宏基因组实验计划(5页).doc

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1、-宏基因组实验计划-第 5 页宏基因组学方法研究明永冰川的初步实验计划起草人：李浩宇宏基因组学研究方向及意义研究：环境胁迫对集体遗传变异的过程和机理。发掘：环境应激和应答基因的多态性。探究：多态性基因的功能。实验大体步骤： I.环境样品的采集：1）避免人源污染，采样的器具都要高温灭菌，采样过程中要戴手套。2） 样品的迅速处理保存。有条件最好用液氮冷冻运输，没有条件可以将装有样品的容器至于干冰泡沫箱中。带回实验室之后要尽快处理，特别是固体样品，迅速用预冷缓冲液 (多为PBS)重悬，离心收集沉淀。分装成小份，冻存于液氮或者80 冰箱中，避免反复冻融。3）如果后续用间接法提取总DNA 的话，此处需要

2、收集菌体，采取的策略是稀释之后的差速离心，一般适用于水样。II.DNA提取方法的选择：总DNA 的提取按照处理样品方式的不同划分为直接提取法和间接提取法。直接提取法就是直接对样品进行裂解，释放其中的DNA。间接提取法则是先分离样品中的微生物，后对微生物进行裂解。两种方法的适用范围不同，各自都有优缺点。直接提取法的优缺点：直接提取法多用在提取固体样品(如土壤、污泥、湖泊沉积物等) 总DNA 的试验中。其最大的优点在于得率高，在某些环境样品总DNA 提取实例中，比间接提取法高数倍至数百倍。造成这种情况的最主要原因一是环境样品中存在丰富的胞外DNA；二是许多微生物与基质形成复杂的结构，间接提取法不易

3、对其进行分离。在样品较珍贵时多采用此法。其缺点同样明显，所得DNA 的纯度远不及间接提取法所得，基质中含的腐殖质一并被保留下来，使得所得DNA 呈现黄褐色甚至黑色。可以考虑MoBio 和Epicentre的DNA提取的商业试剂盒(主要用于提取土壤样品)。间接提取法的优缺点：间接提取法则既可以用来提取固相样品总DNA 也可以用来提取液体样品总DNA。在提取液体样品 (如海水、河流等样品)总DNA 时，需要用抽滤的方式浓缩。与直接提取法刚好相反，其最大的优点在于提取DNA 纯度高，既使在提取固体样品微生物总DNA 时，也可以用缓冲液对收集的菌体进行反复冲洗以去除表面所带杂质。其缺点是DNA 得率低

4、。土壤DNA 直接提取法：(1) 从超低温冰箱中取出保存样品 (5 g)；(2) 于室温融化；(3) 加入13.5 ml CTAB 抽提缓冲液和50 l 蛋白酶K 贮存液；(4) 离心管于37oC 225 rpm 水平振荡30 min；(5) 加入1.5 mL20%SDS；(6) 65oC 水浴2 h，每隔15 min 轻轻颠倒数次；(7) 室温6,000g 离心10 min，收集上清液，转移至一个新的50 ml 离心管中；(8) 沉淀中再加入4.5 ml 提取液和0.5 ml 20%SDS，轻轻涡旋至混匀；(9) 浸入液氮中冷冻3 min 后，于沸水中煮沸3 min；(10) 室温6,000

5、g 离心10 min，收集上清液，与上次上清液合并；(11) 重复(8)、(9)、(10)一次；(12) 将三次提取所获上清液与等体积的苯酚：氯仿(1:1 v/v) 混合，摇匀后于4 12,000g 离心10 min；(13) 将上层水相转移至一新的50 ml 离心管中，加入等体积的氯仿：异戊醇(24:1)，混匀后于4 12,000g 离心10 min；(14) 再次转移上清至一新的离心管中，加入0.6 倍体积的异丙醇于室温沉淀1 h；(15) 室温12,000g 离心20 min；(16) 收集沉淀，用预冷的70%乙醇洗涤沉淀；(17) 向离心管中加入1 ml TE，于4 放置过夜，分装保存

6、于20 。实验过程中的注意事项及一些技巧：(1) 整个提取过程吹吸动作要轻柔，避免剧烈震荡(试剂盒提取除外)。(2) 用到的枪头在灭菌之前最好将头部剪掉，避免机械剪切。(3)酚氯仿抽提时，中间相一定不要吸到，宁可多丢弃一些。(4) 异丙醇沉淀时不要放在低温，0.7 倍体积室温沉淀足够了。(5) DNA 溶解时可以放在4 静置过夜，次日离心取上清去除多余杂质。(6) 水平震荡可以用左右摇晃的震荡器。水样DNA 间接提取法：(1)抽滤的方式浓缩采集到的水样。(2)采取差速离心取得水样中的菌体。(3)取得微生物后进行裂解提取。此方法还在查证中，具体前期对样品的处理方法还在整理中。例如：用多少的水样进

7、行浓缩，差速离心的转速选择。会不会有DNA的丢失等等。Epicentre推出了宏基因组DNA分离试剂盒（Metagenomic DNA Isolation Kit for Water）,能从水样中分离已随机剪切的，可直接用于fosmid克隆的DNA片段。此试剂盒能从水样中的培养或未培养微生物（包括革兰氏阳性菌）中提取40kb大小的DNA。提取的DNA可立即进行末端修复，并在乙醇沉淀洗涤后克隆到Epicentre的PCC1FOS载体上。优势：1.无需化学剪切，琼脂糖块或大小选择。2.无需纯化柱或酚/氯仿提取。3.产量更高，从低丰度的微生物中回收DNA的概率更大。4.Fosmid载体与DNA的克隆

8、只需要90分钟。下图为方法与流程：粗提DNA 的纯化采用直接提取法提取的总DNA 或多或少都含有腐殖质的存在。它的存在对后续的分子生物学操作会有影响，时常会导致PCR 扩增不出来，酶切困难，连接转化率低。需要进行纯化。纯化的方法包括：胶回收，柱纯化，电泳/电洗脱，梯度离心。a 胶回收胶回收最大的优点在于快捷，可以在很短的时间内完成。纯化后的DNA 往往能够满足PCR 要求。但其缺点在于，膜截留式的纯化方式难免会对DNA 分子造成机械损伤，使得DNA 弥散，完整度下降。如果后续的实验室分析16S r DNA，则这种纯化方式不失为一种好方法。b 柱纯化柱纯化相对于胶回收来说更为快速，十几分钟内可完

9、成。与胶回收相比，其纯化效果要差一些。但通常情况下，纯化之后的DNA 也能够满足PCR 需求。这种方法也会造成DNA 分子的机械损伤，使得DNA 弥散，完整度下降。c 电泳/电洗脱电泳/电洗脱法相对于前两种有很多优点：其一，其价格低；其二，整个过程都很温和，能够保证DNA 的完整性；其三，纯化后的DNA 纯度较之前两种要好一些。但是其亦有些许不便：其一，过程耗时长，包括透析袋的准备，电洗脱，洗脱液的浓缩等；其二，DNA 损失量较前两种大，透析袋上会残留DNA。如果样品不是很珍贵，并且后续要进行Metagenomic 研究，这种方法不失为一种好方法。如果有脉冲场凝胶电泳系统，用此方法可以得到高纯

10、大片段DNA，可以满足后续的metagenomic C/Fosmid 文库构建。d 蔗糖/氯化铯密度梯度离心如果实验室有超速离心机 (100,000g 以上)，那么这种方法无疑也是一种好方法。与电泳电洗脱法相同，这种方法在连续介质中对DNA 及杂质进行分离，可以很好的纯化DNA。纯化得到的DNA 经过低熔点凝胶电泳切胶回收，可以得到高纯度大片段的DNA，可以满足后续的metagenomic C/Fosmid 文库构建。纯化质量的检测DNA 纯化完毕之后往往需要对纯化效果做一个初步的判断，主要包括两方面：其一，完整度判断；其二，纯度判断。a 完整度判断完整度判断同前所述，千万要记得的是加纯化之前

11、的DNA 样品做对照。结果可以告诉我们纯化得率及完整度。同样，最好能跑脉冲场凝胶电泳。b 纯度判断纯度判断通常可以采用两种方法：分光光度计法和PCR 扩增法。分光光度计可以测定双链DNA 在260nm 处的吸收值及杂质在其他波长的吸收值。通过不同波长吸收值的比，可以对DNA 纯度做出判定。通常这种方法由于灵敏性较高，所以在存在杂质时误差较大。III. 所提DNA 完整性检测DNA 的完整性主要采用普通琼脂糖凝胶电泳进行指示。最好采用0.8% 琼脂糖凝胶电泳，低电压长时间跑。至少要用lambda DNA/Hind III 做marker，如果在23 kb 处有一条完整或略拖尾的带，则证明DNA 完整性尚好。如有条件，可以采用脉冲场凝胶电泳对提取DNA 的完整度进行分析。用脉冲场凝胶电泳分析时，除了上面提及的那个maker，至少还应该有完整lambda DNA (约48 kb)充当另一个maker。以上为送测序前样品的采集，DNA的提取，验证等前期处理与方法的大致步骤与方法。Illumina所进行的测序是由Genome Analyzer测序仪所完成的：以上为Genome Analyzer技术的基本原理IV.在DNA提取，检验完成后送BGI进行后续测序。