乙酰胆碱对黄化玉米幼苗物质跨节运输的调控效应.pdf

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1、分类号：密级：U D C：中国农业大学 博士学位论文 乙酰胆碱对黄化玉米幼苗物质跨节运输的调控效应 Modulating effects of acetylcholine on material translocation across node in etiolated Zea mays seedlings 研 究 生：兰 平 指导导师：娄成后 教 授 专 业：植物学 研究方向：高等植物体内的物质 运输与信息传递 二零零一年六月 China Agricultural University Ph.D.Dissertation Modulating effects of acetylcholin

2、e on material translocation across node in etiolated zea mays seedlings Ph.D.Candidate:Ping Lan Supervisor:Professor Chenghou Lou Speciality:Plant Science Research field:Material translocation and signal transduction in higher plant June,2001 目 录 中文摘要 A B S T R A C T 缩略语表 第一章 文献综述1 1 细胞间连接1 2 胞间连丝的结

3、构、组成及其动态性2 3 信号和物质穿越胞间连丝的机制6 3.1 电信号6 3.2 激素和其他小分子化学物质 6 3.2.1 分子扩散上限6 3.2.2 分子扩散上限的可变性6 4 胞间连丝的大分子主动运输7 4.1 核穿壁与原生质的胞间运动7 4.2 病 毒 的 胞 间 运 输 7 4.2.1 病毒蛋白的胞间转移7 4.2.2 病毒基因组的胞间转移8 4.2.3 病毒胞间转移的分子机制8 4.3 植物内源蛋白质的胞间运输9 4.3.1 植物发育过程中转录因子的胞间运输9 4.3.2 韧皮部中的蛋白转移10 4.3.3 植物防御蛋白的胞间转移11 5 研究大分子胞间转运的生物学意义12 6 胞

4、间连丝通透性的调节及其生理意义13 7 植物界的胆碱能系统13 8 植物的节15 9 本研究的目的和意义15 第二章 黄化玉米幼苗节、中胚轴和胚芽鞘的结构观察1 7 1 材料和方法17 1.1 植物材料 17 1.2 光学显微镜观察 17 1.3 电子显微镜观察 17 2 观察结果17 2.1 玉米节细胞的显微、超微结构17 2.2 玉米节间细胞的显微、超微结构18 2.3 玉米胚芽鞘细胞的显微、超微结构18 3 讨论18 图版说明2 0 图版2 2 图版2 3 图版2 4 第三章 乙酰胆碱对黄化玉米幼苗物质跨节运输的调控效应2 5 1 材料和方法25 1.1 植物材料 25 1.2 节和节间

5、电阻测定25 1.3 荧光标记物的引入和测定 25 2 结果26 2.1 节和节间组织的通透性和物质运转26 2.2 CF 以共质体为主要转移途径的验证27 2.3 ACh 对跨节比电阻和运输的影响27 3 讨论28 3.1 实验方法的可靠性 28 3.2 ACh 对跨节比电阻和运输的影响28 第四章 黄化玉米幼苗质膜 H+-A T P a s e的活性测定和细胞定位观察3 0 1 材料与方法30 1.1 植物材料30 1.2 质膜 H+-ATPase 活性测定30 1.2.1 质膜微囊的制备和纯化30 1.2.2 膜蛋白电泳31 1.2.3 质膜 H+-ATPase 的免疫印迹鉴定31 1.

6、2.4 酶活性测定31 1.2.4.1 无机磷标准曲线的制作及测定31 1.2.4.2 蛋白质标准曲线的制作及测定32 1.2.4.3 酶活性计算32 1.2.5 ATPase 的细胞化学研究32 2 结果与分析 32 2.1 质膜微囊的分离和纯化32 2.2 质膜微囊的 SDS-PAGE 电泳和质膜 H+-ATPase 的免疫印迹分析33 2.3 质膜 H+-ATPase 活性测定及乙酰胆碱和梭壳孢素对它的影响3 4 2.4 ATPase 的细胞化学定位34 3 讨论35 3.1 质膜的分离与纯化35 3.2 乙酰胆碱和壳梭孢素对质膜 H+-ATPase 活性的影响35 图版说明3 6 图版

7、3 8 图版3 9 图版4 0 第五章 黄化玉米幼苗节、中胚轴和胚芽鞘中乙酰胆碱酯酶的活性测定细胞定位观察 4 1 1 材料与方法41 1.1 植物材料 41 1.2 节、中胚轴和胚芽鞘的 AChE 活性测定41 1.2.1 乙酰胆碱酯酶的提取41 1.2.2 活性测定步骤41 1.2.3 蛋白含量测定42 1.3 节、中胚轴和胚芽鞘 AChE 的细胞定位观察42 2 实验结果42 2.1 黄化玉米幼苗中存在乙酰胆碱酯酶42 2.2 节、中胚轴和胚芽鞘中乙酰胆碱酯酶的活性43 2.3 节、中胚轴和胚芽鞘中乙酰胆碱酯酶的细胞定位观察43 3 讨论43 图版说明4 5 图版4 6 图版4 7 第六

8、章 黄化玉米幼苗节、中胚轴和胚芽鞘中 n A C h R的荧光鉴定4 8 1 材料与方法48 1.1 植物材料48 1.2 烟碱型乙酰胆碱受体的荧光定位49 1.2.1 组织水平上的荧光定位49 1.2.2 原生质体水平上的荧光定位49 1.2.2.1 原生质体的制备和纯化49 1.2.2.2 原生质体的 nAChR 的荧光定位49 2 结果和分析 50 2.1 烟碱型乙酰胆碱受体的组织水平的荧光定位50 2.2 烟碱型乙酰胆碱受体的原生质体水平的荧光定位50 3 讨论50 图版说明5 2 图版5 3 图版5 4 总结与展望5 5 参考文献5 6 致谢6 7 英文摘要 III中文摘要 由多细胞

9、构成的高等植物植立不动，无时不在地遭受多端变化的环境刺激，为了生存，植物细胞间必须有密切的联系和通讯，迅速地对外界刺激作出反应，才能维持整体中各部分功能的协调与合作，最终完成其生活史。物质转移和信息传递在植物生命活动中发挥着生命枢纽作用，是植物的命脉。胞间连丝作为植物体内“绿色电缆和运输线”恰恰起着物质运输和信息传递的交通要道的作用，胞间连丝的通透性不仅需要能量维持，而且受到多种内外因子的影响。乙酰胆碱是动物神经冲动传递过程中最先发现的重要递质，负责神经细胞间及神经-肌肉接头间的信息传递。植物界也广泛存在胆碱能系统（乙酰胆碱、胆碱乙酰基转移酶、乙酰胆碱酯酶、乙酰胆碱受体），并且有广谱的生理功能

10、，主要涉及与生物膜对离子通透性有关的生理过程。植物的节将相邻的两个中胚轴连接起来，贯穿为一个整体。但是物质和信息的跨节运输和传递同中胚轴明显不同。节对物质跨节运输具有调控效应，进而影响着植物的形态建成和生长发育。为了阐明和完善植物中乙酰胆碱的作用，尤其对物质跨节运输的调控效应，本文以黄化玉米幼苗为材料，对乙酰胆碱与胞间通透性和物质转运的关系；乙酰胆碱对质膜 H+-ATPase 活性影响和 ATPase 细胞化学定位；乙酰胆碱酯酶的活性测定和细胞化学定位；烟碱型乙酰胆碱受体的荧光定位等问题进行了探讨。结果表明在黄化玉米幼茎中，由于节的存在，而将幼茎明显得分为两个共质体区，即节上胚芽鞘（内含未展开

11、幼叶）和节下中胚轴。0.1mmol/L 乙酰胆碱处理后，跨节比电阻明显降低，同时不仅外施羧基荧光素累积量增加，而且促进了羧基荧光素的跨节运输，解剖学实验表明，节细胞体积小，原生质浓厚，无液泡或液泡很小、散生，细胞排列方向不规则；而中胚轴细胞较大，具有大液泡，细胞呈长柱状，多少和长轴方向平行排列。质膜 H+-ATPase 素有植物的“主宰酶”和“看家酶”之称，有着重要的生理功能，除了与物质主动运输有关外，还在信号传递中起作用。胞间连丝通透性也受到该酶活性的调节。植物中最初发现的乙酰胆碱的生理功能是棚田效应，即乙酰胆碱引起根分泌 H+，而 H+的分泌和质膜 H+-ATPase 的活性是分不开，IV

12、同时乙酰胆碱在黑暗中即可引起蚕豆气孔开放，气孔开放是一个需能过程，如果用质膜 H+-ATPase 的特异抑制剂钒酸盐预先处理，乙酰胆碱引起的气孔开度明显降低，表明乙酰胆碱可能参与了质膜 H+-ATPase 的活性调节。本研究利用差速离心结合蔗糖密度梯度离心法，分离、纯化了黄化玉米幼苗茎的质膜，质膜 H+-ATPase的特异性抑制剂钒酸钠处理后，质膜 H+-ATPase 活性下降 63.4%，而硝酸钠、叠氮化钠和钼酸钠处理，该酶活性下降很低，表明所得质膜较纯；免疫印迹进一步表明，所提质膜确实含有质膜 H+-ATPase，分子量为 100KD，体外活性测定表明乙酰胆碱可以刺激该酶活性升高，但没有梭

13、壳孢素的作用显著。乙酰胆碱酯酶负责把乙酰胆碱水解为胆碱和乙酸以起到终止信号的作用。乙酰胆碱酯酶活性测定表明节部活性最高，而中胚轴和胚芽鞘（不含幼叶）活性较低，组织化学定位结果显示酶反应产物在节细胞中非常特异的位于核上，而在胚芽鞘和中胚轴中酶反应产物主要位于细胞壁上、细胞间隙和质膜外面。乙酰胆碱酯酶在不同部位起的作用可能不同。动物中，乙酰胆碱功能的发挥要求乙酰胆碱受体的参与，研究表明两种受体（烟碱型和毒蕈碱型）分别通过不同的机制调控不同的生理过程。烟碱型受体的激活直接影响膜对离子的通透性。本文利用荧光定位技术初步证明烟碱型受体存在于黄化玉米幼苗中，主要分布在原生质表面，可能参与了乙酰胆碱的作用。

14、从论文的实验结果得出如下结论：1，乙酰胆碱对胞间通透性和物质运输起调控效应。2，乙酰胆碱对质膜 H+-ATPase 活性具有刺激作用。3，乙酰胆碱酯酶不仅参与了乙酰胆碱得调控物质运输和胞间通讯，而且可能参与了细胞分化和改组。4，黄化玉米幼苗中可能存在 N 型乙酰胆碱受体。关键词：黄化玉米，乙酰胆碱，质膜 H+-ATP 酶，乙酰胆碱酯酶，乙酰胆碱受体，信号传递 英文摘要 VAbstract For survival,higher plants on land must overcome all kinds of environmental stresses.To achieve this end

15、,the plant must act as a whole through material transport and information transmission among its constituent parts.It is the plasmodesmata,the intercellular protoplasmic bridge,that lays the foundation of symplasmic net-work of comunication among the various parts of the whole plant.The permeability

16、 of the plasmodesmata(or the ease of communication),moreover,is regulated by several endogenous and exogenous factors.Acetylcholine(ACh)is the foremost neuro-transmitter in animals.It is assisted by members of the cholingeric system in performance of electro-chemical wave transmission at the neuro-m

17、uscular junction.It has been found that both ACh and members of the cholinergic system are also of wide occurrence in the plant kingdom.While some of the physiological processes regulated by ACh in plants can be ascribed to its action on permeability of the cell membrane,ACh is also effective in reg

18、ulating intercellular material transport and signal transmission.The present investigation along this line employed 4-day old etiolated maize seedling(Zea mays)as experimental material.Its elongated shoot is intercepted by the node into two regions:the upper coleoptile and the lower mesocotyl(fig.1)

19、.The cells constituting the mesocotyl were mostly cylindrical in size and arranged more or less parallel to the long axis;whereas those in the node were shorter in length、arranged irregularly and richer in protoplasmic content.The problems under investigation and their results are summarized as foll

20、ows:1,Comparison of the permeability and material transport at the node and those at the mesocotyl before and after ACh treatment,as determined by electrical resistance measurement and by detecting distribution of the fluorescent probe(CF,carboxyfluoerescein)previously fed at the end of the etiolate

21、d coleoptile.Specific electrical resistance across the node was higher than that across the mesocotyl.Consequently,short nodal cells with lower intercellular permeability retained more CF than that the cylindrical mesocotyl cells.0.1mmol/LACh treatment could increase the permeability of both node an

22、d mesocotyl thus promoting higher rate of CF transport than that of control.Variation in material transport across the node and the mesocotyl,as well as its modulation by ACh treatment,can be largely attributed to differences in their intercellular permeability.2,Effect of ACh on H+-ATPase activity

23、of the plasma membrane,as determined by biochemical analysis and transmission electron microscopy.Purified plasma membrane vesicles were obtained from etiolated corn seedlings by sucrose gradient centrifugation methods,western blotting showed that one band on SDS-PAGE can be recognized by polyclonal

24、 antibody against VIPM H+-ATPase,its molecular weight was 100KD.The activity of PM H+-ATPase was increased after ACh treatment.3,Detection and localization of acetylcholinesterase(AChE)in cells at node,as determined by biochemical analysis and transmission electron microscopy.The activity of AChE wa

25、s higher in node than in mesocotyl and coleoptile.Ultrastructural localization of AChE in node、mesocotyl and coleoptile was carried out using Karnovsky and Root s cytochemical method.AChE of node cell was maily in the nucleus,while AChE was in the cell wall and outside of the plasma membrane in the

26、mesocotyl and coleoptile.It is assumed that AChE from mesocotyl and coleoptile may participate in the material tanslocation and signal transduction regulation by hydrolysising ACh,however AChE from node may be involved in the cell dedifferentiation and reorganization.Localization of nicotinic-ACh-re

27、ceptor(nAChR),as determined by FITC labeled-bungarotoxin.The nAChR was mainly distributed on the surface of protoplasts from etiolated corn seedlings by FITC labeled-bungarotoxin.Keywords：etiolated Zea mays,acetylcholine,plasma membrane H+-ATPase,acetylcholinesterase,nAChR,signal transduction 中国农业大学

28、博士学位论文 VII缩略语表 Abbreviation A C h:A c e t y l c h o l i n e 乙酰胆碱 A C h E:A c e t y l c h o l i n e s t e r a s e 乙酰胆碱酯酶 A C h R:A C h R e c e p t o r s 乙酰胆碱受体 A T C h:A c e t y l t h i o c h o l i n e 硫代乙酰胆碱 A T P A d e n o s i n e t r i p h o s p h a t e 三磷酸腺苷 A t r:A t r o p i n e 阿托品 A W:A c t i

29、o n w a v e 动作电波 B C I P 5-b r o m o-4-c h l o r o-3-i n d o l y l p h o s p h a t e 5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸 B S A B o v i n e s e r u m a l b u m i n 牛血清蛋白 C C C o m p a n i o n c e l l 伴胞 C h A T:C h o l i n e A c e t y l t r a n s f e r a s e 胆碱乙酰转移酶 C L S M C o n f o c a l L a s e r S c a n n i n g M i c

30、 r o s c o p y 激光共聚焦显微术 D T N B:5,5 -d i t h i o-b i s(2-n i t r o b e n z o i c a c i d)E G T A:E t h y l e n e g l y c o l-b i s(-a m i n o e t h y e t h e r)N,N,N,N,-t e t r a c e t i c a c i d F I T C F l u o r e s c e n t i s o t h i o c y a n a t e 异硫氰酸荧光素 G F P G r e e n f l u o r e s c e n t

31、 p r o t e i n 绿色荧光蛋白 H u p A H u p e r z i n e A 石杉碱甲 M P M o v e m e n t p r o t e i n 运动蛋白 M u s:M u s c a r i n e 毒蕈碱 N B T p-N i t r b u l u e t e t r a z o l i u n c h l o r i d e 氮蓝四唑 N e o:N e o s t i g m i n e 新斯的明 N i c:N i c o t i n e 烟碱 P D P l a s m a d e s m a t a 胞间连丝 P-p r o t e i n

32、P h l o e m p r o t e i n 韧皮蛋白 P V P:P o l y v i n y l p y r r o l i d o n e 聚乙烯砒咯烷酮 S D S-P A G E S o d i u m d o d e c y l s u l f a t e p o l y a c r y l a m i d e 十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺 S E S i e v e e l e m e n t 筛分子 S E L S i z e e x c l u s i o n l i m i t 分子扩散上限 S T S i e v e t u b e 筛管中国农业大学博士学位论文 1

33、第一章 文献综述 不论是单细胞绿藻还是多细胞的高大树木，无时不在对抗热力学第二定律。一方面要从其环境中不断地吸收必要的营养，另一方面又必须不断地把体内的物质和能量相互传递，信息相互沟通，才能维持植物的生存、生活和生长。植物不象动物，可以主动逃避不利环境的侵害。植物植立不动，时刻遭受到外界风云变幻的环境刺激，为了生存，植物细胞间必须有密切的联系和通讯，迅速地对外界刺激作出反应，才能维持植物整体中各部分功能的协调与合作，完成其生活史。位于细胞壁中，由质膜围绕紧缩态内质网形成的“原生质桥梁”胞间连丝就起着“绿色电缆和运输线”的作用。胞间连丝为胞间信号的传递和胞间物质的转移提供了直接与便捷的共质体途径

34、，构成了原生质的连续性。物质转移和信息传递在植物生命活动中发挥着生命枢纽作用，是植物的命脉。胞间连丝作为植物体内“绿色电缆和运输线”是物质转移和信息传递的交通要道。胞间连丝不仅控制细胞代谢物和小分子的胞间扩散，而且能有选择地控制和调节某些大分子的胞间转移，而这些大分子的定向运输是与植物的发育进程息息相关的。另外，病毒大分子也是通过胞间连丝进行转移而实现其系统侵染的。研究胞间连丝的结构及其调控机理对了解植物的发育进程，衰老器官物质的再分配、再利用，提高经济指数奠定理论基础。如最近，Ruan 等（2001）研究表明，单根棉纤维的长度决定于与之相邻细胞间的胞间连丝的开关。另外，胞间连丝调控机理的阐明

35、对植物病原互作关系可以得到进一步的了解，为作物抗病育种提供理论基础。显而易见，胞间连丝功能的研究不仅具有重要的理论意义，而且有其广阔的应用前景。目前国内外对胞间连丝大分子转移的机制研究方兴未艾，是植物学领域研究的热点之一。乙酰胆碱在动物神经冲动传递中是一种重要的神经递质。乙酰胆碱在植物界广泛存在，并且具有重要的生理功能。乙酰胆碱作为递质在植物中，最早由 Lou（1998）在丝瓜卷须的快速运动中得到证明；乙酰胆碱作为调质在蚕豆气孔运动中也有大量报道。下面就对这方面的进展作一综述。1.细胞间连接 由多细胞构成的一切生物，细胞间的物质必须相互交换，信息相互交流，能量相互流通才能保证机体的生长发育。细

36、胞间通讯主要通过细胞连接得以实现。动物中的细胞连接主要有：紧密连接（图 1）、锚定连接、间隙连接和桥粒（图 2）。动物主要靠这四种连接完成生命活动。植物每个细胞外面都有一个盒式细胞壁包被，细胞间通过穿越胞壁的胞间连乙酰胆碱对黄化玉米幼苗物质跨节运输的调控效应 2丝（图 3）将相邻两细胞连接起来（http:/ 1 图 2 图 3 1879 年坦戈（Tangl）首先提出细胞间存在微小的连接物胞间连丝。1930 年 Mnch进一步提出共质体的概念。他提出植物细胞之间由于胞间连丝的桥梁作用，把细胞之间原生质串通起来，形成一个通讯传递的网络。1976 年 Gunning 和 Robards 对胞间连丝的

37、结构、功能和分布作了较好的综述。近些年来，随着分子生物学的发展和实验手段的精细，对胞间连丝的结构和功能有了更深地了解。胞间连丝不是一个被动的、一成不变的、只能允许小分子及离子自由扩散的、中空的细管，胞间连丝有其精细的亚细胞结构，是一种超分子复合物，由膜和蛋白质组成，随着生长发育、内外环境信号的刺激可以发生结构的动态变化，行使特定条件下的特定功能。胞间连丝不仅具有控制细胞间代谢物和小分子扩散的能力，而且能控制和调节内外源的蛋白质（如病毒蛋白、植物体内源运动蛋白）和核酸（内源 mRNA 和病毒 DNA、RNA）及其复合体的胞间运输。这些携带特定功能和特定信息的大分子物质经过胞间连丝的定向运输实现基

38、因表达的位置效应。2.胞间连丝的结构、组成及其动态性 胞间连丝功能的实现离不开其复杂的结构基础。在讨论胞间连丝的功能之前，阐明其结构组成至关重要。现在普遍认同的是 Ding 等（1992）采用快速冷冻固定取代技术所观察到的双子叶植物烟草的胞间连丝亚结构以及结合计算机辅助图像分析技术提出的模型：胞间连丝是一个复杂的由相邻两细胞的质膜形成的孔道，在其中间有压缩的内质网所形成的圆柱体，通常称连丝微管。在质膜的内侧和压缩内质网外侧分布有大约 3nm 的蛋白质颗粒。压缩内质网颗粒可能以螺旋状或线圈状排列。这两种蛋白被另一种类似辐条状的连接蛋白把直径 8-10nm 的胞质孔环进一步分为许多孔径约为 2.5

39、nm 的微小管道。这些微小管道类似于分子筛，它决定着胞间连丝的分子扩散上限（Size Exclusion imit，SEL），辐条状分布细丝的动态变化，影响着胞质孔环的有效直径，从而调节胞间连丝的通透性。在正常的生理条件下，胞间连丝 SEL 约为 800-1000Dalton，如此对应的分子半径约为 0.7-0.8nm或更小的分子才能在胞间自由扩散。Tilney 等（1991）以 Onoclea sensibilis 为材料利用细中国农业大学博士学位论文 3胞质壁分离、Triton X 抽提和蛋白酶酶解的方法对连丝微管的结构及连丝微管和胞间连丝结构进行了研究，认为连丝微管对胞间连丝的稳定性必不

40、可少，决定了胞间孔道的直径和大小。一些胞间连丝，在紧贴孔口处的细胞壁上可观察到括约肌状的颈区结构。利用细胞化学定位的方法研究胞间连丝颈区“括约肌”结构时，发现这一区域的酶活性较高，有-淀粉酶，ATPase，过氧化物酶等，这些酶的存在说明颈区在调节物质运输和信息传递中起着关键性的作用。但是，现有的胞间连丝模型主要建立在固定包埋材料的超微结构的观察分析上。控制运输的信号和物质以及颈区调节运输的机理还不清楚。只有彻底了解了胞间连丝结构的生化组成，及其动态变化才能真正明了调节运输的机理。限于 胞间连丝的结构细微，这方面知识还很贫乏。Taiz 和 Jones（1973）曾用酶解的方法从大麦糊粉层细胞中得

41、到未被完全消化的胞壁残骸，其中含有胞间连丝。但未对其生化组成进行很好的分析。随着动物胞间通道间隙连接（gap junction）研究的不断深入，植物胞间连丝的研究从中得到很大发展。Meiners 等（1987）用免疫印迹的方法证明植物胞间连丝与动物间隙连接之间有许多相似性。如功能上的相似，即二者均各自在植物和动物体内执行胞间的物质交流与信息传递；某些电学特性相似；对二者 SEL 影响因素相似；以及都可被蛋白激酶 C 效应物负调节等。因而认为，胞间连丝相关蛋白（plasmodesmatal associated proteins,PAPs）与间隙连接蛋白之间存在着生化同源性。Moner 和 Kl

42、oth（1991）利用电子显微镜观察和酶学处理相结合的方法报道胞壁残骸富含 28KD 和 43KD 的蛋白质，并推测这些蛋白质可能参与了胞间连丝的结构组成。Yahalom 等人（1991）进一步用玉米中胚轴进行免疫细胞化学研究时，采用亲和纯化的抗 Connexin32 和抗 Connexin43 的抗体，经免疫金定位表明，玉米中胚轴胞间连丝上含有两种与 Connexins 抗体起交叉反应的蛋白质。与 Connexin32 抗血清起交叉反应的 Mr 为 27KDa 的胞间连丝相关蛋白称为 PAP27，与 Connexin43 抗血清起交叉反应的 Mr 为 26KDa 的胞间连丝相关蛋白称为 PA

43、P26。以组织匀浆与梯度离心处理后，结果 PAP26 只与细胞壁组分相关，而 PAP27 不但与胞壁组分相关，也与膜的可溶性组分相关，免疫细胞化学的结果表明，PAP26 沿着包括胞间连丝孔口（orfice）附近的质膜部分在内的整个胞间连丝分布；而 PAP27 则分布在胞间连丝外围部分，是一种外周膜蛋白（Yahalom等，1991）。潘照明等（1993）用抗 32KD 间隙连接蛋白的抗体和玉米中胚轴纯化细胞壁进行免疫杂交，发现二者有反应。推测 50KD 和 62KD 两种多肽可能与胞间连丝结构有关。Zhang 等（1990）用 DGD 包埋、去包埋剂制片术显示有成束微丝跨越分界壁的分布。Whit

44、e 等（1994）用化学固定结合免疫电镜发现 Actin 定位于胞间连丝处。Overall 等（1996）进一步用 CB 处理后，胞间连丝发生膨胀，证明肌动蛋白和肌球蛋白环绕在连丝微管上，对连丝微管起稳定作用，进而稳定胞间连丝的结构。Radford 和 White(1998)的实验间接证明了胞间连丝上有Myosin的分布，他们以洋葱、玉米和拟南芥幼苗为材料，用动物Myosin抗体同胶体金结合制备免疫电镜样品，发现在胞质和胞间连丝上有胶体金标记颗粒，从而乙酰胆碱对黄化玉米幼苗物质跨节运输的调控效应 4表明胞间连丝上可能存在 Myosin。随着分离、纯化细胞壁组分的方法不断改进，以及显微注射技术的

45、应用，加快了胞间连丝相关蛋白的研究。研究表明，PAP 包括肌动蛋白（White 等，1994）、肌球蛋白（Radford等，1998）、蛋白激酶（Citovsky 等，1993；Sokolova 等，1997）等类似的蛋白质，至于这些蛋白质在胞间连丝上的精确定位以及在胞间物质运输中的作用尚待进一步研究。Ding 等（1996）以烟草（Nicotiana tabacum）为材料，利用显微注射技术研究肌动蛋白纤丝（actin filaments,AFs）在胞间连丝运输中的作用。把不同分子量的荧光标记葡聚糖和 CD 或 Profilin 一同注入烟草叶肉细胞，35min 内 Mr 为 20KDa 的

46、葡聚糖由注射细胞向周围细胞转移；但当单独注射葡聚或与鬼笔环肽（phalloidin）一同注射时，葡聚糖不发生转移。这些结果均表明，AFs 参与了胞间连丝的运输调节。另外，利用 BDM（2、3butanedione monoxime）对植物材料进行预处理，超微结构上观察到胞间连丝的颈口比对照缩小（Baskin 等，1992）。已知 BDM 在动物细胞中的作用是抑制 actin/myosin 的相对滑动，使 actin/myosin/ADP/Pi 的组成比例处于稳定状态，因此人们推测 BDM 在植物细胞中有可能起到同样重要的作用，从而使 actin/myosin 复合物处于紧张态构型而不易滑动，导

47、致胞间连丝颈口缩小（Crawford 等，1999）。鉴于 actin/mysin 在胞间连丝上的免疫金定位结果，推测胞间连丝之所以允许大于它自身 SEL 的大分子通过，也许是由于 actin/myosin 相互作用支配着胞间连丝孔径扩张的结果，所以，很有可能微丝限制着胞间连丝的孔径，一旦微丝被解聚或 myosin 沿着微丝的运动受抑制，最终会导致胞间连丝孔径增大。张伟成等（1997）在正常发育的珠被组织中也观察到单个微丝横贯分界壁而连接相邻细胞骨架的景象。苗龙等（1999）以烟草腺毛为材料用显微注射荧光标记的鬼笔环肽的方法发现有微丝穿越胞间通道的迹象。王冬梅等（2000）研究表明蒜瓣鞘胞间连

48、丝上存在微丝。这些研究表明胞间连丝结构的生化组成是复杂的，同动物间隙连接可能有一定的同源性。肌动蛋白-肌球蛋白不仅是胞间连丝的结构蛋白，而且可能参与了胞间连丝通透性调节和大分子的运输。胞间连丝相关蛋白的研究仍处于探索阶段，对其亚细胞定位的研究日益受到重视。一旦搞清楚胞间连丝的分子组成（包括其性质、定位及基因结构），则将会大大促进植物体内胞间物质运输、信息传递与病毒转移机理的研究。在今后的研究工作中，筛选胞间连丝结构组分的突变体，克隆相关基因是了解胞间连丝分子组成生化特性的一项重要措施。Russin等人（1996）的研究表明，在玉米的蔗糖运输缺陷（sed1）突变体中，小叶脉维管组织中鞘细胞与薄壁

49、细胞之间的胞间连丝结构发生畸变，推测这种畸形变化与叶片外运蔗糖能力的损失有关。另外，在表达酵母酸性转化酶基因的转基因烟草中，随植株不断成熟，在叶肉细胞间形成了分枝的次生胞间连丝（Ding 等，1993）。这些研究均表明，利用分子生物学手段，我们有可能获得在胞间连丝结构与功能加以修饰的有价值的植物材料，而这种修饰只发生在特定的区域，而其他部位细胞间的胞间连丝不受影响（Ding 等，1993；Russin中国农业大学博士学位论文 5等，1996），这便意味着胞间连丝组分的基因表达具有组织器官的特异性。绿色荧光蛋白（GFP）的应用将会促进这方面的研究工作（Chalfie 等，1994；Itaya 等

50、，1997）。娄成后等（1956，1962，1973，1981）在长期研究的基础上，提出在高等植物组织的不同部位的发育的不同时期，胞间连丝历经结构修饰和生理变化，为开放态、可控态和封闭态，参与胞间物质运输和信号传递。封闭态存在于休眠组织，胞间交通断绝；可控态存在于正常组织，连丝内部有细微结构，连接邻近细胞的原生质，通常只允许 1KD 以下小分子通过，但经过诱导，病毒的核酸也可以通过；开放态存在于一些植物胚胎和衰退组织，胞间连丝内部结构消失，允许原生质与大分子团粒以自身的运动穿过（即核穿壁）。以下是 较经典的胞间连丝的结构模型图和计算机重组的三维结构模式图。（Robards and Lucas,