Ｈ2Ｏ2对家蝇蛹内部几种酶活性的影响 蝇蛹.docx

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1、22对家蝇蛹内部几种酶活性的影响 蝇蛹 摘要：目的探讨外源H2O2对家蝇蛹内与抗性相关的几种酶活性的影响。方法通过H2O2诱导，测定家蝇蛹内过氧化氢酶（CAT）、过氧化物酶（POD）、抗坏血酸过氧化物酶（AsA-POD）以及多酚氧化酶（PPO）的活性改变。结果H2O2处理后蛹内CAT和AsA-POD的活性改变规律与处理前差别不大；POD活性在H2O2处理后12 h内出现活性高峰，约为比照组的2.5倍，此后稍高于比照组，最终基本与比照组持平；PPO活性在处理后12 h内与比照组相当，此后活性隧然上升，处理后24 h达到比照组的2.13倍，然后改变速度减慢，但始终维持在比照组的1.3倍左右，48

2、h后活性起先下降。结论H2O2对CAT和AsA-POD的活性影响较小，对POD和PPO的活性有肯定的影响。 关键词：家蝇；蛹；过氧化氢；过氧化氢酶；过氧化物酶；抗坏血酸过氧化物酶；多酚氧化酶 中图分类号：Q814文献标识码：A文章编号：1672-979X(2007)08-0008-03 活性氧是机体正常代谢过程中产生的一类氧化性物质，具有很强的氧化实力，对很多生物功能分子有破坏作用。正常状况下，因细胞内存在着自由基清除系统，细胞内的自由基水平比较低，不会造成损害。这个清除系统主要为酶催化系统，如SOD催化O2产生具有毒性的H2O2，H2O2再由过氧化氢酶（CAT）、过氧化物酶（POD）分解，从

3、而维持正常的生理活动。但外界刺激物会促使昆虫体内超氧阴离子自由基（O2）、单线态氧（O2）、过氧化氢（H2O2）和羟自由基（OH）等活性氧增加，同时也能诱导昆虫产生其它生理活性物质，如昆虫抗菌肽、抗菌蛋白、防卫素及其它小分子物质用于防卫。这是昆虫在进化过程中逐步形成的反抗外源刺激物和不良因素影响的有效途径。 完全变态的昆虫如蝇、蚕中，从幼虫过渡到成虫时的虫体形态叫蛹。蛹广泛存在于自然界，但是，目前对昆虫蛹的探讨大多限于从中提取油脂1-3和蛋白质4-6等生物活性物质，在生理生化方面的探讨较少。家蝇（Musca domestica）世界性分布范围较广，饲养便利，作为试验性昆虫具有较大的优势。本试验

4、从酶学角度探讨了外源H2O2对家蝇蛹内与抗性相关的几种酶活性的影响，为全面了解家蝇整个生活史的抗氧化系统以及其它生理生化反应供应重要依据，为探讨家蝇蛹的食用药用价值打下理论基础。 1材料与方法 1.1试验材料及处理 家蝇由南开高校生命科学学院遗传工程试验室饲养；温度28 ；相对湿度75%；光/暗12 h/12 h；饲料：麦麸蛋白粉水=10120。 材料处理：取刚蛹化的家蝇蛹，部分作为比照，另一部分用30% H2O2浸泡45 min后，快速用无菌蒸馏水将蛹表面残留的H2O2冲洗干净，晾干，以进行下一步试验。 1.2酶的提取及其活性测定 1.2.1酶的提取取1 g蛹，加入4 mL酶提取缓冲液，快速

5、在冰浴条件下研磨成匀浆，在4 下13 000 r/min 离心20 min，上清液即为酶粗提液。 1.2.2酶活性的测定 1.2.2.1过氧化氢酶（CAT）7以改进的Aebi（1984）法测定CAT活性：反应混合液3 mL为0.025 mol/L磷酸缓冲液（pH 7.0），10LH2O2和10L酶液，于240 nm处测定吸光度值改变。在测定条件下30 s内吸光度值变更0.01单位为1个酶活性单位。 1.2.2.2过氧化物酶(POD)8用愈创木酚法(Charles，1998)测定POD酶活性：在50 mL 0.05 mol/L（pH 7.2）磷酸缓冲液中加入28L愈创木酚，溶解后加入19L H2

6、O2作为POD反应液，取150L粗酶液，2.5 mL POD反应液混匀后，马上于470nm处测定吸光度。在测定条件下，1 min内吸光度值变更0.01单位为1个酶活性单位。 1.2.2.3抗坏血酸过氧化物酶（AsA-POD）9用修改的Nakano & Asada（1981）方法：3 mL反应液为0.025 mol/L pH 7.0的磷酸缓冲液（含有0.1 mmol/L EDTA，1.0 mmol/L H2O2，0.25 mmol/L AsA）和适量酶液，测定290 nm下吸光度的改变。在测定条件下，1 min内吸光度值变更0.01单位为1个酶活性单位。 1.2.2.4多酚氧化酶（PPO）10用

7、改进的李宁等（2002）的方法：在2.5 mL 0.05 mol/L的磷酸柠檬酸缓冲液（pH 5.0）中加入1 mL 0.04 mol/L的邻苯二酚溶液，再加入50L酶液，混匀后测定398 nm下吸光度值的改变。在测定条件下，2 min内吸光度值变更0.01单位为1个酶活性单位。 1.3试验设计 由于蛹是昆虫生长过程中的一个特别阶段，其内部生理活动也有特别性，因此，设计取样11次，分别在处理刚结束（0）以及处理后1，2，3，4，8，12，24，36，48，60 h分别取样测定酶活性改变，以同时蛹化的未处理蛹为比照。 2结果与分析 2.1H2O2对家蝇蛹内CAT活性的影响 见图1。由图1可见，H

8、2O2对蛹体内CAT活性改变的影响较小，处理组与比照组的改变规律基本相同，表明CAT对清除蛹体内活性氧自由基的作用小。 2.2H2O2对家蝇蛹内POD活性的影响 结果见图2。可以看出，在处理后12 h内，POD活性出现一个明显的峰值，最高值大约出现在处理后8 h左右，是比照组的2.5倍，而后的几十小时中，处理组高于比照组12倍，60 h后基本达到比照组水平。可见在蛹前期，POD对于清除蛹体内活性氧有较大作用。 2.3H2O2对家蝇蛹内AsA-POD活性的影响 见图3。由图3可见，H2O2对蛹体内AsA-POD的诱导效果很小，处理组与比照组的活性改变规律及改变幅度基本一样，表明AsA-POD与C

9、AT一样对清除蛹体内活性氧的作用小。 2.4 H2O2对家蝇蛹内PPO活性的影响 结果见图4。由图4 可见，蛹经过H2O2处理后，12 h内活性与比照组持平，从处理后12 h起先活性隧然上升，在处理后24 h达到了比照组的2.13倍，然后改变速度减慢，但始终维持在比照组的1.3倍左右，48 h后活性起先下降，试验结束时基本达到比照组水平。表明在家蝇蛹期，PPO对蛹内部活性氧的作用较为重要。 3探讨 探讨表明，家蝇蛹内依靠酶催化的自由基消退系统与幼虫相比相对简洁（已另文发表），可能与其所处的特定发育阶段有关。蛹处在家蝇变态发育的关键阶段，内部生理活动较为特别，产生的活性氧量少或依靠于其它非酶促自

10、由基消退系统来完成。家蝇幼虫刚蛹化时，内部生理活动相对高些，经外源H2O2胁迫后，自由基积累相对快且多，从而导致CAT，AsA-POD和POD的活性出现不同程度的改变，用以消退过多的氧自由基。随着蛹化时间的延长，内部生理活动的减弱，氧自由基的积累相对变缓，酶活性也随之改变并保持较为稳定的水平。PPO在昆虫体内是以无活性的酶原形式前酚氧化酶存在于血淋巴、中肠和表皮等组织，当昆虫受到外界微生物的入侵和损害时，通过特异性丝氨酸蛋白酶的级联反应被激活，参加机体的免疫防卫反应和伤口愈合11，12。昆虫体内的PPO构成了细胞与体液防卫系统的重要部分。现已证明，这种酶至少有两种免疫功能：（1）参加黑化包被反

11、应中黑色素的合成；（2）作为识别系统诱导宿主防卫系统中产生其他成份13。PPO是黑化包被反应中重要的酶，试验中可以见到，随着蛹化后时间的延长，家蝇蛹的颜色渐渐由浅变深，推想系PPO作用所致。有关家蝇蛹发育或胁迫时PPO活性的改变尚未见报道。试验结果表明，POD，PPO在家蝇蛹内部起到较为重要的防卫作用，这为将来探讨家蝇蛹的食用、药用价值供应了重要的理论基础。 参考文献 1郑小坚，张雨青. 昆虫蛹油的索氏提取法J. 生物学通报，2001，36（1）：36-37. 2詹永乐，翟文才，王运湘，等. 家蚕蛹油的脂肪酸成分分析（简报）J. 安徽农业高校学报，1995，22（3）：294-296. 3牛长

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13、 R B, John W M. Localized change in peroxidase activity accompany hydrogen peroxide genereation during the deveopment of a nonhost hypersensitive reaction in lettuce J. Plant Physiol, 1998, 118：1065-1078. 9Nakano Y, Asada K. Hydrogen peroxidase is scavenged by ascorbate-specific peroxidase in spinac

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