基因制药基因工程制药讲稿.ppt

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1、基因制药基因工程制药第一页，讲稿共二十八页哦第一节第一节 概述概述第二节第二节 基因药物生产的基本过程基因药物生产的基本过程第三节第三节 目的基因的获得目的基因的获得第四节第四节 基因表达基因表达第五节第五节 基因工程菌的稳定性基因工程菌的稳定性第六节第六节 基因工程菌发酵基因工程菌发酵第七节第七节 基因工程药物的分离纯化基因工程药物的分离纯化第八节第八节 基因工程药物的质量控制基因工程药物的质量控制第二页，讲稿共二十八页哦第一节第一节 概概 述述生生物物技技术术的的核核心心就就是是基基因因工工程程，基基因因工工程程技技术术最最成成功的应用就是用于功的应用就是用于生物治疗生物治疗的新型生物药物

2、的研制。的新型生物药物的研制。传传统统生生物物药药物物由由于于来来源源及及制制备备上上的的困困难难、价价格格等等因因素素的的影影响响，此此外外在在制制备备过过程程可可能能受受到到的的病病毒毒、衣衣原原体体、支支原原体体等等的的感感染染等等问问题题，促促使使人人们们寻寻求求安安全全、实实用用、疗效可靠的新方法来制备生物药物。疗效可靠的新方法来制备生物药物。第三页，讲稿共二十八页哦基因工程正在逐渐显示其在生物技术药物制备上的优基因工程正在逐渐显示其在生物技术药物制备上的优势。势。应用基因工程技术可十分方便且有效地解决上述应用基因工程技术可十分方便且有效地解决上述提到的问题，从质和量上都可以得到改进

3、，而且提到的问题，从质和量上都可以得到改进，而且可以创造全新物质。可以创造全新物质。如今，癌症、病毒性疾病、心血管疾病以及内分泌等如今，癌症、病毒性疾病、心血管疾病以及内分泌等方面的预防、治疗和诊断已可通过基因工程技术获得方面的预防、治疗和诊断已可通过基因工程技术获得。第四页，讲稿共二十八页哦利用基因工程技术生产药品的优点：利用基因工程技术生产药品的优点：（1）可以大量生产过去难以获得的）可以大量生产过去难以获得的生理活性蛋白和多肽生理活性蛋白和多肽（如胰岛素、干扰素、细胞因子等），为临床使用提供（如胰岛素、干扰素、细胞因子等），为临床使用提供有效的保障；有效的保障；（2）可以提供足够数量的生

4、理活性物质，以便对其生理、）可以提供足够数量的生理活性物质，以便对其生理、生化和结构进行深入的研究，从而扩大这些物质的应用生化和结构进行深入的研究，从而扩大这些物质的应用范围；范围；（3）利用基因工程技术可以发现、挖掘更多的）利用基因工程技术可以发现、挖掘更多的内源性内源性生理生理活性物质；活性物质；第五页，讲稿共二十八页哦（4）内源性生理活性物质在作为药物使用时存在的不足之）内源性生理活性物质在作为药物使用时存在的不足之处，可通过处，可通过基因工程基因工程和和蛋白质工程蛋白质工程进行改造和去除。如进行改造和去除。如白白细胞介素细胞介素-2的第的第125位半胱氨酸是游离的，有可能引起位半胱氨酸

5、是游离的，有可能引起-S-S-键的错配而导致活性下降，如将此半胱氨酸改为丝氨酸或丙氨酸，键的错配而导致活性下降，如将此半胱氨酸改为丝氨酸或丙氨酸，白细胞介素白细胞介素-2的活性以及热稳定性均有提高；的活性以及热稳定性均有提高；（5）利用基因工程技术可获得新型化合物，扩大药物筛选）利用基因工程技术可获得新型化合物，扩大药物筛选来源。来源。基因工程技术可将不同种类和用途的基因，在基因工程技术可将不同种类和用途的基因，在原核细原核细胞胞中表达的特性使其不仅在医药，而且在很多行业中都会有重要中表达的特性使其不仅在医药，而且在很多行业中都会有重要的应用。的应用。第六页，讲稿共二十八页哦第二节第二节 基因

6、工程药物生产的基本过程基因工程药物生产的基本过程基基因因工工程程技技术术就就是是将将重重组组对对象象的的目目的的基基因因插插入入载载体体，拼拼接接后后转转入入新新的的宿宿主主细细胞胞，构构建建工工程程菌菌（或或细细胞胞），实实现现遗遗传传物物质质的的重重新组合，并使目的基因在工程菌内进行复制和表达的技术。新组合，并使目的基因在工程菌内进行复制和表达的技术。基基因因工工程程药药物物制制造造的的主主要要程程序序是是：目目的的基基因因的的克克隆隆，构构建建DNA重重组组体体，将将DNA重重组组体体转转入入宿宿主主菌菌构构建建工工程程菌菌，工工程程菌菌的的发发酵酵，外外源源基基因因表表达达产产物物的的

7、分分离离纯纯化化，产产品品的的检检验验等等。以以上上程程序序中中的的每每个个阶阶段段都都包包含含若若干干细细致致的的步步骤骤，这这些些程程序序和和步步骤骤将将会随研究和生产条件的不同而改变。会随研究和生产条件的不同而改变。第七页，讲稿共二十八页哦DNA重重组组技技术术第八页，讲稿共二十八页哦基因工程药物生产的上游和下游基因工程药物生产的上游和下游上上 游游：主要指的是目的基因分离、工程菌（或细：主要指的是目的基因分离、工程菌（或细胞）构建。上游阶段的工作主要在实验室内完成；胞）构建。上游阶段的工作主要在实验室内完成；（DNA重组技术重组技术）下下 游游：主要指的是从工程菌（或细胞）的大规模培：

8、主要指的是从工程菌（或细胞）的大规模培养一直到产品的分离纯化、质量控制等。养一直到产品的分离纯化、质量控制等。第九页，讲稿共二十八页哦工程菌（或细胞）构建中重要的工具工程菌（或细胞）构建中重要的工具该过程中重要的工具便是酶：该过程中重要的工具便是酶：限制性内切酶限制性内切酶和和连接酶连接酶是将所需是将所需目的基因插入适当的载体质粒或噬菌体中并转入目的基因插入适当的载体质粒或噬菌体中并转入E.coli 或其它宿主或其它宿主菌（细胞）大量复制目的基因过程中的重要工具。菌（细胞）大量复制目的基因过程中的重要工具。同时为保证目的基因的正确性，对目的基因要进行限制性内切同时为保证目的基因的正确性，对目的

9、基因要进行限制性内切酶和酶和核苷酸序列分析核苷酸序列分析。基因表达系统就是上述的工程菌或细胞，有原核生物和真核生物两基因表达系统就是上述的工程菌或细胞，有原核生物和真核生物两类表达系统；选择基因表达的系统主要考虑的是类表达系统；选择基因表达的系统主要考虑的是保证表达蛋白质保证表达蛋白质的功能的功能，其次要考虑的是，其次要考虑的是表达量表达量的多少和的多少和分离纯化分离纯化的难易。的难易。第十页，讲稿共二十八页哦Cutting by enzymes第十一页，讲稿共二十八页哦下游阶段在产业化中是极其重要的下游阶段在产业化中是极其重要的下下游游阶阶段段是是将将实实验验室室成成果果产产业业化化、商商品

10、品化化，主主要要包包括括工工程程菌菌大大规规模模发发酵酵最最佳佳参参数数的的确确立立，新新型型生生物物反反应应器器的的研研制制，高高效效分分离离介介质质及及装装置置的的开开发发，分分离离纯纯化化的的优优化化控控制制，高高纯纯度度产产品品的的制制备备技技术术，生生物物传传感感器器等等一一系系列列仪仪器器仪仪表表的的设设计计和和制制造造，电电子子计计算算机机的的优优化化控控制制等。等。工工程程菌菌的的发发酵酵工工艺艺不不同同于于传传统统的的抗抗生生素素和和氨氨基基酸酸发发酵酵，需需要要对对影影响响目目的的基基因因表表达达的的因因素素进进行行分分析析，对对各各种种影影响响因因素素进进行行优优化化，建

11、建立立适适于于目目的的基基因因高高效效表表达达的的发发酵酵工工艺艺，同同时时建建立立一一系系列列相相应应的的分分离离纯化纯化、质量控制质量控制、产品保存产品保存等技术。等技术。第十二页，讲稿共二十八页哦第三节第三节 目的基因的获得目的基因的获得对于目的基因的获得需要根据对于目的基因的获得需要根据目的基因的来源目的基因的来源采取适当的方法。采取适当的方法。对对于于真真核核细细胞胞来来源源的的目目的的基基因因，是是不不能能直直接接进进行行分分离离的的。真真核核细细胞胞中中单单拷拷贝贝基基因因仅仅是是染染色色体体DNA中中的的很很小小一一部部分分，即即使使多多拷拷贝贝基基因因也也是是极极少少的的，因

12、因此此从从染染色色体体中中分分离离纯纯化化目目的基因是很困难的。的基因是很困难的。另另外外，原原核核表表达达系系统统是是有有局局限限性性的的，主主要要是是由由于于真真核核基基因因的的内内含含子子及及基基因因的的后后翻翻译译过过程程，所所以以真真核核系系统统得得到到了了相相应发展。应发展。第十三页，讲稿共二十八页哦克隆真核基因常用的方法克隆真核基因常用的方法逆逆转转录录：逆逆转转录录酶酶催催化化的的反反应应，即即以以RNA为为模模板板合合成成DNA的的过过程程称为逆转录称为逆转录逆转录酶逆转录酶逆逆转转录录病病毒毒：需需在在逆逆转转录录酶酶的的作作用用下下首首先先将将RNA转转变变为为cDNA，

13、再再在在DNA复制、转录、翻译等蛋白酶作用下扩增的一类病毒。复制、转录、翻译等蛋白酶作用下扩增的一类病毒。一、逆转录法一、逆转录法第十四页，讲稿共二十八页哦逆转录酶及其催化特性逆转录酶及其催化特性RNA3 5 依赖于依赖于RNA的的DNA聚合酶聚合酶RNA3 5 核糖核酸酶核糖核酸酶H53 53 cDNA依赖依赖DNA的的DNA聚合酶聚合酶cDNA杂种分子杂种分子35 53 双链双链DNA新合成的双链新合成的双链DNA整合到整合到寄主染色体寄主染色体DNA中中第十五页，讲稿共二十八页哦16逆转录过程逆转录过程第十六页，讲稿共二十八页哦一、逆转录法一、逆转录法1、mRNA的纯化的纯化2、cDNA

14、第一链的合成第一链的合成3、cDNA第二链的合成第二链的合成4、cDNA克隆克隆5、将重组体导入宿主细胞、将重组体导入宿主细胞6、cDNA文库的鉴定文库的鉴定7、目的、目的cDNA克隆的分离和鉴定克隆的分离和鉴定第十七页，讲稿共二十八页哦18cDNA文库文库第十八页，讲稿共二十八页哦1、mRNA的纯化的纯化分离纯化目的基因的分离纯化目的基因的mRNA极其困难极其困难 种种类类多多；总总RNA总总量量少少（2%5%）；相相对对分分子子质质量量大大小小很很不不一一致，由几百到几千个核苷酸组成。致，由几百到几千个核苷酸组成。在在真真核核细细胞胞中中mRNA的的3末末端端常常常常含含有有一一多多聚聚腺

15、腺苷苷酸酸polyA组组成成的的末末端端，长长达达20250个个腺腺苷苷酸酸，可可采采用用Oligo dT-纤纤维维素素，以以亲亲和和层层析析法法将将mRNA从从细细胞胞总总RNA中中分分离离出出来来。洗洗脱脱方方法法是是高高浓浓度度盐盐溶溶液液使使mRNA特特异异结结合合于于寡寡聚聚dT，再再以以低低盐盐溶溶液液和和蒸蒸馏馏水水将将其其洗洗脱，经过两次寡聚脱，经过两次寡聚dT，可得到较纯的可得到较纯的mRNA。第十九页，讲稿共二十八页哦2、cDNA第一链的合成第一链的合成一一般般mRNA都都带带有有3-polyA，所所以以可可用用寡寡聚聚dT作作为为引引物物，在在逆逆转转录录酶酶的的催催化化

16、下下，开开始始cDNA链链的的合合成成。在在合合成成反反应应体体系系中中加加入入一一种种放放射射性性标标记记的的dNTP，在在反反应应中中以以及及反反应应后后可可通通过过测测定定放放射射性性标标记记的的dNTP掺掺入入量量，计计算算出出cDNA的的合合成成效效率率；在在凝凝胶胶电电泳泳后后，进进行行放放射射自自显显影影分分析析产产物物的的分分子子大大小小，探探索最佳反应条件。索最佳反应条件。一一次次好好的的逆逆转转录录反反应应可可使使寡寡聚聚dT选选出出的的mRNA有有5%30%被被拷贝。拷贝。第二十页，讲稿共二十八页哦RT-PCR反转录反转录PCRmRNA-cDNA-PCR第二十一页，讲稿共

17、二十八页哦3、cDNA第二链的合成第二链的合成先用碱解或先用碱解或RNaseH酶解的方法除去酶解的方法除去cDNA-mRNA杂交杂交链中的链中的mRNA链，然后以链，然后以cDNA第一链为模板合成第二第一链为模板合成第二链。由于第一链链。由于第一链cDNA链链3末端往往形成一个发夹形末端往往形成一个发夹形结构，所以，可以从这一点开始合成结构，所以，可以从这一点开始合成cDNA第二链。第二链。此反应是在此反应是在DNA聚合酶聚合酶I催化下完成的。核酸酶催化下完成的。核酸酶S1专一专一性切除单链性切除单链DNA，因此用它可以切除发夹结构。发因此用它可以切除发夹结构。发夹结构结构切除后，双链夹结构结

18、构切除后，双链cDNA分子的大小常用变性琼分子的大小常用变性琼脂糖凝胶电泳进行测定。脂糖凝胶电泳进行测定。第二十二页，讲稿共二十八页哦4、cDNA克隆克隆用用于于cDNA克克隆隆的的载载体体有有两两类类：质质粒粒DNA（如如pUC、pBR322等等）和和噬噬菌菌体体DNA（如如 gt10、gt11等等）。根根据据重重组组后后插插入入的的cDNA是是否否能能够够表表达达、能能否否经经转转录录和和翻翻译译合合成成蛋蛋白白质质，又又将将载载体体分分为为表表达达型型和和非表达型载体。非表达型载体。pUC及及 gt11为为表表达达型型载载体体，在在cDNA插插入入位位置置的的上上游游具具有有启启动动基基

19、因因顺顺序序；而而pBR322及及 gt10为为非非表表达达型型载载体体。在在cDNA克克隆隆操操作作中中应该根据不同的需要选择适当的载体。应该根据不同的需要选择适当的载体。cDNA插插入入片片段段小小于于10kb，可可选选质质粒粒载载体体，如如大大于于10kb则则应应选选用用噬噬菌体菌体DNA为载体。为载体。选选用用表表达达型型载载体体可可以以增增加加目目的的基基因因的的筛筛选选方方法法，有有利利于于目目的的基基因因的的筛筛选。选。第二十三页，讲稿共二十八页哦cDNA片段与载体的连接片段与载体的连接方方法法一一：加加同同聚聚尾尾连连接接，用用3末末端端脱脱氧氧核核苷苷酸酸转转移移酶酶催催化化

20、，使使载载体体与与cDNA的的3末末端端带带上上互互补补的的同同型型多多聚聚体体序序列列，如如载载体体加加上上polyC（或或A）的的尾尾巴巴，则则cDNA加加上上polyG（或或T）的的尾尾巴巴，这这两两种种粘粘性性末末端端只只能能使使载载体体与与cDNA连连接接而而不不能能自自我我环环化化，借借助助同同型型多多聚聚体体的的退退火火作作用用形形成成重重组组分分子子，最最后后用用T4 DNA连连接接酶酶封口。封口。第二十四页，讲稿共二十八页哦cDNA片段与载体的连接片段与载体的连接方方法法二二：加加人人工工接接头头连连接接，用用T4 DNA连连接接酶酶在在平平末末端端接接上上人人工工接接头可以

21、使头可以使DNA发生连接。发生连接。所所谓谓人人工工接接头头是是指指人人工工合合成成的的、连连接接在在目目的的基基因因两两端端的的含含有有某某些限制酶切位点的寡核苷酸片段。些限制酶切位点的寡核苷酸片段。cDNA连连上上人人工工接接头头后后，用用该该限限制制酶酶酶酶切切就就可可得得到到粘粘性性末末端端，从从而而能能够够与与载载体体连连接接；cDNA中中也也可可能能带带有有同同样样的的限限制制酶酶切切点点，为为了了保保护护cDNA不不受受限限制制酶酶破破坏坏，可可在在加加接接头头前前用用甲甲基基化化酶酶修饰这些限制酶切位点。修饰这些限制酶切位点。第二十五页，讲稿共二十八页哦5、将重组体导入宿主细胞

22、、将重组体导入宿主细胞体外包装的体外包装的 噬菌体，感染感受态大肠杆菌形成噬菌斑；或转化感噬菌体，感染感受态大肠杆菌形成噬菌斑；或转化感受态大肠杆菌使质粒进入细胞内。受态大肠杆菌使质粒进入细胞内。6、cDNA文库的鉴定文库的鉴定根据重组体的表型进行筛选，主要有抗性基因失活法和菌根据重组体的表型进行筛选，主要有抗性基因失活法和菌落或噬菌斑颜色改变法。然后采用凝胶电泳、分子杂交、落或噬菌斑颜色改变法。然后采用凝胶电泳、分子杂交、DNA序列分析测定等方法进行进一步筛选和鉴定。序列分析测定等方法进行进一步筛选和鉴定。第二十六页，讲稿共二十八页哦7、目的、目的cDNA克隆的分离和鉴定克隆的分离和鉴定从从

23、cDNA文库中分离特异的文库中分离特异的cDNA克隆，主要采用：克隆，主要采用：（1）核核酸酸探探针针杂杂交交法法。用用层层析析和和高高分分辨辨电电泳泳等等技技术术纯纯化化微微克克量量的的目目的的蛋蛋白白质质，根根据据目目的的蛋蛋白白质质纯纯品品的的氨氨基基酸酸序序列列分分析析结结果果，人人工工合合成成相相应应的的单链寡核苷酸作为探针，从单链寡核苷酸作为探针，从cDNA文库中分离特异文库中分离特异cDNA克隆。克隆。（2）免免疫疫反反应应鉴鉴定定法法。在在既既无无可可供供选选择择的的基基因因表表型型特特征征，又又无无合合适适探探针针的的情情况况下下，本本法法是是重重要要途途径径。用用表表达达型

24、型载载体体构构建建的的cDNA文文库库，可可用用免免疫疫学学方方法法分分组组逐逐一一鉴鉴定定各各cDNA的的表表达达产产物物，即即以以某某种种蛋蛋白白质质的的抗体寻找相应的特异抗体寻找相应的特异cDNA克隆。克隆。第二十七页，讲稿共二十八页哦分离得到含有目的基因的阳性克隆后，必须对其作进一步的验分离得到含有目的基因的阳性克隆后，必须对其作进一步的验证和鉴定，主要是进行证和鉴定，主要是进行限制酶图谱的绘制、杂交分析、基因定限制酶图谱的绘制、杂交分析、基因定位、基因测序以及确定基因的转录方向、转录起始点位、基因测序以及确定基因的转录方向、转录起始点等。等。1985，PCR发明以后，发明以后，RT-PCR得到了广泛的应用。得到了广泛的应用。7、目的、目的cDNA克隆的分离和鉴定克隆的分离和鉴定第二十八页，讲稿共二十八页哦