口腔上皮基因组DNA与鉴定.pdf

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1、海南大学农学院09级生物科学专业 许连华20090110310061人口腔上皮细胞提取基因组 DNA 及 PCR-RFL 法鉴定 CYP2C 基因一实验目的1、 练习酚 - 氯仿法提取人的基因组 DNA2、 掌握 PCR 法分离全基因组中特定基因的原理和方法3、 熟悉 RPLF 法鉴定遗传多态性并掌握其鉴定基因型的原理二实验原理1、 酚-氯仿法抽提基因组 DNA 的原理在 EDTA 存在下，用蛋白酶 K 消化细胞，用去垢剂溶解细胞膜，用酚抽提，除去杂蛋白、RNA 及其他大分子，用异丙醇或乙醇沉淀可得到口腔上皮基因组 DNA。2、 PCF 法分离基因的原理PCR 即聚合酶链式反应的原理类似于 D

2、NA 勺天然复制过程。在带扩增的 DNA 片段两侧和与其两侧互补的两个寡核苷酸引物，DNA 聚合酶以单链 DNA 为模板利用反应体系中的 dNTP 按 5一 3方向经变性、退火和延伸若干个循环后， DNAT增 2n。3、RFLP 的原理RFLP 即限制性内切酶片段多态性是基因型之间限制性片段长度的差异， 是 由限制性酶切位点上碱基的插入、缺失、重排或点突变引起的。CYP2C9 是细胞色素 P450 超家族的成员之一。是一类主要存在于肝脏、肠 道中的单加氧酶， 催化多种内外物质的代谢。 目前约有 16%的临床药物由 CYP2C9 负责代谢。CYP2C 具有高度的多态性。T269C 是位于 CYP

3、2C 基因第二外显子的 一个多态位点中国人群中大多数是纯合子，可被EcoRU内切，内切位点(CTC/A)GG387bp+302bp(GAC/T)C 少数 CYP2C 尸生突变。突变 T269C CCTG(突变为CTTGG EcoRZ 内切产生三条片段 192bp+195bp+302bp 本实验利用 RFLP 酶切 技术检测 CYP2C 的基因型。三实验器材与试剂1 、器材1.5ml 离心管，系列移液枪，消毒棉签，恒温水浴锅，台式离心机，电泳系统，PCF 仪2、试剂人口腔上皮细胞，裂解液(150mM EDTA PH8.0 950ul+10%SDS 50)，酚 氯 仿/异戊醇，20mg/ml 蛋白

4、酶 K, 5MNacl, 70%L 醇，琼脂糖凝胶电泳系统，PCR 扩增体系(水 10 xbuffer dNTP Mgcl2PFPR Taq酶)，Marker，酶切体系(10 xbuffer Bci130l)。四实验步骤1、口腔上皮细胞基因组 DNA 提取 取 1.5ml 离心管，加入 1ml 裂解液(50mMEDTAPH8.0 950ul+10%SDS50ul ) 取消毒棉签在漱口后的擦刮，放入1ml 裂解液中洗脱 加入 20mg/ml 蛋白酶 K2.5ul，混匀，56 C 水浴 2h 取新的 1.5mlEP 管加入 300ul 酚， 300ul 氯仿/异戊醇( 24:1 ) 取 800ul

5、 上述裂解反应液加入试剂中 颠倒混匀，750g 离心 15mi n 取上清，加入 30ul 5M Nacl 和 700ul 氯仿/异戊醇 颠倒混匀，7500g 离心 15mi n 取上清，加入 0.6 倍体积异戊醇，1200g 离心 15min,弃上清 70%冷乙醇洗涤沉淀，7500g 离心 5min，弃上清，干燥。加 15ml 水溶解,并电泳检测。2、CYP2C9 基因的 PCR 扩增PCR 扩增总体系：25ulHO10 xbufferdNTP(2.5mM2ulMgcl2(25mM)1.5ulPFPRTaq 酶DNA(10uM)(1OuM)(5U/ul)0.5ul0.5ul0.5ul2ul1

6、5.5ul2.5ul电泳检测1%凝胶电泳检测。样品与 marker 上样量各为 5ul3 、CYP2C 限制性长度多态性分析进行限制性内切酶酶切，酶切体系：2ul 10 xbuffer ,0.5ul 10M/mlBciT130l,17.5ul PCR 产物。体系总体积为 20ul 酶切 1h,37C水浴。4、电泳检测电泳体系为：2%凝胶，maker5ul。五实验结果 本小组为第五实验组基因组 DNADNA 第一次电泳检测。上下两排第一条带均为 MarkMark。每个实验小组点两个点样孔，从上排到下排，左到右一次点样。第五组点 样在下排，第五组电泳条带显示第五组基因组DNADNA 提取失败。其中

7、，第一组，第二组，第三组，第六组均显示条带，说明基因组 DNADNA 提取成功。每排靠近点样孔处的亮点可能是杂蛋白或者其他杂质成分。CYP2C9 PCRCYP2C9 PCR 扩增电泳图上下两排第一条带均为 MarkMark。电泳点样同基因组 DNADNA 电泳电泳顺序。由于基因组 DNADNA 提取失败，PCRPCR 也因此扩增失败。其他个别实验组扩增成功，显示亮条带。除了能是引物二聚体或其他杂质成分条带。PCRPCR 条带外，还显示了其他亮条带，可CYP2C9CYP2C9 酶切电泳图上下两排第一条带均为 MarkMark。酶切电泳点样同以上两个电泳电泳顺序。本组实验失败。图中其他小组的电泳条

8、带均显示为双条带，说明在本班实验组提供基因的组员无CYP2C9CYP2C9 突变。六实验分析与注意事项分析已在各实验结果图处做了说明，因此此处略去，只写实验注意事项。注意事项：1、不同生物的基因组 DNA 提取方法有所不同， 如植物基因组 DNA 提取常用 CTAB 法。2、 组织中的多糖和酶类物质对随后的酶切、 PCF 反应等有较强的抑制作用，故 应先除去多糖和酚类物质。3、 核酸通过有机溶剂抽提得以纯化，污染的 RNAS过 RNA 酶消化清除。并利用 基因组 DNA 较长的特性在加入一定量的异戊醇或乙醇后，基因组的大分子可沉淀形成纤维状絮团漂浮其中，其他细胞器小分子着于壁上及底部，从而达到

9、提取的目的。4、 在提取过程中染色体会发生机械断裂， 产生不同大小片段。所以操作过程尽 量温和且尽量减少酚/氯仿抽提，混匀过程要轻缓。5、 PCR 缓冲液中含 Tris/Hcl ，用以调节 PH 使 Taq 酶的作用环境维持偏碱性； 含DNADNA 只形成颗粒状沉淀附Mgcl2,Mg2+影响 Taq 酶活性；含 Kcl，有利于引物的退火，但浓度过高会抑制 Taq 酶活性；含明胶，保护酶不变性。6、EDTA 为金属螯合剂，可抑制 DNA 酶活性，防止 DNA 被降解。7、裂解液用以破膜， 蛋白酶 K 56C时活性最好， 所以消化蛋白质时水浴温度 为 56C。8 裂解后 DNA 漂浮于溶液上层，故

10、再次抽提前取上清时要谨慎，少吸取一点，不要取到中间层及下层物质。9、根据所提 DNA 量而定溶解水，一般为 10-30ul，本次加水体积为 15ul。10、BciT130l 与 EcoRH 是同工酶，本次酶切用的是 BciT130l。由于前者在购 买时商家比较多，出于试验成本等考虑而选用后者。失败可能原因：1 、实验污染。2、操作太剧烈，机械损伤。3、酶活性在操作过程中收到破坏。4、试剂保存不当，失去效力。5、人为操作上的失误，如试剂添加顺序错误，取量过多或过少等。6、材料提取时，即刮口腔上皮细胞时没有刮到材料等。七 实验感想在实验操作中，练习了酚-氯仿法提取人的基因组 DNA 还掌握了 PCR 法分 离全基因组中特定基因的原理和方法，也学习了用 RPLF 法鉴定遗传多态性并掌 握了其鉴定基因型的原理，提高了对专业理论知识的认知以及对问题的思考能 力。除了加强实验技能外，对个人学习能力、耐力、对事物的探索精神以及其 他各方面的综合能力也得到了一次很好的锻炼与提高。还曾增进了同学之间的 交流与合作，促进与老师的交流沟通等。在此，感谢老师给予这样的一次锻炼 机会。在今后的学习与生活中，我将像做实验一样，认真努力、积极进取、不 懈探索。