引物设计初学者.ppt

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1、引物设计初学者现在学习的是第1页,共45页主要内容主要内容n n背景n nPCR引物设计原则n n常用PCR引物设计软件n nPrimer Premier 5.0 介绍n nOligo 6.22 介绍n n在线Primer3 介绍现在学习的是第2页,共45页PCR聚合酶链反应聚合酶链反应(Polymerase Chain Reaction,PCR)(Polymerase Chain Reaction,PCR)是是8080年代中期发展起来的体外核酸扩增技术。年代中期发展起来的体外核酸扩增技术。它具有特异、敏感、产率高、快速、简便、重它具有特异、敏感、产率高、快速、简便、重复性好、易自动化等突出优

2、点;能在一个试管复性好、易自动化等突出优点;能在一个试管内将所要研究的目的基因或某一内将所要研究的目的基因或某一DNADNA片段于数小片段于数小时内扩增至十万乃至百万倍时内扩增至十万乃至百万倍,使肉眼能直接观察和使肉眼能直接观察和判断;可从一根毛发、一滴血、甚至一个细胞判断;可从一根毛发、一滴血、甚至一个细胞中扩增出足量的中扩增出足量的DNADNA供分析研究和检测鉴定。供分析研究和检测鉴定。现在学习的是第3页,共45页PCR引物设计引物设计n n引物设计是PCR 技术中至关重要的一环。使用不合适的PCR 引物容易导致实验失败:表现为扩增出目的带之外的多条带(如形成引物二聚体带),不出带或出带很

3、弱,等等。现在PCR 引物设计大都通过计算机软件进行。可以直接提交模板序列到特定网页,得到设计好的引物,也可以在本地计算机上运行引物设计专业软件。现在学习的是第4页,共45页引物设计的原则引物设计的原则n n引物与模板的序列要紧密互补n n引物与引物之间避免形成稳定的二聚体或发夹结构n n引物不能在模板的非目的位点引发DNA 聚合反应(即错配)。现在学习的是第5页,共45页n n如引物长度(如引物长度(primer lengthprimer length),产物长度),产物长度(product lengthproduct length),序列),序列Tm Tm 值值(melting(melti

4、ng temperature)temperature),引物与模板形成双链的内部稳,引物与模板形成双链的内部稳定性定性(internal stability,(internal stability,用用 G G 值反映值反映),形成引物二聚体形成引物二聚体(primer dimer)(primer dimer)及发夹结构及发夹结构(duplex formation and hairpinduplex formation and hairpin)的能值,)的能值,在错配位点(在错配位点(false priming sitefalse priming site)的引发效率,)的引发效率,引物及产物

5、的引物及产物的GC GC 含量(含量(compositioncomposition),等等。),等等。必要时还需对引物进行修饰,如增加限制性内必要时还需对引物进行修饰,如增加限制性内切酶位点,引进突变等。切酶位点,引进突变等。具体因素具体因素现在学习的是第6页,共45页一般原则一般原则n n引物的长度一般为引物的长度一般为15-30 bp15-30 bp,常用的是,常用的是18-24 bp18-24 bp,但,但不应大于不应大于3838。n n引物过短又同时会引起错配现象,一般来说引物长度大引物过短又同时会引起错配现象,一般来说引物长度大于于16bp16bp是必要的(不容易引起错配)。是必要的

6、(不容易引起错配)。n n例如:一个长度为例如:一个长度为12bp12bp的引物在人类基因组上存在的引物在人类基因组上存在200200个潜在的退火位点个潜在的退火位点(3 x 10(3 x 109 9/4/41212=200).=200).而一个长度为而一个长度为20bp20bp的引物在人基因组上存在的退火位点只有的引物在人基因组上存在的退火位点只有1/4001/400个个.n n较长的引物(较长的引物(28-35bp)28-35bp)n n一般是用来区分同源性较高的模板序列或者使用于一般是用来区分同源性较高的模板序列或者使用于产生一些突变位点产生一些突变位点现在学习的是第7页,共45页n n

7、Tm值的计算n n一般的公式n nTm=4(G+C)+2(A+T)n n对于长一些的引物可用更为准确的n nnearest-neighbor(Frier et al.(1986))现在学习的是第8页,共45页一般原则一般原则2.引物序列在模板内应当没有相似性较高,尤其是3端相似性较高的序列,否则容易导致错配。引物3端出现3 个以上的连续碱基,如GGG 或CCC,也会使错误引发机率增加。现在学习的是第9页,共45页一般原则一般原则3,引物3端的末位碱基对Taq 酶的DNA 合成效率有较大的影响。不同的末位碱基在错配位置导致不同的扩增效率,末位碱基为A 的错配效率明显高于其他3 个碱基,因此应当避

8、免在引物的3端使用碱基A。另外,引物二聚体或发夹结构也可能导致PCR 反应失败。5端序列对PCR 影响不太大,因此常用来引进修饰位点或标记物。现在学习的是第10页,共45页一般原则一般原则4.引物序列的GC 含量一般为40-60%,过高或过低都不利于引发反应。上下游引物的GC含量不能相差太大。不同的算法推荐45-55%或50-60%现在学习的是第11页,共45页一般原则一般原则5.G 值是指DNA 双链形成所需的自由能,该值反映了双链结构内部碱基对的相对稳定性。应当选用3端G 值较低(绝对值不超过9),而5端和中间G 值相对较高的引物。引物的3端的G 值过高,容易在错配位点形成双链结构并引发D

9、NA 聚合反应。(能值越高越容易结合)现在学习的是第12页,共45页一般原则一般原则6.对引物的修饰一般是在5端增加酶切位点,应根据下一步实验中要插入PCR 产物的载体的相应序列而确定。现在学习的是第13页,共45页一般原则一般原则7.引物二级结构对PCR反应的影响。尽可能少的引物二聚体。现在学习的是第14页,共45页常用的引物设计软件常用的引物设计软件n nOligo 6(引物评价)*n nPrimer Premier(自动搜索)*n nVector NTI Suitn nDnasisn nOmigan nDnastarn nPrimer3 (在线服务)*现在学习的是第15页,共45页Pri

10、mer Premier 5.0 Primer Premier 5.0 的使的使用技巧简介用技巧简介主要功能:1、即引物设计2、限制性内切酶位点分析3、DNA 基元(motif)查找4、同源性分析现在学习的是第16页,共45页简并引物设计简并引物设计n n根据氨基酸序列来设计引物DNA引物Premier Primer 5提供了8种生物遗传密码使用的偏好选择1 1、纤毛虫大核(、纤毛虫大核(Ciliate MacronuclearCiliate Macronuclear)2 2、无脊椎动物线粒体(、无脊椎动物线粒体(Invertebrate MitochondrionInvertebrate Mi

11、tochondrion)3 3、支原体(、支原体(MycoplasmaMycoplasma)4 4、植物线粒体(、植物线粒体(Plant MitochondrionPlant Mitochondrion)5 5、原生动物线粒体(、原生动物线粒体(Protozoan MitochondrionProtozoan Mitochondrion)6 6、一般标准(、一般标准(StandardStandard)7 7、脊椎动物线粒体(、脊椎动物线粒体(Vertebrate MitochondrionVertebrate Mitochondrion)8 8、酵母线粒体(、酵母线粒体(Yeast Mitoc

12、hondrionYeast Mitochondrion)现在学习的是第17页,共45页Primer Premier 5.0Primer Premier 5.0使用介绍使用介绍(1)(1)Preimer Premier 启动界面Load sequenceLoad sequence现在学习的是第18页,共45页基本信息基本信息Sequence nameOriginal sequenceUse these two button to translate the DNA seq to a protein seq or a protein seq to a DAN seq 8种密码子偏好Choose a

13、 function 现在学习的是第19页,共45页引物设计界面引物设计界面First you can design the primer manuallySense strand or anti-sense strandUseful information of the primer现在学习的是第20页,共45页引物搜索选项设定引物搜索选项设定引物类型搜索模式5引物位置范围3引物位置范围产物大小范围引物长度现在学习的是第21页,共45页搜索结果搜索结果28对引物引物分值100分为满分每对引物的信息双击选中一对引物现在学习的是第22页,共45页引物信息引物信息回到主窗口引物及产物信息是否出现ha

14、irpin,dimer,false priming and cross dimer现在学习的是第23页,共45页一对理想的引物应当不存在任何一种上述结构,因此最好的情况是最下面的分析栏没有But 现在学习的是第24页,共45页引物编辑引物编辑现在学习的是第25页,共45页引物编辑引物编辑Edit primer hereAnalysis the edit resultAccept the edit result Return to the main window现在学习的是第26页,共45页Some other useful function of PP5现在学习的是第27页,共45页Enzym

15、e现在学习的是第28页,共45页Melting temperature graphPer 25-mer现在学习的是第29页,共45页GC%graphPer 25-mer现在学习的是第30页,共45页Stability Per 5-mer现在学习的是第31页,共45页Oligo 6.44 Oligo 6.44 使用说明使用说明主要功能:专门的引物设计软件现在学习的是第32页,共45页Oligo 6.44 启动界面启动界面Open sequence file现在学习的是第33页,共45页3个弹出窗口个弹出窗口Melting temperatureMelting temperature现在学习的是第

16、34页,共45页G Internal Stability现在学习的是第35页,共45页Frq为邻近6至7 个碱基组成的亚单位在一个指定数据库文件中的出现频率。该频率高则可增加错误引发的可能性。现在学习的是第36页,共45页用用Oligo 设计引物时的设计引物时的3个标准个标准n nTm 值曲线以选取5到3的下降形状有利于引物引发聚合反应。n nFrq 曲线宜选用3端Frq 值相对较低的片段。n nG 值在5端和中间值比较高,而在3端相对低现在学习的是第37页,共45页现在学习的是第38页,共45页选中引物选中引物上游引物下游引物只是示意图现在学习的是第39页,共45页引物分析引物分析n n首先

17、检查引物二聚体尤其是3端二聚体形成的可能性。现在学习的是第40页,共45页引物分析引物分析n n二项检查是发夹结构(hairpin);与二聚体相同,发夹结构的能值越低越好。现在学习的是第41页,共45页引物分析引物分析n n第三项检查为GC 含量,以45-55为宜。n n第四False priming 检查现在学习的是第42页,共45页引物分析引物分析Key information of primerHairpinDimer and cross DimerGC%Total PCR information现在学习的是第43页,共45页Final PCR information现在学习的是第44页,共45页Search for primer using Oligo 6.44Search primer现在学习的是第45页,共45页

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