第二章第二节基因克隆的载体PPT讲稿.ppt

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1、第二章第二节基因克隆的载体第1页，共73页，编辑于2022年，星期三第二节第二节 基因克隆的载体基因克隆的载体 载体的概念及特点载体的概念及特点 质粒载体（质粒载体（plasimid vectors）噬菌体载体（噬菌体载体（phage vectors）柯斯质粒载体（柯斯质粒载体（cosmid vectors）第2页，共73页，编辑于2022年，星期三引引 言言载体（载体（vector）：能携带目的基因进入宿主细胞进行）：能携带目的基因进入宿主细胞进行 扩扩增和表达的工具。增和表达的工具。作为基因克隆的载体必须具备以下特性：作为基因克隆的载体必须具备以下特性：A.能在寄主细胞中进行独立的复制和表

2、达；能在寄主细胞中进行独立的复制和表达；B.具有具有1-2个选择标记基因，如对抗生素的抗性基因等；个选择标记基因，如对抗生素的抗性基因等；C.具备多克隆位点（具备多克隆位点（Multiple Clone Sites，MCS），而且），而且可携带外源可携带外源DNA片段的长度范围较宽片段的长度范围较宽;D.自身分子量较小，在寄主细胞中的拷贝数高，易于自身分子量较小，在寄主细胞中的拷贝数高，易于操作和操作和DNA的制备。的制备。E.具有较好的安全性，不能任意转移。具有较好的安全性，不能任意转移。第3页，共73页，编辑于2022年，星期三载体的分类载体的分类根据载体工作方式的不同可分为根据载体工作方

3、式的不同可分为质粒载体质粒载体（plasimid vectors）、噬菌体载体（）、噬菌体载体（phage vectors）、）、噬菌体噬菌体-质粒杂合载体（考斯质粒）质粒杂合载体（考斯质粒）第4页，共73页，编辑于2022年，星期三质粒的概念：质粒是一种广泛存在于细菌细胞中独立于质粒的概念：质粒是一种广泛存在于细菌细胞中独立于染染色体以外色体以外的能的能自主的复制自主的复制的裸露的遗传物质。的裸露的遗传物质。大多数质粒是闭合环大多数质粒是闭合环状双链状双链DNA分子，分子，比病毒更简单。在霉比病毒更简单。在霉菌、蓝藻、酵母和一菌、蓝藻、酵母和一些动植物细胞中也发些动植物细胞中也发现了质粒。现

4、了质粒。一一 质粒载体（质粒载体（plasimid vectors）第5页，共73页，编辑于2022年，星期三 质粒的特点质粒的特点（1）自主复制性。）自主复制性。质粒含有自己的复制起质粒含有自己的复制起始位点（始位点（Origin,简称简称ori），有些质粒具有），有些质粒具有独立的复制子结构（独立的复制子结构（Replicon），因此，），因此，质粒质粒DNA可以自主复制，形成少则几个多可以自主复制，形成少则几个多则成百上千个拷贝。则成百上千个拷贝。（2）可扩增性。）可扩增性。在格兰氏阴性细菌中，质在格兰氏阴性细菌中，质粒的复制一般有两种复制形式，即严紧型粒的复制一般有两种复制形式，即严紧

5、型（Stringent）和松弛型（）和松弛型（Relaxed）。）。第6页，共73页，编辑于2022年，星期三质粒的复制类型：质粒的复制类型：一种质粒在宿主细胞中一种质粒在宿主细胞中存在的数目称为该质粒的存在的数目称为该质粒的拷贝数拷贝数。根据拷。根据拷贝数的多少将质粒分为两种复制型：贝数的多少将质粒分为两种复制型：“严紧严紧型型”质粒质粒（stringent plasmid）,拷贝数为拷贝数为1-5；“松弛型松弛型”质粒（质粒（relaxed plasmid）,拷贝拷贝数为数为6-606-60。不过，即使是同一质粒，其拷。不过，即使是同一质粒，其拷贝数在不同的寄主细胞间也可能有很大的贝数在不

6、同的寄主细胞间也可能有很大的变化。变化。第7页，共73页，编辑于2022年，星期三严紧型质粒（严紧型质粒（Stringent）：这类质粒的复制）：这类质粒的复制由细胞内由细胞内DNA聚合酶聚合酶介导，并被质粒上编介导，并被质粒上编码的蛋白因子正调控，由于这些蛋白因子极码的蛋白因子正调控，由于这些蛋白因子极不稳定使得每个细胞只能复制少数几个质粒不稳定使得每个细胞只能复制少数几个质粒拷贝，一般把一个细胞内拷贝数少于拷贝，一般把一个细胞内拷贝数少于5个的个的质粒称为严紧型质粒。质粒称为严紧型质粒。松弛型质粒（松弛型质粒（Relaxed）：这类质粒的复制需要半）：这类质粒的复制需要半衰期较长的衰期较长

7、的DNA聚合酶聚合酶、RNA聚合酶及其他复聚合酶及其他复制辅助蛋白因子，这类质粒在宿主细胞中一般制辅助蛋白因子，这类质粒在宿主细胞中一般可达到可达到3050个拷贝，所以称为松弛型质粒。个拷贝，所以称为松弛型质粒。第8页，共73页，编辑于2022年，星期三质粒的氯霉素扩增：当宿主细胞进入生质粒的氯霉素扩增：当宿主细胞进入生长后期，加入长后期，加入氯霉素可以抑制宿主细胞氯霉素可以抑制宿主细胞蛋白质的生物合成，阻断宿主菌的大部蛋白质的生物合成，阻断宿主菌的大部分代谢途径，分代谢途径，松弛型质粒就能利用丰富松弛型质粒就能利用丰富的原料及能量进行复制，最终每个细胞的原料及能量进行复制，最终每个细胞就能累

8、积上千个就能累积上千个DNA分子，把这种操作分子，把这种操作称为质粒的氯霉素扩增。称为质粒的氯霉素扩增。第9页，共73页，编辑于2022年，星期三（3）可转移性。）可转移性。在移动基因在移动基因mob、转移基因转移基因tra、顺、顺式作用元件式作用元件bom等因子的作用下，许多野生型等因子的作用下，许多野生型质粒可以通过细胞的接合（质粒可以通过细胞的接合（conjugation）作用）作用从一个宿主细胞转移到另一个宿主细胞中。从一个宿主细胞转移到另一个宿主细胞中。第10页，共73页，编辑于2022年，星期三（4）不相容性。具有相同或相似复制子结）不相容性。具有相同或相似复制子结构及特征的两种不

9、同的质粒不能稳定的构及特征的两种不同的质粒不能稳定的存在于同一个受体细胞的现象称为质粒存在于同一个受体细胞的现象称为质粒的不相容性（的不相容性（incompatibility）。）。细胞分裂细胞分裂第11页，共73页，编辑于2022年，星期三理想质粒的改造与构建理想质粒的改造与构建（1）删除不必要的）删除不必要的DNA区域。尽量缩小质粒区域。尽量缩小质粒的相对分子量，以提高外源的相对分子量，以提高外源DNA的装载量；的装载量；一般大于一般大于20Kb的质粒转化率很低而且不稳定。的质粒转化率很低而且不稳定。（2）灭活某些质粒的编码基因。如灭活编码）灭活某些质粒的编码基因。如灭活编码质粒转移的质粒

10、转移的mob基因以提高质粒的安全性，基因以提高质粒的安全性，灭活对质粒的复制产生负调控的基因，以提灭活对质粒的复制产生负调控的基因，以提高质粒的拷贝数。高质粒的拷贝数。第12页，共73页，编辑于2022年，星期三（3）加入易于识别的选择标记基因。）加入易于识别的选择标记基因。选择标记基因：选择标记基因：在基因工程中的一类用于在基因工程中的一类用于选择转化细胞（菌）的抗性基因，通过选择转化细胞（菌）的抗性基因，通过在培养基中加入特定的抗生素就可以筛在培养基中加入特定的抗生素就可以筛选得到转化的细胞（菌）。选得到转化的细胞（菌）。常用的抗生素抗性基因有：常用的抗生素抗性基因有：Ampr(氨苄氨苄青

11、霉素抗性基因青霉素抗性基因)、Kanr(卡那霉素抗性卡那霉素抗性基因基因)、Tetr(四环素抗性基因四环素抗性基因)、Cmr 或或cat(氯霉素抗性基因氯霉素抗性基因)、Neor(新霉素抗性新霉素抗性基因基因)；第13页，共73页，编辑于2022年，星期三LacZM15缺失第缺失第11-41位的氨基酸位的氨基酸LacZ N端端140个氨个氨基酸基酸LacZMCS140个氨基酸个氨基酸+MCSLacZ1024个氨基酸个氨基酸LacZM15F质粒质粒载体载体LacZE.coliLacZ M15+LacZX-galLacZ M15+LacZDNAX-gal筛选标记基因：筛选标记基因：-互补互补第14

12、页，共73页，编辑于2022年，星期三 大大肠肠杆杆菌菌-半半乳乳糖糖苷苷酶酶 可可以以和和其其底底物物X-Gal 相相互互作作用用并并且且释释放放出出一一种种蓝蓝色色物物质质，当当该该酶酶的的-片片段段和和-片片段段分分开开时时就就失失去去了了这这种种显显色色的的功功能能。通通常常将将缺缺失失了了第第11-41位位氨氨基基酸酸的的编编码码 片片段段的的LacZM15构构建建在在F质质粒粒上上先先转转入入大大肠肠杆杆菌菌中中，而而将将编编码码该该酶酶N端端140个个氨氨基基酸酸的的-片片段段的的LacZ基基因因插插入入到到载载体体的的多多克克隆隆位位点点的的侧侧翼翼序序列列中中。当当含含有有L

13、acZ基基因因的的载载体体导导入入到到这这类类寄寄主主细细胞胞中中时时，载载体体编编码码的的 -片片段段就就能能和和寄寄主主编编码码的的 片片段段发发生生互互补补并并具具有有了了对对底底物物X-gal的的作作用用功功能能（发发生生显显色色反反应应），这这种种现现象象被被称称为为是是 -互互补补（alpha-complementation）.将这种筛选方式称为蓝白斑筛选）将这种筛选方式称为蓝白斑筛选）第15页，共73页，编辑于2022年，星期三蓝白斑筛选第16页，共73页，编辑于2022年，星期三（4）在筛选标记基因内引入具有多种限制性内切酶识）在筛选标记基因内引入具有多种限制性内切酶识别及切割

14、位点，即多克隆位点（别及切割位点，即多克隆位点（Multiple Clone Site,即即MCS）,便于外源基因的重组；便于外源基因的重组；多克隆位点多克隆位点(MCS)：克隆载体中的一段用于插入外源克隆载体中的一段用于插入外源DNA片段的特定区域，由一系列的紧密相连的限片段的特定区域，由一系列的紧密相连的限制性内切酶位点组成，而且每个限制性内切酶位制性内切酶位点组成，而且每个限制性内切酶位点应该在整个载体中是唯一的。点应该在整个载体中是唯一的。（5）根据外源基因克隆和表达的不同要求，加）根据外源基因克隆和表达的不同要求，加装特殊的基因表达调控元件。装特殊的基因表达调控元件。第17页，共73

15、页，编辑于2022年，星期三质粒的分类：质粒的分类：根据其功能和用途将人工根据其功能和用途将人工构建的质粒分为以下几类：构建的质粒分为以下几类：克隆质粒、测序质粒、整合质粒、穿克隆质粒、测序质粒、整合质粒、穿梭质粒、探针质粒、表达质粒梭质粒、探针质粒、表达质粒等。等。第18页，共73页，编辑于2022年，星期三质粒的种类及用途质粒的种类及用途（1 1）克隆质粒。）克隆质粒。用于用于克隆和扩增外源基因克隆和扩增外源基因。第19页，共73页，编辑于2022年，星期三（2）测序质粒。）测序质粒。有有MCS，并在，并在MCS两端设有两端设有两个不同的引物，两个不同的引物，便于便于DNA测序。测序。如如

16、pUC18/19。第20页，共73页，编辑于2022年，星期三（3）整合质粒。）整合质粒。含有整合酶编码基因及整合特含有整合酶编码基因及整合特异性的位点序列，克隆在这类质粒上的基因在异性的位点序列，克隆在这类质粒上的基因在进入宿主细胞后能准确的重组整合在受体细胞进入宿主细胞后能准确的重组整合在受体细胞染色体基因组的特定位点上。染色体基因组的特定位点上。（4）穿梭质粒。）穿梭质粒。这类质粒含有两种不同的复制这类质粒含有两种不同的复制子结构及相应的选择标记性基因，因此能在两子结构及相应的选择标记性基因，因此能在两种不同的种属细胞中复制并检测。如大肠杆菌种不同的种属细胞中复制并检测。如大肠杆菌-链霉

17、菌穿梭质粒，大肠杆菌链霉菌穿梭质粒，大肠杆菌-酵母菌穿梭质粒。酵母菌穿梭质粒。（5）探针质粒。）探针质粒。这类载体用来构建或筛选克隆这类载体用来构建或筛选克隆基因的表达调控元件，如启动子和终止子。基因的表达调控元件，如启动子和终止子。第21页，共73页，编辑于2022年，星期三（6）表达质粒。）表达质粒。这类质粒在这类质粒在MCS的上游的上游和下游分别装有两套转录效率较高的启和下游分别装有两套转录效率较高的启动子、合适的核糖体结合位点（动子、合适的核糖体结合位点（SD-序列）序列）以及强有力的终止子结构使得克隆在合以及强有力的终止子结构使得克隆在合适位点上的任何外源基因均能在受体细适位点上的任

18、何外源基因均能在受体细胞中高效表达，如胞中高效表达，如pET系列质粒。系列质粒。第22页，共73页，编辑于2022年，星期三第23页，共73页，编辑于2022年，星期三质粒DNA的提取与纯化第24页，共73页，编辑于2022年，星期三大肠杆菌基因组大肠杆菌基因组DNA 第25页，共73页，编辑于2022年，星期三一、质粒DNA的提取第26页，共73页，编辑于2022年，星期三plasmid DNAThe genomic DNA of E.coli:a single circular double-stranded DNA,with the contour length about 850 ti

19、mes longer than the cell.Genomic DNA 第27页，共73页，编辑于2022年，星期三闭合环状的质粒闭合环状的质粒DNA，在变性后不会分离，在变性后不会分离，复性快；复性快；（1）原理1.碱裂解法提取质粒碱裂解法提取质粒DNADNA双链双链变性变性DNA单链单链复性复性强碱强碱中性中性第28页，共73页，编辑于2022年，星期三染色体染色体线性线性DNA和或和或有缺口有缺口的质粒的质粒DNA变变性后双链分离，难以复性而形成缠绕的结构，性后双链分离，难以复性而形成缠绕的结构，与蛋白质与蛋白质SDS复合物结合在一起，在离复合物结合在一起，在离心的时候心的时候沉淀沉淀

20、下去。下去。变性变性第29页，共73页，编辑于2022年，星期三碱变性法这种方法是根据共价闭合环状质粒DNA与线性染色体DNA片段之间，在拓扑学上的差异而发展出来的。通过加热，尤其是在pH值介于12.012.5这个狭窄的范围内，连接DNA互补链之间的氢键会被断裂，但由于cccDNA的双螺旋主链骨架的彼此盘绕作用，互补的两条链仍然会紧密地结合在一起。通过致冷或恢复中性pH值更会迅速地复性，复性迅速而准确。线性的染色体DNA分子，在此过程中彼此已经分离开来的互补链之间的复性作用就不会那么迅速而准确。它们聚集形成的网状结构，通过离心分离便会与变性的蛋白质及RNA一道沉淀下来。仍然滞留在上清液中的质粒

21、cccDNA则可用酒精沉淀法收集。第30页，共73页，编辑于2022年，星期三（2）所用的试剂作用所用的试剂作用 溶菌酶溶菌酶能水解菌体细胞壁的主要化学成分能水解菌体细胞壁的主要化学成分肽聚糖肽聚糖中的中的-1，4糖苷键糖苷键。在碱性条件（在碱性条件（pH8）下有活性。）下有活性。葡萄糖葡萄糖增加溶液的增加溶液的粘度粘度，维持，维持渗透压渗透压，防止，防止DNA受机械力（震荡）的作用而降解。受机械力（震荡）的作用而降解。第31页，共73页，编辑于2022年，星期三EDTAMg2+、Ca 2+的螯合剂，可抑制的螯合剂，可抑制DNA酶酶的活的活性，防止性，防止DNA被酶降解。被酶降解。NaOH-S

22、DSNaOH：强碱，提供：强碱，提供pH12的碱性条件，使的碱性条件，使DNA双链双链变性变性。SDS:溶解细胞膜蛋白和细胞内蛋白，并结合成溶解细胞膜蛋白和细胞内蛋白，并结合成“蛋白蛋白SDS”复合物复合物，使蛋白质（包括，使蛋白质（包括DNA酶）变性沉淀。酶）变性沉淀。第32页，共73页，编辑于2022年，星期三用冰醋酸将醋酸钠溶液的用冰醋酸将醋酸钠溶液的pH调到调到4.8。用来用来中和中和NaOH变性液，使变性液，使DNA复性。复性。高浓度的高浓度的NaAc有利于变性的大分子（蛋白有利于变性的大分子（蛋白质、质、DNA、RNA等）沉淀。等）沉淀。用于用于沉淀沉淀DNA。乙醇乙醇DNA分子以

23、分子以水合状态水合状态“溶于溶于”水里，乙水里，乙醇能夺去醇能夺去DNA分子的水环境。分子的水环境。NaAc-HAc缓冲液第33页，共73页，编辑于2022年，星期三 RNase A降解降解RNA渣滓。渣滓。以免提取后的以免提取后的DNA中含有小分子的中含有小分子的RNA。TE缓冲液缓冲液DNA保存液。保存液。由由Tris-HCl和和EDTA配制。配制。Tris-HCl不含金属离子（不同于磷酸缓冲液或不含金属离子（不同于磷酸缓冲液或硼酸缓冲液），有利于以后操作；硼酸缓冲液），有利于以后操作；EDTA抑制抑制DNA酶，防止酶，防止DNA被酶降解。被酶降解。第34页，共73页，编辑于2022年，星

24、期三蛋白变性剂蛋白变性剂，进一步抽提，进一步抽提DNA溶液中的蛋白质，溶液中的蛋白质，使蛋白质沉淀。使蛋白质沉淀。但苯酚会残留在但苯酚会残留在DNA溶液中。溶液中。（现多用各种商品化的（现多用各种商品化的层析柱层析柱纯化纯化DNA)。酚酚-氯仿氯仿选用选用以上试剂有商业试剂盒；也以上试剂有商业试剂盒；也可以自己配制。可以自己配制。第35页，共73页，编辑于2022年，星期三（3）碱裂解法提取质粒）碱裂解法提取质粒DNA的步骤的步骤 Solution I 的配制：的配制：使用使用“溶液溶液”溶解细菌细胞壁。溶解细菌细胞壁。第一步：溶菌第一步：溶菌50mM葡萄糖，葡萄糖，25mM Tris-HCl

25、(pH8.0)，10mM EDTA，4-5mg/ml溶菌酶溶菌酶，RNase A（5-10mg/L）第36页，共73页，编辑于2022年，星期三溶液溶液II 破坏细胞膜，蛋白质和破坏细胞膜，蛋白质和DNA变性。变性。第二步：破膜，蛋白质和DNA变性Solution II 的配制：的配制：第三步：中和第三步：中和溶液溶液III使使DNA复性、并促使蛋白质复性、并促使蛋白质-SDS复合复合物和染色体物和染色体DNA、RNA沉淀。沉淀。Solution III的配制：的配制：0.4N NaOH，2.0%SDS3M 醋酸钠（用冰醋酸调醋酸钠（用冰醋酸调pH至至4.8）第37页，共73页，编辑于2022

26、年，星期三最重要的是：最重要的是：2.影响质粒影响质粒DNA产量的因素产量的因素菌株的遗传背景，菌株的遗传背景，质粒自身的拷贝数。质粒自身的拷贝数。一般要使用一般要使用endA基因基因发生突变的大肠杆菌菌发生突变的大肠杆菌菌株。如株。如DH5、JM109、XL1-Blue等。等。（1）受体菌株）受体菌株endA基因编码基因编码核酸内切酶核酸内切酶，在在Mg2+的存在下可将的存在下可将双链双链DNA消化成消化成7bp的寡核苷酸片断。的寡核苷酸片断。第38页，共73页，编辑于2022年，星期三这是直接决定这是直接决定DNA产量的重要因素之一。产量的重要因素之一。（3）质粒大小）质粒大小分子量大的质

27、粒，拷贝数少。分子量大的质粒，拷贝数少。（2）质粒拷贝数）质粒拷贝数质粒本身的性质所决定质粒本身的性质所决定。第39页，共73页，编辑于2022年，星期三pBR3224363连接加反应液Tet or AmpTet+AmpCK+2.质粒载体相关知识介绍质粒载体相关知识介绍第40页，共73页，编辑于2022年，星期三质粒的存在形式：质粒的存在形式：有超螺旋、开环双螺旋和线状双有超螺旋、开环双螺旋和线状双螺旋三种。螺旋三种。双螺旋共价闭合环双螺旋共价闭合环（超螺旋）（超螺旋）covalently closed circular DNA,简称简称cccDNA开环双螺旋（一个开环双螺旋（一个裂口）裂口）

28、open circular DNA,简称简称ocDNA线状双螺旋（两个裂线状双螺旋（两个裂口）口）linear DNA,简称简称L-DNA第41页，共73页，编辑于2022年，星期三三种形式的质粒在琼脂糖凝胶电泳中三种形式的质粒在琼脂糖凝胶电泳中的分离情况的分离情况第42页，共73页，编辑于2022年，星期三第二节第二节 基因克隆的载体基因克隆的载体引引 言（言（introduction）一一 质粒载体（质粒载体（plasimid vectors）二二 噬菌体载体（噬菌体载体（phage vectors）三三 柯斯质粒载体（柯斯质粒载体（cosmid vectors）第43页，共73页，编辑于

29、2022年，星期三二二 噬菌体载体噬菌体载体（phage vectors）1、噬菌体的生物学特性噬菌体的生物学特性2、噬菌体载体噬菌体载体3、M13噬菌体的生物学特性噬菌体的生物学特性4、M13噬菌体载体噬菌体载体第44页，共73页，编辑于2022年，星期三1.噬菌体的生物学特性噬菌体的生物学特性The Phage consist of a linear chromosome enclosed in a protein coat(capsid,衣衣壳壳).When the phage infecting the host cells,it injects its DNA into the ho

30、st bacterium.第45页，共73页，编辑于2022年，星期三1.噬菌体的生物学特性噬菌体的生物学特性 噬菌体的生长周期可分为噬菌体的生长周期可分为溶菌周期（溶菌周期（Lytic cycle）和和溶溶原周期（原周期（Lysogenic cycle）两种类型。两种类型。前者指前者指噬菌体将噬菌体将DNADNA注入寄主细胞后很快环化，然后进行自我复制、蛋白衣壳合注入寄主细胞后很快环化，然后进行自我复制、蛋白衣壳合成和新噬菌体颗粒的组装，最后使寄主细胞破裂而释放出大成和新噬菌体颗粒的组装，最后使寄主细胞破裂而释放出大量的子代噬菌体。在量的子代噬菌体。在溶原周期溶原周期中，注入寄主细胞的噬菌体

31、中，注入寄主细胞的噬菌体DNADNA是整合到寄主细胞染色体上并可以随着寄主细胞的分裂是整合到寄主细胞染色体上并可以随着寄主细胞的分裂而进行复制。而进行复制。只有溶菌生长周期的噬菌体被称为只有溶菌生长周期的噬菌体被称为烈性噬菌体烈性噬菌体。只有。只有溶原周期的噬菌体被称为溶原周期的噬菌体被称为温和噬菌体温和噬菌体。整合了一套完整的噬。整合了一套完整的噬菌体基因组的细菌被称为菌体基因组的细菌被称为溶原性细菌溶原性细菌。在溶原性细菌内存。在溶原性细菌内存在的整合或非整合的噬菌体在的整合或非整合的噬菌体DNADNA被称为被称为原噬菌体原噬菌体。第46页，共73页，编辑于2022年，星期三溶原周期（溶原

32、周期（Lysogenic cycle）溶菌周期（溶菌周期（Lytic cycle）第47页，共73页，编辑于2022年，星期三1.噬菌体的生物学特性噬菌体的生物学特性 DNA为为线线状状双双链链DNA分分子子，长长度度为为48502bp，在在分分子子两两端端各各有有12个个碱碱基基的的单单链链互互补补粘粘性性末末端端。当当其其注注入入到到寄寄主主细细胞胞中中后后，可可以以迅迅速速通通过过这这两两个个粘粘性性末末端端的的互互补补作作用用形形成成双双链链的的环环形形DNA分分子子。上上述述通通过过粘粘性性末末端端互互补补形形成成的的双双链链区区被称为被称为cos位点位点（cohesive end

33、site）.DNA至至少少包包括括61个个基基因因，其其中中一一部部分分为为噬噬菌菌体体生生命命活活动动的的必必须须基基因因，另另一一部部分分可可以以被被外外源源基基因因取取代代而而不不会会影影响响到到噬噬菌菌体体的正常功能。的正常功能。第48页，共73页，编辑于2022年，星期三 噬菌体的头部外壳蛋白对噬菌体的头部外壳蛋白对DNA分子分子的包装与的包装与DNA内部的序列无关，只内部的序列无关，只识别两个识别两个cos位点，同时对包装的位点，同时对包装的DNA分子的大小有严格的要求：其分子的大小有严格的要求：其包装范围为包装范围为 DNA 总长的总长的75%105%，即，即36.4kb 50.

34、9kb.第49页，共73页，编辑于2022年，星期三2.DNA载体的构建载体的构建（1）缩短野生型）缩短野生型 DNA的长度，提高外源的长度，提高外源DNA的装载量。的装载量。即在不影响其体内复制、裂解及包装功能的前提下尽量即在不影响其体内复制、裂解及包装功能的前提下尽量缩小其分子长度；缩小其分子长度；（2）删除重复的酶切位点，引入单一的酶切位点；）删除重复的酶切位点，引入单一的酶切位点；（3）灭活一些与裂解周期有关的基因，使）灭活一些与裂解周期有关的基因，使 DNA载体载体只能在特殊的条件下感染裂解宿主菌，以避免可能出现的生只能在特殊的条件下感染裂解宿主菌，以避免可能出现的生物污染；物污染；

35、（4）引入合适的选择标记基因，便于重组噬菌体的检测。）引入合适的选择标记基因，便于重组噬菌体的检测。第50页，共73页，编辑于2022年，星期三（1）插入型载体（插入型载体（Insertion vectors）selecting recombinant phage via insertional inactivation of the cI genecI+cI-Lysogenic cycleLytic cycleclear plaquescloudy plaques 噬菌体载体的分类及用途噬菌体载体的分类及用途第51页，共73页，编辑于2022年，星期三（1）Insertion vectors

36、Lambda gt10 Lambda gt10 was designed for the cloning of relatively short DNA fragments,especially cDNA.The vector accepts EcoRI ended fragments up to 7.6 kb.Insertion of the DNA inactivates the lambda repressor(gene i434)resulting in clear plaques.b527 is a deletion of part of the Lambda genome.A.J

37、are structural genes.第52页，共73页，编辑于2022年，星期三（1）Insertion vectorsLambda gt11 Lambda gt11 can accept fragments up to 7.2 kb in length in a unique EcoRI site near the end of the E.coli LacZ gene.This allows production of fusion proteins from the Lac promoter.Recombinant phage can then be distinguished b

38、y detection of the product of the cloned DNA using antibodies and also by detecting the inactivation of the LacZ gene on plates containing X-Gal/IPTG.nin5 is a deletion of the Lambda genome.第53页，共73页，编辑于2022年，星期三（1）Insertion vectorsLambda ZAP This vector was designed to construct cDNA libraries.It c

39、an accept up to 10 kb of foreign DNA in one of six unique cloning sites.Cloning in these sites results in insertional inactivation of LacZ allowing detection on X-Gal/IPTG plates.It also allows expression of the protein product under control of the Lac promoter and detection by specific antibodies.第

40、54页，共73页，编辑于2022年，星期三(续上一页续上一页)The vector contains the pBluescript plasmid,allowing strand-specific transcription of insert DNA.A more important feature,however,is that the pBluescript plasmid insert is flanked on one side by the initiator region of phage f1 promoter,and on the other side by the ter

41、minator region of the f1 promoter.This means that the pBluescript plasmid,complete with insert,can be excised and packaged by superinfection(双双重重感感染染)with phage f1.This can then be transferred to a suitable host E.coli strain where the plasmid is maintained and can be used for sequencing.This automa

42、tic subcloning greatly speeds up the acquisition of a sequence from a clone in a gene library.第55页，共73页，编辑于2022年，星期三（2）取代型载体（取代型载体（Replacement vectors）第56页，共73页，编辑于2022年，星期三2.噬菌体载体噬菌体载体（2）取代型载体（取代型载体（Replacement vectors）Another approach to the construction of vectors from phage Lambda is to cut out

43、a portion of the DNA by virtue of（依依靠靠）a pair of restriction sites.The 49 kb Lambda genome can lose 40%of its content which can be replaced by foreign DNA.This means that inserts of up to 20-25 kb can be cloned.These vectors are particularly useful for making gene libraries from mammalian sources.第5

44、7页，共73页，编辑于2022年，星期三 When such a vector is cut by a restriction endonuclease,a stuffer fragment is removed,leaving right and left arms.The stuffer is usually removed by alcohol precipitation and the arms attached to a foreign DNA insert prepared using the same restriction endonuclease.Lambda DNA has

45、 cohesive ends.These can attach to each other to form the cos site of a concatomer.This polymeric molecule can then be packaged into phage using an in vitro packaging system.In order to be packaged,the distance between the cos sites must be greater than 40 kb and less than 52 kb.续前一页续前一页第58页，共73页，编辑

46、于2022年，星期三（2）（Replacement vectors）EMBL 3 and 4 Lambda EMBL vectors are useful for cloning inserts from 9 to 23 kb in length.Polylinkers are present either side of the stuffer fragment.The order of the cloning sites in the polylinker in EMBL 3 is reversed in EMBL 4.Double digestion of the vector with

47、,in the case of EMBL 3,EcoRI and BamHI prevents the re-association of the stufferfragment(carrying EcoRI ends)with the arms(carrying BamHI ends).第59页，共73页，编辑于2022年，星期三二二 噬菌体载体噬菌体载体（phage vectors）1、噬菌体的生物学特性噬菌体的生物学特性2、噬菌体载体噬菌体载体3、M13噬菌体的生物学特性噬菌体的生物学特性4、M13噬菌体载体噬菌体载体第60页，共73页，编辑于2022年，星期三3.M13噬菌体的生物学特

48、性噬菌体的生物学特性 M13是是线线状状的的大大肠肠杆杆菌菌噬噬菌菌体体，颗颗粒粒内内含含有有6047个个核核苷苷酸酸的的闭闭合合环环状状单单链链DNA基基因因组组，其其单单链链的的基基因因组组DNA经经改改造后可作为单链的造后可作为单链的DNA载体。载体。因因为为M13单单链链DNA的的复复制制型型（RF，replicative form）是是呈呈双双链链环环形形，此此时时的的DNA可可以以象象质质粒粒DNA一一样样进进行行提提取取和和体体外外操操作作。不不论论是是双双链链还还是是单单链链的的M13 DNA均均能能感感染染寄寄主主细细胞胞。而而且且M13的的颗颗粒粒不不受受包包装装的的限限制

49、制，根根据据DNA的的多多寡寡其其噬噬菌菌体的颗粒可大可小。体的颗粒可大可小。M13噬菌体将噬菌体将DNA正链注入寄主细胞后与单链正链注入寄主细胞后与单链DNA 结合蛋白结合，随后以小结合蛋白结合，随后以小RNA链为引物合成负链而转变成链为引物合成负链而转变成RF。第61页，共73页，编辑于2022年，星期三 正正链链和和负负链链出出现现不不对对称称性性积积累累：当当RF积积累累到到100-200个个拷拷贝贝后后，噬噬菌菌体体DNA编编码码的的正正链链特特异异结结合合蛋蛋白白很很快快就就阻阻止止了了负负链链的的进进一一步步生生成成，但但以以负负链链为为模模板板的的正正链链合合成成并并未未受受到

50、到影影响响。大大量量游游离离的的正正链链DNA很很快快参参入入到到外外壳壳蛋蛋白白中中形形成成大大量量新新的噬菌体颗粒。的噬菌体颗粒。新新组组装装的的噬噬菌菌体体颗颗粒粒并并不不会会发发生生溶溶菌菌现现象象，只只是是从从寄寄主主细细胞胞中中挤挤压压出出去去。但但噬噬菌菌体体的的大大量量繁繁殖殖也也干干扰扰了了寄寄主主细细菌菌的的正常生长，所以仍可产生正常生长，所以仍可产生模糊的噬菌斑模糊的噬菌斑。在在M13基基因因组组中中有有一一段段507bp的的基基因因间间隔隔区区，该该区区可可以以接接受受外外源源DNA的的插插入入而而不不会会影影响响到到噬噬菌菌体体的的活活力力。这这是是该该噬噬菌菌体能用