共一百二十五页哦六、固定化细胞六、固定化细胞利用胞内酶制作固定化酶时，需要破碎细胞，然利用胞内酶制作固定化酶时，需要破碎细胞，然后提取酶，这就增加了工序和成本。后提取酶，这就增加了工序和成本。科学家设想直接固定含所需胞内酶的细胞科学家设想直接固定含所需胞

48、内酶的细胞固定化细胞与固定化酶比较，其固定化细胞与固定化酶比较，其优越性优越性在于：在于：保持了胞内酶系的原始状态与天然环境保持了胞内酶系的原始状态与天然环境，因而更稳定。，因而更稳定。保持了胞内原有的多酶系统，而且无需辅酶再生保持了胞内原有的多酶系统，而且无需辅酶再生。第七十八页，讲稿共一百二十五页哦2020世纪世纪7070年代，科学家研制成固定化细胞，并且用于年代，科学家研制成固定化细胞，并且用于生产。生产。例如，将酵母菌细胞吸附到多孔塑料的表面上或包例如，将酵母菌细胞吸附到多孔塑料的表面上或包埋在琼脂中，制成的固定化酵母菌细胞，可以用于埋在琼脂中，制成的固定化酵母菌细胞，可以用于酒类的发

49、酵生产酒类的发酵生产固定化增殖细胞固定化增殖细胞发酵发酵更具有显著优越性更具有显著优越性 第七十九页，讲稿共一百二十五页哦固定化细胞分类、形态特征和生理状态固定化细胞分类、形态特征和生理状态 ：分类方式分类方式固定化细胞类型固定化细胞类型细胞类型细胞类型微生物、植微生物、植 物、动物、动 物物生理状态生理状态死细胞：完整细胞，细胞碎片，细胞器死细胞：完整细胞，细胞碎片，细胞器活细胞：增殖细胞，静止细胞，饥饿细胞活细胞：增殖细胞，静止细胞，饥饿细胞第八十页，讲稿共一百二十五页哦形态特征：l固定化细胞由于其用途和制备方法的不同，可以是颗粒固定化细胞由于其用途和制备方法的不同，可以是颗粒状、块状、条

50、状、薄膜状或不规则状（与吸附物形状相状、块状、条状、薄膜状或不规则状（与吸附物形状相同）等，同）等，l目前大多数制备成颗粒状珠体，这是因为：目前大多数制备成颗粒状珠体，这是因为：l不规则形状的固定化细胞易磨损，在反应器内尤其是不规则形状的固定化细胞易磨损，在反应器内尤其是柱反应器内易受压变形，流速不好，柱反应器内易受压变形，流速不好，l圆形珠体由于其表面积最大，与底物接触面较大，所圆形珠体由于其表面积最大，与底物接触面较大，所以生产效率相对较高。以生产效率相对较高。第八十一页，讲稿共一百二十五页哦l细胞被固定在载体内在形态学上一般没有明显的变化。细胞被固定在载体内在形态学上一般没有明显的变化。