如何解析蛋白质的空间结构课件.ppt

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1、关于如何解析蛋白质的空间结构现在学习的是第1页，共45页研究蛋白质的结构、性质和功能，首先需要得到纯的蛋白质样品。问题的提出：问题的提出：现在学习的是第2页，共45页（一）蛋白质的两性电离（一）蛋白质的两性电离 一、理化性质一、理化性质 蛋蛋白白质质分分子子除除两两端端的的氨氨基基和和羧羧基基可可解解离离外外，氨氨基基酸酸残残基基侧侧链链中中某某些些基基团团，在在一一定定的的溶溶液液pHpH条条件件下下都都可可解解离离成带负电荷或正电荷的基团。成带负电荷或正电荷的基团。*蛋白质的等电点蛋白质的等电点(isoelectric point,pI)(isoelectric point,pI)6 6

2、蛋白质的性质及其分离纯化蛋白质的性质及其分离纯化 现在学习的是第3页，共45页当蛋白质溶液处于某一当蛋白质溶液处于某一pHpH时，蛋白质解离成正、负离子时，蛋白质解离成正、负离子的趋势相等，即成为兼性离子，净电荷为零，此时溶液的的趋势相等，即成为兼性离子，净电荷为零，此时溶液的pHpH称为蛋白质的等电点称为蛋白质的等电点现在学习的是第4页，共45页（二）蛋白质的胶体性质（二）蛋白质的胶体性质 蛋蛋白白质质属属于于生生物物大大分分子子之之一一，分分子子量量可可达达100100万万之之巨巨，其其分分子子的的直直径径可可达达1 1100nm100nm，为为胶胶粒粒范范围围之内。之内。*蛋白质胶体稳定

3、的因素：蛋白质胶体稳定的因素：颗粒表面电荷颗粒表面电荷(电荷层）电荷层）水化膜水化膜现在学习的是第5页，共45页+带正电荷的蛋白质带正电荷的蛋白质带负电荷的蛋白质带负电荷的蛋白质在等电点的蛋白质在等电点的蛋白质水化膜水化膜+带正电荷的蛋白质带正电荷的蛋白质带负电荷的蛋白质带负电荷的蛋白质不稳定的蛋白质颗粒不稳定的蛋白质颗粒酸酸碱碱酸酸碱碱酸酸碱碱脱水作用脱水作用脱水作用脱水作用脱水作用脱水作用溶液中蛋白质的聚沉溶液中蛋白质的聚沉现在学习的是第6页，共45页（三）蛋白质的变性、沉淀和凝固（三）蛋白质的变性、沉淀和凝固 *蛋白质的变性蛋白质的变性(denaturation)(denaturatio

4、n)在某些物理和化学因素作用下，其特定的空在某些物理和化学因素作用下，其特定的空间构象被破坏，也即有序的空间结构变成无序的间构象被破坏，也即有序的空间结构变成无序的空间结构，从而导致其理化性质改变和生物活性空间结构，从而导致其理化性质改变和生物活性的丧失。的丧失。现在学习的是第7页，共45页 造成变性的因素造成变性的因素如加热、乙醇等有机溶剂、强酸、强碱、重如加热、乙醇等有机溶剂、强酸、强碱、重金属离子及生物碱试剂等金属离子及生物碱试剂等。变性的本质变性的本质 破坏非共价键和二硫键，不改变蛋破坏非共价键和二硫键，不改变蛋 白质的一级结构。白质的一级结构。现在学习的是第8页，共45页 应用举例应

5、用举例临床医学上，变性因素常被应用来消毒及灭菌。临床医学上，变性因素常被应用来消毒及灭菌。此外此外,防止蛋白质变性也是有效保存蛋白质制剂防止蛋白质变性也是有效保存蛋白质制剂（如疫苗等）的必要条件。（如疫苗等）的必要条件。现在学习的是第9页，共45页变性蛋白质的性质改变：变性蛋白质的性质改变：物物理理性性质质：旋旋光光性性改改变变，溶溶解解度度下下降降，沉沉降降率率升升高，粘度升高，光吸收度增加等；高，粘度升高，光吸收度增加等；化化学学性性质质：官官能能团团反反应应性性增增加加，易易被被蛋蛋白白酶酶水水解。解。生物学性质：原有生物学活性丧失，抗原性改变。生物学性质：原有生物学活性丧失，抗原性改变

6、。若若蛋蛋白白质质变变性性程程度度较较轻轻，去去除除变变性性因因素素后后，蛋蛋白白质质仍仍可可恢恢复复或或部部分分恢恢复复其其原原有有的的构构象象和和功功能能，称称为复性为复性(renaturation)(renaturation)。变性蛋白质的复性：变性蛋白质的复性：现在学习的是第10页，共45页 天然状态，天然状态，有催化活性有催化活性 尿素、尿素、-巯基乙醇巯基乙醇 去除尿素、去除尿素、-巯基乙醇巯基乙醇非折叠状态，无活性非折叠状态，无活性现在学习的是第11页，共45页*蛋白质沉淀蛋白质沉淀在在一一定定条条件件下下，蛋蛋白白疏疏水水侧侧链链暴暴露露在在外外，肽肽链链融融会相互缠绕继而聚集

7、，因而从溶液中析出。会相互缠绕继而聚集，因而从溶液中析出。变变性性的的蛋蛋白白质质易易于于沉沉淀淀，有有时时蛋蛋白白质质发发生生沉沉淀淀，但并不变性。但并不变性。*蛋白质的凝固作用蛋白质的凝固作用(protein coagulation)(protein coagulation)蛋白质变性后的絮状物加热可变成比较坚固的凝蛋白质变性后的絮状物加热可变成比较坚固的凝块，此凝块不易再溶于强酸和强碱中。块，此凝块不易再溶于强酸和强碱中。现在学习的是第12页，共45页（四）蛋白质的紫外吸收（四）蛋白质的紫外吸收由由于于蛋蛋白白质质分分子子中中含含有有共共轭轭双双键键的的酪酪氨氨酸酸和和色色氨氨酸酸，因因

8、此此在在280nm280nm波波长长处处有有特特征征性性吸吸收收峰峰。蛋蛋白白质质的的ODOD280280与与其其浓浓度度呈呈正正比比关关系系，因因此此可可作作蛋蛋白白质质定定量测定。量测定。现在学习的是第13页，共45页（五）蛋白质的呈色反应（五）蛋白质的呈色反应茚三酮反应茚三酮反应(ninhydrin reaction)(ninhydrin reaction)蛋白质经水解后产生的蛋白质经水解后产生的氨基酸氨基酸也可发生茚三酮也可发生茚三酮反应。反应。双缩脲反应双缩脲反应(biuret reaction)(biuret reaction)蛋白质和多肽分子中蛋白质和多肽分子中肽键肽键在稀碱溶液

9、中与硫酸在稀碱溶液中与硫酸铜共热，呈现紫色或红色，此反应称为铜共热，呈现紫色或红色，此反应称为双缩脲反应双缩脲反应，双缩脲反应可用来检测蛋白质水解程度。双缩脲反应可用来检测蛋白质水解程度。现在学习的是第14页，共45页二、二、蛋白质的分离和纯化蛋白质的分离和纯化（一）透析及超滤法（一）透析及超滤法*透析透析(dialysis)(dialysis)利用透析袋把大分子蛋白质与利用透析袋把大分子蛋白质与小分子化合物分开的方法。小分子化合物分开的方法。*超滤法超滤法 应用正压或离心力使蛋白质溶液透应用正压或离心力使蛋白质溶液透过有一定截留分子量的超滤膜，达过有一定截留分子量的超滤膜，达到浓缩蛋白质溶液

10、的目的到浓缩蛋白质溶液的目的。现在学习的是第15页，共45页（二）丙酮沉淀、盐析及免疫沉淀二）丙酮沉淀、盐析及免疫沉淀 *使使用用丙丙酮酮沉沉淀淀时时，必必须须在在0 044低低温温下下进进行行，丙丙酮酮用用量量一一般般1010倍倍于于蛋蛋白白质质溶溶液液体体积积。蛋蛋白白质质被被丙丙酮酮沉沉淀淀后后，应应立立即即分分离离。除除了了丙丙酮酮以以外外，也也可可用用乙乙醇醇沉沉淀。淀。*盐盐析析(salt(salt precipitation)precipitation)是是将将硫硫酸酸铵铵、硫硫酸酸钠钠或或氯氯化化钠钠等等加加入入蛋蛋白白质质溶溶液液，使使蛋蛋白白质质表表面面电电荷被中和以及水化

11、膜被破坏，导致蛋白质沉淀。荷被中和以及水化膜被破坏，导致蛋白质沉淀。现在学习的是第16页，共45页*免疫沉淀法：将某一纯化蛋白质免疫动物可获免疫沉淀法：将某一纯化蛋白质免疫动物可获得抗该蛋白的特异抗体。利用特异抗体识别相得抗该蛋白的特异抗体。利用特异抗体识别相应的抗原蛋白，并形成抗原抗体复合物的性质，应的抗原蛋白，并形成抗原抗体复合物的性质，可从蛋白质混合溶液中分离获得抗原蛋白。可从蛋白质混合溶液中分离获得抗原蛋白。现在学习的是第17页，共45页（三）电泳（三）电泳蛋蛋白白质质在在高高于于或或低低于于其其pIpI的的溶溶液液中中为为带带电电的的颗颗粒粒，在在电电场场中中能能向向正正极极或或负负

12、极极移移动动。这这种种通通过过蛋蛋白白质质在在电电场场中中泳泳动动而而达达到到分分离离各各种种蛋蛋白白质质的的技技术术,称称为电泳为电泳(elctrophoresis)(elctrophoresis)。现在学习的是第18页，共45页电泳的类型 目前电泳的类型很多，最常见的是区带电泳，由于在支持物上电泳时蛋白质混合物被分离成若干区带而得名。现在学习的是第19页，共45页区带电泳按其支持物的物理性状不同可以分成几类：滤纸电泳和薄膜电泳(如醋酸纤维薄膜电泳和聚酰胺薄膜电泳)；粉末电泳，支持介质是淀粉、纤维素粉或硅胶粉等，粉末与适当的溶剂调和，铺设成平板；现在学习的是第20页，共45页 凝胶电泳，最常

13、用的支持介质有聚丙烯酰胺和琼脂糖凝胶，前者适于分离蛋白质和多核苷酸，后者适于分离核酸，这两种凝胶电泳的分辨率都很高，-+现在学习的是第21页，共45页现在学习的是第22页，共45页双向电泳(two-dimensional electrophoresis)现在学习的是第23页，共45页记住这几种重要的蛋白质电泳记住这几种重要的蛋白质电泳*SDS-SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳，常用于蛋白质分子量，常用于蛋白质分子量的测定。的测定。*等电聚焦电泳，等电聚焦电泳，通过蛋白质等电点的差异而分离通过蛋白质等电点的差异而分离蛋白质的电泳方法。蛋白质的电泳方法。*双向凝胶电泳双向凝胶电泳是蛋白

14、质组学研究的重要技术。是蛋白质组学研究的重要技术。现在学习的是第24页，共45页（四）层析（四）层析层析层析(chromatography)(chromatography)分离蛋白质的原理分离蛋白质的原理待分离蛋白质溶液（流动相）经过一个固态物待分离蛋白质溶液（流动相）经过一个固态物质（固定相）时，根据溶液中待分离的蛋白质颗粒大质（固定相）时，根据溶液中待分离的蛋白质颗粒大小、电荷多少及亲和力等，使待分离的蛋白质组分在小、电荷多少及亲和力等，使待分离的蛋白质组分在两相中反复分配，并以不同速度流经固定相而达到分两相中反复分配，并以不同速度流经固定相而达到分离蛋白质的目的离蛋白质的目的 。现在学习

15、的是第25页，共45页现在学习的是第26页，共45页蛋白质分离常用的层析方法蛋白质分离常用的层析方法*离子交换层析离子交换层析：利用各蛋白质的电荷量及性质不同进行利用各蛋白质的电荷量及性质不同进行分离。分离。凝胶过滤凝胶过滤(gel filtration)(gel filtration)又称分子筛层析又称分子筛层析，利用各蛋利用各蛋白质分子大小不同分离。白质分子大小不同分离。亲和层析亲和层析(affinity chromatography)(affinity chromatography)是利用蛋白质分是利用蛋白质分子对其配体分子特有的识别能力，也即生物学亲和力子对其配体分子特有的识别能力，也

16、即生物学亲和力（底物和酶，抗原与抗体，酶与抑制剂，受体与底物底物和酶，抗原与抗体，酶与抑制剂，受体与底物等）等），建立起来的一种有效的纯化方法。它经常只需要经，建立起来的一种有效的纯化方法。它经常只需要经过一步的处理即可将某种所需蛋白质从复杂的混合物过一步的处理即可将某种所需蛋白质从复杂的混合物中分离出来，并且纯度相当高。中分离出来，并且纯度相当高。现在学习的是第27页，共45页现在学习的是第28页，共45页现在学习的是第29页，共45页亲和层析亲和层析现在学习的是第30页，共45页（五）（五）超速离心超速离心 ultracentrifugation*既既可可以以用用来来分分离离纯纯化化蛋蛋白

17、白质质也也可可以以用用作作测测定定蛋蛋白白质质的的分分子量。子量。*蛋蛋白白质质在在离离心心场场中中的的行行为为用用沉沉降降系系数数(sedimentation(sedimentation coefficient,coefficient,S)S)表表示示,沉沉降降系系数数与与蛋蛋白白质质的的密密度度和和形形状状相相关关 。现在学习的是第31页，共45页蛋白质纯化方法总结：蛋白质纯化方法总结：根据蛋白质在溶液中的性质分离纯化蛋白质的方法：分子大小；溶解度；电荷；吸附性质；对配体分子的生物学亲和力等。透析离心沉淀电泳层析现在学习的是第32页，共45页一、蛋白质含量测定一、蛋白质含量测定 总蛋白质含

18、量测定有两类方法：1、利用蛋白质的物理性质，如折射率、比重、紫外吸收等测定。2、利用化学方法测定蛋白质含量，如微量凯氏定氮、双缩脲反应、Folin-酚试剂法(又名Lowry法)。这两类方法各有优缺点，选用何种方法测定蛋白质含量，可根据实验要求及实验室条件进行选择。原理都是利用蛋白质的成色反应或紫外吸收的性质，通过分光光度法来测定。7 7 蛋白质的含量测定与纯度鉴定蛋白质的含量测定与纯度鉴定现在学习的是第33页，共45页1.凯氏定氮法是经典的标准方法，用浓硫酸消化蛋白质分解出氨，测定氨的含量，除以16%，就得出蛋白质的含量。现在学习的是第34页，共45页2.双缩脲法蛋白质在碱性溶液中，能与Cu2

19、+形成紫红色络合物，颜色深浅与蛋白质浓度成正比，故可以用来测定蛋白质的浓度。凡含有双缩脲相似结构的物质均能参与反应，常用于需要快速但并不需要十分精确的测定。现在学习的是第35页，共45页3.Lowry法(Folin-酚法)Folin-酚试剂由甲试剂与乙试剂组成。甲试剂由碳酸钠、氢氧化钠、硫酸铜及酒石酸钾钠组成。乙试剂是由磷钼酸和磷钨酸、硫酸、溴等组成。机机理理：蛋白质中的肽键在碱性条件下，与酒石酸钾钠铜盐溶液起作用，生成紫紫红色红色络合物（组成不清楚）。现在学习的是第36页，共45页Lowry法目前实验室多用Folin-酚法测定蛋白质含量。此法的优点是操作简单，迅速，不需特殊仪器设备，灵敏度高

20、，较紫外吸收法灵敏1020 倍，较双缩脲法灵敏100倍，反应约在15min内有最大显色，并至少可稳定几小时。其不足之处是此反应受多种因素干扰。在测试时应排除干扰因素或做空白试验消除。现在学习的是第37页，共45页4.紫外吸收法 由于蛋白质分子中酪氨酸和色氨酸残基的苯环含有共轭双键，因此蛋白质具有吸收紫外线的性质，吸收高峰在280nm波长处。在此波长范围内，蛋白质溶液的光吸收值(A280)与其含量呈正比关系，可用作定量测定。现在学习的是第38页，共45页紫外吸收法的优缺点：紫外吸收法的优缺点：优优点点：简便、不消耗样品，低浓度盐类不干扰测定。因此，在蛋白质和酶的生化制备中(特别是在柱层析分离中)

21、广泛应用。缺点：缺点：(1)对于测定那些与标准蛋白质中酪氨酸和色氨酸含量差异较大的蛋白质，有一定的误差，(2)若样品中含有嘌呤、嘧啶等吸收紫外线的物质，会出现较大的干扰。现在学习的是第39页，共45页5.考马斯亮蓝染色法蛋白质的存在会影响酸碱滴定中所用某些指示剂的颜色变化，从而改变这些染料的光吸收。在此基础上，发展蛋白质染色测定方法。涉及的指示剂有甲基橙、考马斯亮蓝、溴甲酚绿和溴甲酚紫，目前广泛使用的染料是考马斯亮蓝。考马斯亮蓝R-250和蛋白质通过范德瓦尔键结合，呈蓝色，在一定蛋白质浓度范围内，蛋白质的染色符合比尔定律。25min即呈现最大光吸收，至少稳定1h。本方法可允许的测定范围是220

22、ug蛋白质。受蛋白质的特异性影响较小，除组蛋白外，其他不同种类蛋白质的染色强度差别不大。现在学习的是第40页，共45页6.胶体金测定法胶体金胶体金是一种带负电荷的疏水胶体，呈洋红色，遇蛋白质转变为蓝色，颜色改变与蛋白质有定量关系，是几种方法中灵敏度最高的，检测量是ng水平。现在学习的是第41页，共45页7.某一特定蛋白质的含量测定通常要用具有高度特异性的生物学方法。具有酶或激素性质的蛋白质可以利用它们的酶活性或激素活性来测定含量。有些蛋白质虽然没有酶或激素那样特异的生物学活性，但是大多数蛋白质当注入适当的动物血液中时，会产生抗体。因此，利用抗体抗原反应，也可以测定某一特定蛋白质的含量。现在学习

23、的是第42页，共45页二、蛋白质纯度的鉴定二、蛋白质纯度的鉴定蛋白质纯度鉴定通常采用物理化学的方法：（1）电泳：）电泳：目前采用的电泳分析有等电聚集、聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)和SDSPAGE、毛细管电泳等。纯的蛋白质在一系列不同的pH条件下进行电泳时，都将以单一的速度移动，它的电泳图谱只呈现一个条带(或峰)。（2）离心沉降：）离心沉降：纯的蛋白质在离心场中，应以单一的沉降速度移动现在学习的是第43页，共45页（3）HPLC：常用于多肽、蛋白质纯度的鉴定。纯蛋白质样品在HPLC的洗脱图谱上呈现出单一的对称峰。（4）溶解度分析：）溶解度分析：（5）N末端分析末端分析也用于鉴定纯度，因为均一的单链蛋白质样品中，N端残基只可能有一种氨基酸。现在学习的是第44页，共45页27.09.2022感感谢谢大大家家观观看看现在学习的是第45页，共45页