硫酸碰到肠的反应.docx

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1、硫酸碰到肠的反应 摘要：目的探讨硫酸皮肤素（DS）衍生物对炎性肠病（IBD）患者血小板表面P-选择素及活性蛋白C（APC）的影响。方法用氯磺酸磺化制备多硫酸化DS（PSDS）。测定其1H-NMR和13C-NMR光谱确定主要双糖单位。用过氧化氢降解DS和PSDS，所得片段用凝胶过滤色谱分别。用ELISA法测定DS衍生物对血小板表面P-选择素的影响，用底物显色法测定其对APC活性的影响。结果组成DS和PSDS链的主要双糖单位分别为IdoA-13-GalNAc-4-SO3和IdoA-2SO3-13-GalNAc4,6-diSO3。与二磷酸腺苷（ADP）组和IBD组相比，DS及其衍生物都具有抑制P-选

2、择素表达的作用（P Key words：dermatan sulfate derivative; inflammatory bowel disease; P-selectin; activated protein C 炎性肠病（inflammatory bowel disease，IBD）是一种慢性非特异性肠道炎症。近期探讨表明，炎症和凝血之间有着众多联系，IBD患者患静脉血栓的几率更高1-6。在溃疡性结肠炎（UC）和克罗恩病（CD）患者中发觉血小板活动异样，这种异样现象对加重炎症有重要作用。P-选择素（又称p-选凝素）是在激活的血小板和内皮细胞表面表达的一种膜糖蛋白，它在血栓形成和炎症反应过

3、程中起重要作用7。P-选择素拮抗作用削减了静脉血栓动物模型的血栓形成和炎症发生8。蛋白C抗凝通路好像是联系炎症和凝血的主要通路。激活蛋白C（APC）参加系统性凝血和抗凝过程9。APC可以通过抑制凝血酶产生和白细胞活性减轻器官的损害10。抑制P-选择素释放、促进APC活性有助于治疗IBD和相关的血栓疾病11。 硫酸皮肤素（DS）是一种结构困难、硫酸化的线形糖胺聚糖（GAGs），其结构中主要包括4-L-IdoA-13-D-GalNAc-1n 和 4-L-GLcA-13-D-GalNAc-1n 及其衍生物L-IdoA的C-2硫酸化、D-GalNAc的C-4 和/或 C-6硫酸化。自然DS的相对分子质

4、量（Mr）为（1545）103。多硫酸化DS（PSDS）是DS与氯磺酸反应后的硫酸化产物。DS衍生的寡糖（DS-Oligs）是指DS和PSDS降解后的寡糖。DS是存在于很多动物组织中的一种重要的糖胺聚糖。最近，越来越多的证据表明，与深化探讨的肝素和硫酸乙酰肝素一样，DS是很多细胞活动的影响因子。DS蛋白聚糖的很多生物学活性与其糖胺聚糖的结构亲密相关12。除了抗凝和抗血栓功能外，DS还具有抗炎活性13，但其抗炎机制还不明确。迄今DS寡糖的分子结构与它对P-选择素和APC活性的影响之间关系的探讨还是空白。本探讨的目的是视察不同Mr、不同结构的DS寡糖对IBD患者血小板表面P-选择素表达和血浆APC

5、活性的影响，并阐述DS治疗IBD的抗炎机制。 1材料和方法 1.1材料 DS（东营天东生化工业有限公司惠赠）；30 %过氧化氢（莱阳经济技术开发区精细化学品公司）；二磷酸腺苷（ADP, SIGMA）；Superdex-30（英国Amersham）；人P-选择素ELISA试剂盒，人蛋白C测定试剂盒（上海太阳生物技术公司）。 1.2方法 1.2.1DS-Oligs的制备DS与氯磺酸反应制备PSDS。将DS和PSDS用过氧化氢氧化降解14，所得产物上Superdex-30凝胶过滤色谱柱（26 mm1200 mm），用0.25 mol/L碳酸氢铵洗脱DS-Oligs，冻干即得。 1.2.2DS-Oli

6、gs的Mr测定用HPLC测定15。 1.2.3DS和PSDS 13C -NMR和1H-NMR分析用600 MHz核磁共振光谱仪按文献报道的方法测定DS和PSDS的13C -NMR和1H-NMR的光谱16。 1.2.4患者和比照以10名健康志愿者的血液为比照组，10例IBD患者血样中5例UC患者，5例CD患者。 1.2.5血小板表面P-选择素的测量 1.2.5.1血样采集在制备血小板前打算用含3.2 枸橼酸钠抗凝的硅化管收集血样。 1.2.5.2制备分别血小板室温下将9 mL枸橼酸钠抗凝血样500 r/min离心20 min，吸取上层富含血小板血浆（PRP），余下血浆3 000 r/min离心1

7、5 min，获得贫血小板血浆（PPP）。用PPP调整PRP血小板至3108个细胞/mL，用于测定P-选择素。 1.2.5.3标准曲线的制备将P-选择素标准品80 ng做5次倍比稀释，依次为80，40，20，10，5，2.5 ng/mL 6个标准点，分别加入酶标孔内，按试剂盒说明书测定标准曲线。 1.2.5.4用ELISA试剂盒测定血小板表面的P-选择素取225L PRP置于比浊管中，空白组与ADP组加入30L生理盐水，药物组分别加入等体积终浓度为2.50 mg/mL的DS、PSDS及DS-Oligs生理盐水溶液，37 孵育10 min。ADP组和药物组加入ADP（4.68mol/L）25L作为

8、刺激剂，空白组加入等体积生理盐水，37 孵育5 min，3 000 r/min离心15 min，吸取上层含P-选择素血浆，按试剂盒说明书操作，用ELISA法测定各组血浆中P-选择素含量。 1.2.6APC活性测定 1.2.6.1收集及制备用于测定APC的血样10例IBD患者的静脉血样5 mL，3.2 枸橼酸钠抗凝，快速离心，收集血浆并储存于28 冰箱备用。 1.2.6.2蛋白C活性标准曲线制备标准血浆用200 L缓冲液溶解，设定APC活性为200 %。取100 L，用缓冲液作3次倍比稀释，得活性为200 %，100 %，50 %和25 %4个标准点，以缓冲液做0 %标准点。取4个标准点血浆25

9、L，加入平底酶标板，加0.1 mg/mL激活剂50L，按试剂盒说明书在酶标仪上测405 nm处的吸光度值。以吸光度对APC活性作标准曲线。 1.2.6.3APC活性测定事先与DS-Oligs共孵育的血浆APC活性按说明书的方法稍加改动进行测定。用0.20 mg/mL的DS 50L及其衍生物替代激活剂。0.20 mg/mL DS 50L激活的APC活性设定为100 %。50L缓冲液不加激活剂作为空白比照。样品活性依据标准曲线计算。 1.2.7统计学分析数据以表示。所得数据用t-检验和单因素方差分析进行统计学处理。P0.05为差异有统计学意义。 2结果 2.1DS、 PSDS的1H-NMR和 13

10、C -NMR光谱分析 DS、PSDS的1H-NMR和 13C-NMR光谱及其结构中的主要双糖见图1。DS的主要双糖为IdoA-13-GalNAc-4-SO3。在PSDS的1H-NMR图谱中，与相应的DS图谱比较全部质子的化学位移向低场方向移动，类似现象也出现在13C-NMR中，GalNAc中C-6的化学位移也向低场移动（从63.89 ppm到68.60 ppm），C-5则向高场方向移动（从74.63 ppm到69.98 ppm），类似现象也出现在IdoA中。光谱显示，PSDS中的GalNAc C-6和IdoA C-2上的羟基被硫酸化了。其主要双糖结构为IdoA-2SO3-13-GalNAc4,

11、 6-diSO3。见图1。 2.2DS-Oligs的分别 用凝胶色谱法分别由DS和PSDS降解得到的寡糖见图2。收集图中数字标出的峰用于P-选择素和APC活性试验。其Mr见表1。 A、B分别代表 DS和 PSDS降解产物的分别图谱。降解产物用Superdex-30分子排阻色谱（26 mm 1200 mm）分别，用0.25 mol/L 的碳酸氢铵溶液洗脱，流速为0.5 mL/min，流出液用咔唑法检测。 图 2DS-Oligs的片段大小分别 表1DS-Oligs的Mr 2.3DS-Oligs对血小板表面P-选择素的作用 IBD患者血小板表面的P-选择素表达比比照组显著增加，由13.921.69

12、ng/mL（比照组）增加到23.952.51 ng/mL。ADP诱导后P-选择素表达显著增加 (P0.01)。 与IBD比照组和ADP组比较，全部用药组都能显著抑制P-选择素表达(P0.01)，但与正常比照组差异无统计学意义，DSOSs和PSDSOSs比较差异无统计学意义（图3）。 I, II, III, IV和 V分别代表正常比照组、IBD比照组、ADP组、DS组和PSDS组，410组分别代表表1中的DS-Oligs 17组。b P0.01 vs control group, c P0.05 vsIBD control group，d P0.01 vsIBD control group，f

13、P0.01 vs ADP group (n=10 for each group). 图3DS-Oligs对血小板表面P-选择素的作用 2.4DS衍生物对APC活性的影响 结果显示，DS及其衍生物均有提高APC活性的作用。DS寡糖活性最强的是Mr为4 825的DSOS，使APC活性由DS组的106.5 %11.5 %提高到181.8 %22.3 %（P0.01）。然后随着Mr的降低其活性也渐渐降低。PSDS的活性明显高于DS。使APC活性由DS组的106.5 %11.5 %提高到205.2 %22.1 %（P0.01）。当Mr大小相同时，PSDSOSs的活性明显高于DSOSs。随著Mr的减小，P

14、SDSOSs先是增加，活性最强的是Mr为2 749的PSDSOS3，使APC活性提高到331.2 %27.8 %，然后渐渐降低（图4）。 图4DS及其衍生物对APC活性的影响 全部化合物的结果是指方法中所述相对于0.05 mg/mLDS组100 活性比较所得APC活性提高的百分比。I、II分别代表DS组和PSDS组，28组表示表1中的DS-Oligs 17。b P0.01 vs DS group, d P0.01 vs PSDS group (n10 for each group). 3探讨 IBD是一种病因不明的胃肠道疾病。目前探讨认为，血小板功能异样可能是其中的致病因素之一，并发觉患有凝血

15、异样疾病的患者中IBD发病率低。血小板在溶血和炎症反应中有着至关重要的功能。通常状况下，血小板以非活性状态参加血液循环，但在受到诸如凝血酶、ADP和肾上腺素刺激后，血小板起先表达P-选择素，并释放炎症因子进一步促进溶血。在激活的血小板和内皮细胞中P-选择素作为细胞黏附分子，调整中性粒细胞、单核细胞的黏附，促进血液渗出。曾有报道，DS可以作为P-选择素的配体，而硫酸化程度在L-或P-选择素与DS的相互作用17,18中起重要作用。本试验结果显示，全部的DS、DSPS和其衍生物可显著抑制P-选择素在分别的血小板表面表达，但DS和PSDS的活性没有差别，它们的这种作用好像与Mr大小无关。 IBD患者患

16、血栓的几率上升归因于高凝状态。血栓是IBD的一种严峻并发症，发病率高，死亡率高。因此，体内高凝状态和致病因子的探讨引起了人们的广泛关注。UC和CD病人患动脉和静脉血栓的几率分别为1 %和8 %，一些尸检探讨中则高达39 %19。蛋白C、抗凝血酶III和蛋白S缺陷以及功能失调通常被认为是血栓病的缘由。人体内有多个抗凝系统严密限制着凝血过程，蛋白C通路即为其中的一种，它可以通过水解蛋白、灭活凝血过程中的两种因子激活的FV和FVIII20调整凝血过程。此外，UC对肝素疗法的反应、血友病和先天性出血性患者患IBD几率低的事实也表明血栓和血管堵塞在IBD病理过程中起着重要作用。 DS已广泛用于抗血栓。D

17、S的抗凝活性涉及多种机制，通过肝素辅因子II增进DS对凝血酶的抑制作用便是其中的一种。我们目前的试验旨在探讨APC体外活性增加与DS及其衍生物结构之间的关系。试验结果显示，DS及其衍生物都能增加APC活性。我们还进行了大量试验比较了不同DS衍生物的活性，并揭示DS Mr大小和硫酸化程度对活性的影响。DS衍生物的两个重要参数为Mr和分子硫酸化程度。为了明确Mr大小的影响，我们探讨了Mr范围在0.7103和5.0103之间的DS和PSDS片断的作用。结果表明， DS和PSDS片断的大小和APC活性增加的程度之间有紧密的联系。随着Mr下降，DS寡糖的活性先上升再渐渐降低。含有16到24个单糖、Mr为

18、4 825的DSOS与未分级DS相比，活性显著增加。在PSDSOSs系列中也视察到同样的趋势。活性最强的PSDSOS是Mr2 729，含有8到10个单糖的PSDSOS3。 为了探讨DS分子中硫酸基团对APC活性的促进作用的影响，我们用化学方法修饰DS使之高度硫酸化，并将它与DS原料比较。此外，也将PSDSOSs与具有相同Mr的DSOSs进行比较。PSDSOSs对APC活性的促进作用显著高于DSOSs。从上述结果可见分子水平上APC和DS寡糖间的相互作用机制困难，而这些机制与Mr、硫酸化程度以及DS的困难组成有关。明确这种作用机制对于开发新型的DS衍生物药物有重要意义。 参考文献 1Xia B,

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