2022年TUNEL原理和方法 .pdf

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1、TUNEL 法检测细胞凋亡实验原理和方法细胞凋亡中染色体DNA的断裂是个渐进的分阶段的过程，染色体DNA首先在内源性的核酸水解酶的作用下降解为50-300kb 的大片段。然后大约30 的染色体DNA在 Ca 2+和Mg2+依赖的核酸内切酶作用下，在核小体单位之间被随机切断，形成 180200bp 核小体 DNA多聚体。DNA双链断裂或只要一条链上出现缺口而产生的一系列DNA的 3-OH末端可在脱氧核糖核苷酸末端转移酶（TdT）的作用下，将脱氧核糖核苷酸和荧光素、过氧化物酶、碱性磷酸化酶或生物素形成的衍生物标记到DNA的 3-末端，从而可进行凋亡细胞的检测，这类方法一般称为脱氧核糖核苷酸末端转移

2、酶介导的缺口末端标记法（TUNEL）。由于正常的或正在增殖的细胞几乎没有DNA的断裂，因而没有3-OH形成，很少能够被染色。低分子量的 DNA分离后，也可使用DNA聚合酶进行缺口翻译（nick translation），使低分子量的 DNA标记或染色，然后分析凋亡细胞。TUNEL 或缺口翻译法实际上是分子生物学与形态学相结合的研究方法，对完整的单个凋亡细胞核或凋亡小体进行原位染色，能准确的反应细胞凋亡最典型的生物化学和形态特征，可用于石蜡包埋组织切片、冰冻组织切片、培养的细胞和从组织中分离的细胞的细胞凋亡测定，并可检测出极少量的凋亡细胞，灵敏度远比一般的组织化学和生物化学测定法要高，因而在细胞

3、凋亡的研究中已被广泛采用。一、过氧化物酶标记测定法原理：脱氧核糖核苷酸衍生物地高辛（digoxigenin）-11-dUTP 在 TdT酶的作用下，可以掺入到凋亡细胞双链或单链DNA的 3-OH末端，与 dATP形成异多聚体，并可与连接了报告酶（过氧化物酶或碱性磷酸酶）的抗地高辛抗体结合。在适合底物存在下，过氧化物酶可产生很强的颜色反应，特异准确的定位出正在凋亡的细胞，因而可在普通光学显微镜下进行观察。毛地黄植物是地高辛的唯一来源。在所有动物组织中几乎不存在能与抗地高辛杭体结合的配体，因而非特异性反应很低。抗地高辛的特异性抗体与脊椎动物甾体激素的交叉反应不到 1，若此抗体的Fc 部分通过蛋白酶

4、水解的方法除去后，则可完全排除细胞Fc 受体非特异性的吸附作用。本方法可以用于福尔马林固定的石蜡包埋的组织切片、冰冻切片和培养的或从组织中分离的细胞凋亡测定。检测晚期凋亡。基本原理：对不同组织切片先增加细胞膜通透性，然后让 rTDT 和 bio 标记的 dTUTP进入细胞内，在 rTDT 的辅助下dTUTP与核断裂的DNA 3-OH结合，再用HRP标记的链霉亲和素与dTUTP上 biotin结合（每个链霉亲和素至少可以再结合3 个 biotin分子），最后用DAB、过氧化氢与SP上的辣根过氧化物酶HRP发生氧化、环化反应，形成苯乙肼聚合物而呈现棕褐色，最终通过计数每张切片上不同视野中TUNEL

5、阳性细胞的比例来判断细胞凋亡发生情况。罗氏试剂盒一、试剂 1、酶浓缩溶液550 l 末端脱氧核糖核酸转移酶（10）试剂2、标记溶液5550l 含有核苷酸混合液的反应液（1）试剂3、转化剂-POD 3.5ml 酶标记抗荧光素抗体（即用型，融后4保存）二、所需的溶液和仪器10mM Tris/HCl（pH7.47.8）、PK配制、DAB、饭盒、吹风机、3%H2O2 甲醇溶液、PBS、盖玻片、中性树胶、苏木素、二甲苯和无水乙醇（用量多）、双蒸水（用以配梯度酒精）1,充分脱蜡和水化。脱蜡可以先60 度 20min，石蜡切片于染色缸中，二甲苯浸洗2 次共5min,100%、95%、90%、80%、70%乙

6、醇浸洗3min5；名师资料总结-精品资料欢迎下载-名师精心整理-第 1 页，共 3 页 -3%过氧化氢甲醇中浸洗10-15min，抑制内源性过氧化氢酶。用蛋白酶K（20g/ml 溶于 Tris/HCl中，pH7.48.0）室温孵育1530 分钟。PBS洗约 5min*2 次，擦干样品周围的水。此阶段配制TUNEL反应混合物从试剂2 中取出 100l 标记溶液作为两个阴性对照；将试剂1 中取 5l+试剂 2 中 45l 标记液中，配成 50l TUNEL 反应混合物混匀（即配即用，4避光！）标记反应：滴加50l 的 TUNEL 反应混合液，在湿盒中37孵育 60 分钟（为防蒸发和保证 TUNEL

7、 反应混合物均匀分布，可以在孵育过程中加盖盖玻片）。PBS洗 5min*3 次，至此样品可在荧光镜下（绿色）分析结果。信号转化和分析：擦干样品周围的水分，加入50ul 转化剂-POD，湿盒中37孵育 2030分钟（可以在孵育过程中加盖盖玻片）。PBS洗 5min*35 次加入 50100 l DAB底物溶液，室温（1025）孵育510 min，PBS洗 5min*3 次。（苏木素染 1-3 秒，以免视野全染，需要摸索条件）中性树胶或者甘油封片（在封片前可以复染），光镜下分析结果。?稳定性：TUNEL 反应混合物需在使用前立即制备，不能储存，配好的此液体必须将放入冰浴中。2、转化剂-POD（即用

8、型）：一旦融化此液体，需在4保存（最多保存6 个月），并且不能反复冻存。蛋白酶 K一般工作液浓度为20ug/ml,但浓缩液可配制110mg/ml，可用 PBS配制，也可用蛋白酶 K缓冲液（100mM Tris HCl PH8.0+50mM EDTA）；注意：1)蛋白酶 K可以帮助渗透组织，但延长孵育时间可能导致切片脱落（come off the slide）,所以要最优化孵育时间长短。时间一般为1030 min，4um左右的片子可以用10 min，但 30 um左右的可用30 min，最终通过摸索最佳时间。过长易脱片、过短起不到通透效果。2)对于比较困难的组织，可以选用0.1M pH6.0 的

9、枸橼酸盐缓冲液进行修复（石蜡切片无必要用），200ml 需 350W修复 5min 3)对照：阴性对照：经过固定和通透的细胞样品加入50l 试剂 2 以代替 TUNEL 反应混合物，从标记步骤以下同上。阳性对照：经过固定和通透的细胞样品用细球菌的核酸酶或DNase I 使之产生DNA 链缺口，从标记步骤以下同上。4)操作流程：常规脱蜡、脱水处理冲洗样品滴加TUNEL 反应混合物，37孵育60分钟冲洗样品选择：荧光镜下观察分析滴加转化剂-POD，37孵育 30 分钟洗样品滴加DAB底物溶液，室温孵育5-20 分钟光镜下分析结果5)假阳性多的原因有很多：POD 封闭不全、DAB显色时间过长等原因假

10、阳性严重，可能原因应该是 DAB孵育时间过长，建议首先排除之，同时加强PBS浸洗6)DAB显色时间:（1）DAB显色时间不是固定的，主要由显微镜下控制显色时间，到出现浅棕色本底时即可冲洗；（2）DAB显色时间很短（如几秒或几十秒）就出现很深的棕褐色，这很可能说明你的抗体浓度过高或抗体孵育时间过长，需要下调抗体浓度或缩短你的抗体孵育时间；（3）此外，若很短时间就出现背景很深，还有可能你前面的封闭非特异性蛋白不全，需要延长封闭时间；（4）DAB显色时间很长（如超过十几分钟）才出现阳性染色，一方面可能说明你的抗体浓度过低或孵育时间过短（最好一抗4 度过夜）；另一方面就是封闭时间过长。7)脱片产生的原

11、因和如何防止脱片:（1）多聚赖氨酸玻片质量的问题。我原先是买的，迈新按说也是不错的，可是都脱成什么名师资料总结-精品资料欢迎下载-名师精心整理-第 2 页，共 3 页 -样子了。后面补做第二批时用的病理科老师自己做的片子，要好一点。（2）组织切的不好，切片机的问题例如比较老的旧的机器切的厚或者不均匀，或者切片者手法不好等。（3）组织的问题，越是有坏死之类越容易脱。（4）没烤好，时间短温度不够之类。（5）操作的时候甩的太猛了，有脱片嫌疑的片子最好不甩或轻轻甩，用卫生纸从边缘上慢慢吸水。（6）此外，一旦见到有组织漂起来操作就更加要谨慎，用PBS的时候尽量用泡的，不要冲。名师资料总结-精品资料欢迎下载-名师精心整理-第 3 页，共 3 页 -