分子系统学和分子鉴定.ppt

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1、关于分子系统学与分子鉴定第一张，PPT共六十七页，创作于2022年6月内容什么是分子系统学什么是系统发育树建树方法如何建树第二张，PPT共六十七页，创作于2022年6月分类学与系统学 分类学通常被分为分类学通常被分为 分类学(taxonomy)taxonomy)和和分类学分类学(taxonomy)等不同阶段。分类学分类学:对于多样性的生物进行分类、描述，按照各类群生物对于多样性的生物进行分类、描述，按照各类群生物的国际统一命名法规进行不同等级和类群的命名的国际统一命名法规进行不同等级和类群的命名 分类学分类学:通常也被称之为系统学，即将生物的分类群或分类单通常也被称之为系统学，即将生物的分类群

2、或分类单位按照生物演化顺序排列成一定的系统位按照生物演化顺序排列成一定的系统系统学是研究各等级、各类群之间的演化关系，按照生系统学是研究各等级、各类群之间的演化关系，按照生物演化顺序将它们排列成一定的物演化顺序将它们排列成一定的“系统系统”(”(英文英文systemsystem，拉丁文拉丁文systema)systema)。第三张，PPT共六十七页，创作于2022年6月系统发育树A tree is a mathematical structure which represents a model of an actual evolutionary history of a group of s

3、equences or organismsIn other words,it is an evolutionary hypothesis第四张，PPT共六十七页，创作于2022年6月Phylogenetic trees第五张，PPT共六十七页，创作于2022年6月 Topology of A Tree A tree consists of nodes A tree consists of nodes connected by branchesconnected by branches One unique internal node is the root One unique interna

4、l node is the root of the tree:the ancestor of all the of the tree:the ancestor of all the sequencessequences Internal nodes represent Internal nodes represent hypothetical ancestorshypothetical ancestors Terminal nodes represent sequences Terminal nodes represent sequences or organisms for which we

5、 have or organisms for which we have data.Each is typically called a data.Each is typically called a“Operational Taxonomical Unit”or“Operational Taxonomical Unit”or OTU.OTU.第六张，PPT共六十七页，创作于2022年6月 Related TermsThe ingroup is the group actually studied by the investigator.That is,it is the group of i

6、nterest.第七张，PPT共六十七页，创作于2022年6月A sister group is the taxon that is genealogically most closely related to the ingroup.The ancestor of the group cannot be its sister because the ancestor is a member of the group.Related Terms第八张，PPT共六十七页，创作于2022年6月 An An outgroupoutgroup is any group used in an analy

7、sis that is not is any group used in an analysis that is not included in the taxon under study.included in the taxon under study.It is used for comparative purposes,usually in arguments It is used for comparative purposes,usually in arguments concerning the relative polarity of a pair(or series)of h

8、omologous concerning the relative polarity of a pair(or series)of homologous characters.characters.The most important outgroup is the sister group,and The most important outgroup is the sister group,and considerable phylogenetic research may be needed to find the considerable phylogenetic research m

9、ay be needed to find the sister group.Usually more than one outgroup is needed in an sister group.Usually more than one outgroup is needed in an analysis.analysis.Related Terms第九张，PPT共六十七页，创作于2022年6月 Related Terms第十张，PPT共六十七页，创作于2022年6月 目前用蛋白质和核酸序列进行系统发育关系分析目前用蛋白质和核酸序列进行系统发育关系分析的方法有：的方法有：距离法（距离法（Dis

10、tance MethodsDistance Methods）其中邻接法（其中邻接法（Neighbor Joining,NJNeighbor Joining,NJ）最受欢迎）最受欢迎 最大简约法（最大简约法（Maximum Parsimony,MPMaximum Parsimony,MP）最大似然法（最大似然法（Maximum Likelihood,MLMaximum Likelihood,ML）BayesianBayesian法法Methods for Constructing Phylogenies第十一张，PPT共六十七页，创作于2022年6月 用最大简约原则（用最大简约原则（Maximu

11、m Parsimony,MPMaximum Parsimony,MP）来推断）来推断最好的系统树最好的系统树 理论依据：解释一个过程的最好假说应是假设条件最少的假理论依据：解释一个过程的最好假说应是假设条件最少的假说。因此，对于分子数据（说。因此，对于分子数据（DNADNA序列数据），该方法计算在序列数据），该方法计算在最少的碱基替换条件下能够解释整个进化过程的拓扑结构最少的碱基替换条件下能够解释整个进化过程的拓扑结构（系统进化树）。（系统进化树）。简约原则在逻辑上的要求是在多种解释中选取最简单的。在简约原则在逻辑上的要求是在多种解释中选取最简单的。在分析系统发育关系时，最简约的树是对数据集进

12、化途径最短分析系统发育关系时，最简约的树是对数据集进化途径最短的解释（即从祖先分类单元到现生单元性状变化的数目最少）的解释（即从祖先分类单元到现生单元性状变化的数目最少）Methods for Constructing Phylogenies第十二张，PPT共六十七页，创作于2022年6月 The steps involved in creating a phylogenetic tree The steps involved in creating a phylogenetic tree from molecular data are:from molecular data are:Iden

13、tify a protein or DNA sequence of interestIdentify a protein or DNA sequence of interest Identify other sequences that are related to the sequence Identify other sequences that are related to the sequence of interest and obtain electronic files of those sequencesof interest and obtain electronic fil

14、es of those sequences Align the sequencesAlign the sequences Using the results of alignment,generate a phylogenetic Using the results of alignment,generate a phylogenetic treetree Print(and perhaps publish)the resultsPrint(and perhaps publish)the resultsHow to Create a Tree?第十三张，PPT共六十七页，创作于2022年6月

15、获取相关基因序列数据Download from GenBankSequenced by investigator第十四张，PPT共六十七页，创作于2022年6月输入输入http:/www.ncbi.nlm.nih.gov/网址网址 Eurytomidae 28S ribosomal RNA gene 第十五张，PPT共六十七页，创作于2022年6月第十六张，PPT共六十七页，创作于2022年6月第十七张，PPT共六十七页，创作于2022年6月第十八张，PPT共六十七页，创作于2022年6月 自行扩增后获得的新序列自行扩增后获得的新序列 从研究的样本直接提取从研究的样本直接提取DNADNA，扩增

16、测序，得到序列文件，扩增测序，得到序列文件 用用SequencherSequencher（版本（版本3.1.13.1.1）、）、SeqScapeSeqScape或或BioEditBioEdit软件对测得的软件对测得的序列进行校对和编辑，确保序列的序列进行校对和编辑，确保序列的准确性准确性 保存成保存成FASTAFASTA或纯文本格式。或纯文本格式。获取相关基因序列数据获取相关基因序列数据第十九张，PPT共六十七页，创作于2022年6月创建输入文件创建输入文件 由由GenBankGenBank下载的序列下载的序列创建创建 运行运行MacCladeMacClade软件，在软件，在“File”“Fi

17、le”菜单中选择菜单中选择“New File”“New File”命令命令 在在“Taxa”“Taxa”下拉菜单下拉菜单“Improt“Improt Sequences”Sequences”选择子菜单选择子菜单“FASTA File”“FASTA File”打开下载的序列文件打开下载的序列文件batchseq.cgibatchseq.cgi 将输入的矩阵保存成将输入的矩阵保存成NBRFNBRF格式格式（FileFile下拉菜单中的子菜单下拉菜单中的子菜单“Export File”“Export File”中的中的“NBRF”“NBRF”选选项）项）第二十张，PPT共六十七页，创作于2022年6

18、月创建输入文件创建输入文件由自行扩增的序列创建 运行运行MacCladeMacClade软件，在软件，在“Taxa”“Taxa”下拉菜单下拉菜单“Import“Import Sequences”Sequences”选择选择“File with Only Sequence”“File with Only Sequence”命令；然后命令；然后逐条地输入目的序列；逐条地输入目的序列；将输入的矩阵保存成将输入的矩阵保存成NBRFNBRF格式（格式（FileFile下拉菜单中的子菜下拉菜单中的子菜单单“Export File”“Export File”中的中的“NBRF”“NBRF”选项）。选项）。第

19、二十一张，PPT共六十七页，创作于2022年6月创建输入文件创建输入文件第二十二张，PPT共六十七页，创作于2022年6月Positional homolog(点同源)序列数据首先必需进行比对,以便能够对同源位点（比较的单位）进行比较和分析目前应用得最多的关于序列排序的软件是Clustal X 1.81 序列的比对（序列的比对（Alignment）第二十三张，PPT共六十七页，创作于2022年6月利用Clustal X软件进行序列比对 用用Clustal XClustal X软件打开以上保存的软件打开以上保存的NBRFNBRF格式的文件，进行多序列格式的文件，进行多序列的比对（的比对（Mult

20、iple alignmentMultiple alignment）。）。在在“Alignment”“Alignment”菜单的下拉菜单菜单的下拉菜单“Alingment Parameters”“Alingment Parameters”中选中选择择“Multiple Alignment Parameter”“Multiple Alignment Parameter”进行多序列比对的参数设进行多序列比对的参数设置。置。参数设置是参数设置是Gap Opening=10Gap Opening=10，Gap Extension=0.2Gap Extension=0.2第二十四张，PPT共六十七页，创作

21、于2022年6月利用Clustal X软件进行序列比对 第二十五张，PPT共六十七页，创作于2022年6月 在在“Alignment”“Alignment”下拉菜单下拉菜单“Output Format Options”“Output Format Options”中选中中选中“NEXUS format”“NEXUS format”选项；然后做选项；然后做“Do Complete Alignment”“Do Complete Alignment”比对后，用比对后，用MacClade 4.0MacClade 4.0软件打开排序后产生的软件打开排序后产生的“.nxs”“.nxs”文件。文件。手工校对

22、排序的结果，并删除那些难以比对的高变区手工校对排序的结果，并删除那些难以比对的高变区（hypervariable regionshypervariable regions）SwoffordSwofford等等(1996)(1996)认为排除这些区域，可以提高系统认为排除这些区域，可以提高系统发育关系结果的可靠性。发育关系结果的可靠性。利用Clustal X软件进行序列比对第二十六张，PPT共六十七页，创作于2022年6月系统发育关系分析 调用目的文件调用目的文件调用目的文件调用目的文件：运行：运行PAUPPAUP软件；在软件；在“File”“File”下拉菜单中选择下拉菜单中选择“Open”“

23、Open”命令，找到从命令，找到从Clustal XClustal X排序后产生的排序后产生的“.nxs”“.nxs”文件；点击文件；点击“Execute”“Execute”命令命令 排除非信息位点排除非信息位点排除非信息位点排除非信息位点：选中：选中“Data”“Data”下拉菜单中的下拉菜单中的“Include-Exclude“Include-Exclude Characters”Characters”选项，排除选项，排除“uninf”“uninf”位点位点 选择分析原则及搜索最佳树的参数设置选择分析原则及搜索最佳树的参数设置选择分析原则及搜索最佳树的参数设置选择分析原则及搜索最佳树的参数

24、设置：在：在“Analysis”“Analysis”菜单菜单中选中中选中“Parsimony”“Parsimony”；然后进行；然后进行“Heuristic”“Heuristic”搜索；其参数搜索；其参数设置是：设置是：General Search Options=Best trees only General Search Options=Best trees only Starting trees for branch-swapping=Get by stepwiseStarting trees for branch-swapping=Get by stepwise Stepwise-Ad

25、diton Options=random,#reps=1000Stepwise-Additon Options=random,#reps=1000 Swapping algorithm=TBRSwapping algorithm=TBR第二十七张，PPT共六十七页，创作于2022年6月系统发育关系分析第二十八张，PPT共六十七页，创作于2022年6月合意树合意树：在“Trees”菜单中，点击“Compute Consensus”，选中“Strict”，点击“OK”，获取严格的合意树。系统发育关系分析第二十九张，PPT共六十七页，创作于2022年6月第三十张，PPT共六十七页，创作于2022年6

26、月 系统发育关系分析赋根赋根：在“Options”的下拉菜单中选中“Rooting”，为树赋根；有两种方案，有两种方案，是是Outgroup rootingOutgroup rooting；是是Midpoint Midpoint rootingrooting第三十一张，PPT共六十七页，创作于2022年6月系统发育关系分析 输出树输出树输出树输出树：在：在“Trees”“Trees”下拉菜单下拉菜单中选择中选择“Print trees”“Print trees”以打印以打印树。树。参数设置如下：参数设置如下：Plot type=Rectangular CladogramPlot type=Re

27、ctangular Cladogram Line width=1.5Line width=1.5 Font=HelveticaFont=Helvetica Size=14Size=14 Styles=Styles=BoldBold&ItalicItalic。第三十二张，PPT共六十七页，创作于2022年6月评价结果的可靠性 在得到树（或树集）后，必需做的是评价结果的可靠性。在得到树（或树集）后，必需做的是评价结果的可靠性。主要有主要有BootstrappingBootstrapping方法。方法。BootstrappingBootstrapping（Felsenstein Felsenstei

28、n，19851985）用于评价系统树）用于评价系统树各节点的支持率，通常支持率在各节点的支持率，通常支持率在9090以上是最可信的。以上是最可信的。在测试中共重复1000次。第三十三张，PPT共六十七页，创作于2022年6月 选中选中BootstrapBootstrap；Number Number of replicates=1000of replicates=1000 Type of searchType of search =Full heuristic =Full heuristic Consensus tree options=Consensus tree options=Retain

29、 groups with Retain groups with frequency 50%frequency 50%评价结果的可靠性第三十四张，PPT共六十七页，创作于2022年6月评价结果的可靠性点击Continue；在Heuristic Search的Stepwise-Addition Options中的random的#reps的值改为1000；点击Search运算结束后，点击Trees下拉菜单中的Print Bootstrap Consensus以打印结果第三十五张，PPT共六十七页，创作于2022年6月Parsimony Tree based on ITS sequenceT.song

30、shanenseT.songshanenseT.taiyuanenseT.songshanense第三十六张，PPT共六十七页，创作于2022年6月Softwares 第三十七张，PPT共六十七页，创作于2022年6月红火蚁（Solenopsis invicta）分子检测技术研究 中国检验检疫科学研究院第三十八张，PPT共六十七页，创作于2022年6月研究背景研究背景研究目的研究目的材料和方法材料和方法结果结果分析与讨论分析与讨论第三十九张，PPT共六十七页，创作于2022年6月研究背景研究背景分类地位分类地位膜翅目（Hymenoptera）蚁科（Formicidae）家蚁亚科（Myrmici

31、nae）火蚁属（Solenopsis）第四十张，PPT共六十七页，创作于2022年6月研究背景研究背景分布分布国外：巴西、阿根廷、安提瓜和巴布达、特立尼和多巴哥、国外：巴西、阿根廷、安提瓜和巴布达、特立尼和多巴哥、波多黎各、巴哈马群岛、特克斯和凯科斯群岛、英属维尔京波多黎各、巴哈马群岛、特克斯和凯科斯群岛、英属维尔京群岛、美属维京群岛、美国、澳大利亚、新西兰、马来西亚群岛、美属维京群岛、美国、澳大利亚、新西兰、马来西亚国内：中国台湾省、香港、澳门和广东省吴川等国内：中国台湾省、香港、澳门和广东省吴川等第四十一张，PPT共六十七页，创作于2022年6月预测分布图预测分布图第四十二张，PPT共六十

32、七页，创作于2022年6月中国预测分布图中国预测分布图第四十三张，PPT共六十七页，创作于2022年6月研究背景研究背景形态方面形态方面单家蚁属（单家蚁属（MonomoriumMonomorium）、大头家蚁属（）、大头家蚁属（PheidolePheidole）、拟）、拟大头家蚁属（大头家蚁属（PheidologetonPheidologeton）、热带火蚁（、热带火蚁（Solenopsis Solenopsis invictainvicta）黑火蚁黑火蚁 S.richteriS.richteri 相似。尤其是幼虫和卵更难区分。相似。尤其是幼虫和卵更难区分。分子方面分子方面红火蚁红火蚁 Sol

33、enopsis invictaSolenopsis invicta，黑火蚁，黑火蚁 S.richteriS.richteri，热带火蚁，热带火蚁 S.geminataS.geminata和和 S.quinquecuspis S.quinquecuspis 四个种四个种 第四十四张，PPT共六十七页，创作于2022年6月研究背景研究背景 危害危害经济经济危害农作物，电力设备等危害农作物，电力设备等社会社会人类健康人类健康生态环境生态环境降低生物多样性降低生物多样性第四十五张，PPT共六十七页，创作于2022年6月研究目的研究目的红火蚁的分子检测技术研究红火蚁的分子检测技术研究筛选引物与探针，建立

34、红火蚁不同虫态卵、筛选引物与探针，建立红火蚁不同虫态卵、幼虫、成虫快速、准确的实时荧光幼虫、成虫快速、准确的实时荧光PCR分分子检测体系，为口岸快速查验和大通关提子检测体系，为口岸快速查验和大通关提供有力的技术支持。供有力的技术支持。第四十六张，PPT共六十七页，创作于2022年6月材料与方法材料与方法确定红火蚁主要分布的地区及要采样的确定红火蚁主要分布的地区及要采样的地点；地点；获取红火蚁不同地理种群标本；获取红火蚁不同地理种群标本；筛选并优化红火蚁分子检测探针。筛选并优化红火蚁分子检测探针。第四十七张，PPT共六十七页，创作于2022年6月技术技术 路路 线线第四十八张，PPT共六十七页，

35、创作于2022年6月国内标本收集标本国外标本序列比对基因测序DNA提取扩增构建红火蚁分子检测技术体系筛选分子检测引物与探针GenBank第四十九张，PPT共六十七页，创作于2022年6月材料与方法材料与方法 样品样品样品样品 总共选取红火蚁总共选取红火蚁总共选取红火蚁总共选取红火蚁5 5 5 5个种群和热带火蚁个种群和热带火蚁个种群和热带火蚁个种群和热带火蚁1 1 1 1个种群为研究对象。只选取采自个种群为研究对象。只选取采自个种群为研究对象。只选取采自个种群为研究对象。只选取采自同一地点，至少有两个个体同一地点，至少有两个个体同一地点，至少有两个个体同一地点，至少有两个个体(卵、幼虫、成虫卵

36、、幼虫、成虫卵、幼虫、成虫卵、幼虫、成虫)的同种标本提取基因组的同种标本提取基因组的同种标本提取基因组的同种标本提取基因组DNADNADNADNA。其中一头标本用于分子生物学实验，其余的作为形态鉴定参考。其中一头标本用于分子生物学实验，其余的作为形态鉴定参考。其中一头标本用于分子生物学实验，其余的作为形态鉴定参考。其中一头标本用于分子生物学实验，其余的作为形态鉴定参考(voucher species)(voucher species)(voucher species)(voucher species)。第五十张，PPT共六十七页，创作于2022年6月标本号种 类采集地1Solenopsis i

37、nvicta深圳公明广记花场2Solenopsis invicta深圳光明农场3Solenopsis invicta珠海斗门白蕉镇4Solenopsis invicta珠海回归公园5Solenopsis geminata广西北海6Solenopsis invicta广东吴川第五十一张，PPT共六十七页，创作于2022年6月材料与方法材料与方法提取基因组提取基因组DNA 采用采用采用采用WizardWizard方法（方法（方法（方法（PromegaPromega）提取基因组）提取基因组）提取基因组）提取基因组DNADNA，可成功提取卵、幼虫、成虫单个个体的基因组可成功提取卵、幼虫、成虫单个个体的

38、基因组可成功提取卵、幼虫、成虫单个个体的基因组可成功提取卵、幼虫、成虫单个个体的基因组DNADNA。标本最初保存在浓度为。标本最初保存在浓度为。标本最初保存在浓度为。标本最初保存在浓度为100100的酒精中；随的酒精中；随的酒精中；随的酒精中；随后转至后转至后转至后转至7070的酒精中长期保存。的酒精中长期保存。的酒精中长期保存。的酒精中长期保存。第五十二张，PPT共六十七页，创作于2022年6月材料与方法材料与方法设计引物与探针设计引物与探针 GenBankGenBank发表火蚁属（发表火蚁属（SolenopsisSolenopsis）的）的COICOI基因序列有基因序列有102102条，分

39、别属于条，分别属于Solenopsis invicta,S.richteriSolenopsis invicta,S.richteri，S.S.geminatageminata和和 S.quinquecuspisS.quinquecuspis四种，标本来源分别为阿根四种，标本来源分别为阿根廷、巴西和美国。用廷、巴西和美国。用Clustal XClustal X软件对软件对COICOI基因序列进行基因序列进行比对后，分析保守区与高变区，针对红火蚁的特异序列，比对后，分析保守区与高变区，针对红火蚁的特异序列，手工设计了引物与探针。手工设计了引物与探针。第五十三张，PPT共六十七页，创作于2022年

40、6月材料与方法材料与方法序列的比对（序列的比对（alignment）与分析）与分析比对（Clustal X,Thompson et al.,1997)Neighbor-Joining Tree Thinking第五十四张，PPT共六十七页，创作于2022年6月第五十五张，PPT共六十七页，创作于2022年6月第五十六张，PPT共六十七页，创作于2022年6月结 果第五十七张，PPT共六十七页，创作于2022年6月PCR产物电泳检测结果（成虫）产物电泳检测结果（成虫）第五十八张，PPT共六十七页，创作于2022年6月PCR产物电泳检测结果（幼虫）产物电泳检测结果（幼虫）第五十九张，PPT共六十七

41、页，创作于2022年6月FamFam荧光曲线（成虫）荧光曲线（成虫）第六十张，PPT共六十七页，创作于2022年6月FamFam荧光曲线（幼虫）荧光曲线（幼虫）第六十一张，PPT共六十七页，创作于2022年6月FamFam荧光曲线（卵）荧光曲线（卵）第六十二张，PPT共六十七页，创作于2022年6月第六十三张，PPT共六十七页，创作于2022年6月分析与讨论分析与讨论引物可成功扩增所有样品，红火蚁特异探引物可成功扩增所有样品，红火蚁特异探针只检测出红火蚁样品，而热带火蚁样品针只检测出红火蚁样品，而热带火蚁样品没有被检出。因此，此实时荧光没有被检出。因此，此实时荧光PCR检测检测方法，通过方法，

42、通过1对通用引物和对通用引物和1条特异探针可条特异探针可将红火蚁和热带火蚁分开；而且对红火蚁将红火蚁和热带火蚁分开；而且对红火蚁不同虫态的分子检测都有效。不同虫态的分子检测都有效。第六十四张，PPT共六十七页，创作于2022年6月分析与讨论分析与讨论由于红火蚁、黑火蚁和由于红火蚁、黑火蚁和S.quinquecuspis在在COI基因上碱基差异很小，理论上，利基因上碱基差异很小，理论上，利用本实验的引物可以检测到上述用本实验的引物可以检测到上述3种火蚁。种火蚁。由于样品的限制，目前无法在实验中进一由于样品的限制，目前无法在实验中进一步验证。但这为进一步确定黑火蚁和步验证。但这为进一步确定黑火蚁和

43、S.quinquecuspis的检疫地位提供了重要参的检疫地位提供了重要参考。考。第六十五张，PPT共六十七页，创作于2022年6月分析与讨论分析与讨论从从COI基因比对结果来看，红火蚁种群间碱基因比对结果来看，红火蚁种群间碱基变异也很大，以基变异也很大，以COI基因为分子标记设计基因为分子标记设计检测红火蚁种级特异探针比较困难。本实验检测红火蚁种级特异探针比较困难。本实验的样品都能扩增，但随着样品量的增加，存的样品都能扩增，但随着样品量的增加，存在目标样品检不出的可能。在下一步的工作在目标样品检不出的可能。在下一步的工作中，我们将选取其它标记基因（如线粒体中，我们将选取其它标记基因（如线粒体16S或或12S rDNA或核内或核内18S rDNA），优化），优化检测的引物和探针，更好地标准化红火蚁分检测的引物和探针，更好地标准化红火蚁分子检测工作。子检测工作。第六十六张，PPT共六十七页，创作于2022年6月感感谢谢大大家家观观看看17.09.202217.09.2022第六十七张，PPT共六十七页，创作于2022年6月