实验一CTAB法提取植物基因组DNA.pdf

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1、实验一 CTAB 法提取植物基因组 DNA实验目的：学习从植物组织中（幼叶）提取基因组 DNA 勺基本原理和方法。实验原理：采用机械研磨的方法破碎植物的组织和细胞，由于植物细胞匀浆含有多种酶 类（尤其是氧化酶类），其对DNA 勺抽提产生不利的影响，所以在抽提缓冲液中需 加入抗氧化剂或强还原剂（如筑基乙醇）以降低这些酶类的活性。在液氮中研磨，材料易于破碎，并减少研磨过程中各种酶类的作用。CTAB（hexadecyltrimethylammonium bromide,十六烷基三甲基漠化铉），是 一种阳离子去污剂，可溶解细胞膜并与核酸形成复合物。该复合物在高盐的溶液中（0.7mol/L NaCl）是

2、可溶的，通过有机溶剂抽提，去除蛋白、多糖、酚类等杂质后加入乙醇沉淀（CTAB溶于乙醇）即可使核酸分 离出来。CTA液在低于 15 度时会形成沉淀洗出，因此再将其加入冰冷的植物材料中 之前必须预热（65 度），且离心温度不要低于 15 度。实验步骤：1、取幼嫩的植物叶片（3-5g）剪碎液氮研磨成粉，转入 1.5ml 离心管内。加 入等体积的 65C 预热的 DN 靛取缓冲液置于 65C 的恒温水浴摇床上 1-2h（1.5h）。2、加入等体积的氯仿：异戊醇（24:1）,轻轻上下颠倒 5 分钟，静置 5 分钟，之后于 12000rpm 离心 10 分钟。3、吸取上层水相，重复步骤 2 一次。4、吸取

3、上层水相，加入预冷 2/3 体积的异丙醇，轻缓颠倒 2 分钟并置-20C 冰 箱内 10min,待 DN 质淀后于 12000rpm 离心收集，收集的 DN 舟 70 忍醇中洗 2-3 次。将弃去乙醇风十后的 DNA1口适量水使其溶解。5、待 DN 虎全溶解后加入 1-2 l 不含 RNAaseA（10mg/ml）,37C 保温 1h 以除去 DN 冲的 RNA6、于 Eppendorf 管中加入 1mlM 仿：异戊醇（24:1）轻轻上下颠倒 10 分钟后10000rpmW 心 10 分钟。7、吸取上层水相并先后加入 1/10 体积的 3M昔酸钠及 2 倍总体积的预冷的无水乙醇，接着置于-20

4、 C冰箱，10 分钟后 10000rpm 离心 10 分钟，弃去无水乙醇，加 入70%乙醇洗涤 2-3 次，风十，最后将 DN 格于适量（200-500 l）TE 中。8、待 DN 席全溶解后进行 1 商脂糖凝胶电泳，检查 DN 啊质量并据已知的 DNA分子量标准估计其浓度。调整浓度后的 DN 席丁-20 C 备用。实验试剂：1、1M Tris-HCL(pH8.0)121.1g Tris 溶丁 800ml 无菌水中，加浓 HC 调 pH8.0,定容至 1L,高压灭菌2、0.5M EDTA(pH8.0)186.1g EDTA-Na2HO 容丁 800ml 无菌水中，需用磁力搅拌器剧烈搅动，用Na

5、OHIpbfi 到 8.0(约 20g)，定容至 1L,高压灭菌。3、3.5M NaCL204.75g NaCL 溶丁 1L 无菌水中，高压灭菌。4、10%CTA 防液10gCTA 密丁 80ml 无菌水中，定容至 100mL 高压灭菌。5、DN 醒取液(500ml)3.5M NaCLTris-HCLEDTA10%3TAB200ml50ml50ml100ml100ml6、异戊氯仿-(24:1 体积比)7、RNAaseA8、异丙醇9、无水乙醇Water11、1X TE 冲液实验仪器：液氮罐、1.5ml 离心管、1.5ml 离心管架、包温水浴摇床、枪及枪头(1ml 和200ul)、离心机(转速可调至 4000rpmn 10000rpm)、剪刀注意事项(1)叶片磨得越细越好。(2)移液器的使用。(3)由丁植物细胞中含有大量的 DNAB，因此，除在抽提液中加入 EDTAffi 制酶 的活性外，第一步的操作应迅速，以免组织解冻，导致细胞裂解，释放出 DNAB,使DNA 奉解。