蛋白质的测定使用凯氏定氮法解说.ppt

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1、项目七食品中蛋白质及氨基酸态氮的测定,【学习目标】,1、掌握食品中氮含量与蛋白质含量之间的换算。 2、掌握凯氏定氮装置的搭建技术。 3、掌握蛋白质的测定技术。,【基础知识】,1、蛋白质及氨基酸概述 蛋白质由两性氨基酸通过肽键结合在一起的大分子化合物，它主要含的元素是C、H、O、N。 一般来说，pro的平均含氮量为16/100，既一份氮相当于6.25份蛋白质，此数值称为蛋白质系数。 所以在用凯氏定氮法定量pro时，将测得的总氮%乘上pro的换算系数K=6.25即为该物质的pro含量。 注意： 含N是蛋白质区别其他有机化合物的主要标志。 不同种类食品的蛋白质系数有所不同，如玉米、荞麦、青豆、鸡蛋等

2、为6.25，花生为5.46，大米为5.95，大豆及其制品为5.71，小麦粉为5.70、全小麦、大麦、燕麦、裸麦和小米是5.83；硬果类为5.30；牛乳及其制品为6.38。,2、原理,蛋白质是含氮的有机化合物。食品与硫酸和硫酸铜、硫酸钾一同加热消化，使蛋白质分解，分解的氨与硫酸结合生成硫酸胺。然后碱化蒸馏使氨游离，用硼酸吸收后以硫酸或盐酸标准溶液滴定，根据酸的消耗量乘以换算系数，即为蛋白质的含量。 氨基酸HClN 注意 此法测定得到的蛋白质含量，实际上包括核酸、生物碱、含氮类脂、叶啉和含氮色素等非蛋白质氮化合物，故称为粗pro。,3、适用范围,国家标准第一法 适用于各种食品中蛋白质的测定,4、任

3、务分解,任务一：湿法消化 任务二：碱法蒸馏 硼酸吸收 任务三：盐酸滴定 任务四：数据记录与计算,任务一：湿法消化,子任务1：仪器及试剂的准备 仪器：,子任务1：仪器及试剂的准备,子任务2：样品预处理,固体试样 0.22g 半固体试样 25g 液体试样 1025g,样品充分混匀,直接消化,子任务3：样品称量、消化,1.000g奶粉 0.2g硫酸铜 6g硫酸钾 20mL浓硫酸 玻璃珠,小火加热炭化 至泡沫完全停止,轻摇,大火加热 保持瓶中液体微沸,至蓝绿色澄清透明 继续加热0.51h,冷却 加20mL水 冷却,同时做试剂空白试验,思考,1、玻璃珠的作用？ 2、小漏斗的作用？ 3、消化过程为什么要不

4、断转动凯氏瓶？ 4、开始消化时为什么用小火？ 5、消化液不易澄清透明时可采用的措施？ 6、消化完成时的产物？ 7、加20mL水的作用？ 8、空白试验的目的？,任务二：碱法蒸馏、硼酸吸收,子任务1：仪器及试剂的准备 仪器：,10mL,100mL 3只,子任务1：仪器及试剂的准备,水蒸气发生器： 装水至2/3处，加入数粒玻璃珠，加甲基橙指示剂数滴及硫酸数ml，使水呈微红色按上图所示搭好装置 注意 装置搭建好了之后要先进行捡漏，利用虹吸原理。 在蒸汽发生瓶中要加甲基橙指示剂数滴及硫酸数ml以使其始终保持酸性，以防水中氨蒸出。,子任务1：仪器及试剂的准备,试剂： 40%氢氧化钠 20%硼酸溶液 混合指

5、示剂 1、1份甲基红乙醇溶液（1g/L）与5份溴甲酚绿乙醇溶液（1g/L）临用时混合 酒红色绿色 2、2份甲基红乙醇溶液（1g/L）与1份亚甲基蓝乙醇溶液（1g/L）临用时混合 紫红色绿色,子任务2：碱化蒸馏、硼酸吸收,10.0mL硼酸溶液 100mL三角瓶 加12滴混合指示剂 冷凝管下端插入三角瓶液面下 准确吸取10mL试样 由小玻杯流入反应室 少量水洗涤小漏斗 盖紧玻璃塞 量筒取10.0mLNaOH溶液 倒入小玻杯 提起玻塞使其缓慢流入反应室 立即塞紧玻璃塞 加水于小玻杯防漏气 通蒸汽 颜色变化时开始计时蒸馏5min 移动接受瓶使液面离开冷凝管下端 再蒸馏1min 用少量水冲洗冷凝管下端外

6、部 取下接收瓶,注意 加入NaOH一定要过量，判断NaOH是否过量的方法，看反应室内液体颜色,加碱足量的判断： 溶液会变成深蓝色或产生黑色沉淀 原理：过量的氢氧化钠会跟硫酸铜反应生成氢氧化铜蓝色沉淀，蓝色沉淀在加热的情况下会分解成黑色的氧化铜沉淀。 如果没有上述现象，说明氢氧化钠加的量不足，需要继续加入氢氧化纳，直到产生上述现象为止。,样液中的硫酸铵在碱性条件下释放出氨，为防止样液中氨气逸出。一是加入氢氧化钠溶液要过量，二是要水封，三要夹紧废液蝴蝶夹后再通蒸汽，四要在蒸馏过程中要注意接头处有无松漏现象 加热蒸馏出来的氨可以用硼酸进行吸收，因为硼酸只呈微弱酸性，不影响指示剂的变色反应，但是具有吸

7、收氨的作用，与氨形成强碱弱酸盐 。 冷凝管下端先插入硼酸吸收液液面以下才能蒸馏。吸收液温度不应超过40，避免氨气逸出，若超过时可置于冷水浴中使用。,检验蒸馏是否完成的方法：奈氏试纸法。原理:NH4+或NH3遇奈氏试剂会反应生成综红色的碘化汞铵化合物，如NH4+或NH3含量较少，试纸呈黄色，若含量过多，呈棕黄色或棕红色的沉淀反应 在蒸馏时，蒸汽发生要均匀充足，蒸馏过程中不得停火断汽,否则会发生倒吸。 蒸馏完毕后，应先将冷凝管下端提离液面，再蒸1分钟，将附着在尖端的吸收液完全洗入吸收瓶内，再将吸收瓶移开，最后关闭电源，绝不能先关闭电源，否则吸收液将发生倒吸。 所用的试剂溶液 必须用无氨蒸馏水配制。

8、,任务三：盐酸滴定,子任务1：仪器及试剂的准备 仪器： 25mL酸式滴定管1套 试剂 0.0500mol/L HCL标准溶液,子任务2：盐酸滴定,接收瓶 以HCL标准滴定液滴定 灰色终点 记录VHcl,注意 混合指示剂在碱性溶液中呈绿色,在中性溶液中呈灰色,在酸性溶液中呈红色。 酸式滴定管的正确使用,任务四、数据记录与计算,有效数字： 蛋白质含量1 g/100 g时，结果保留三位有效数字 蛋白质含量1 g/100 g时，结果保留两位有效数字。 精密度： 在重复性条件下的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的10%,（g/100g）,小结,凯氏定氮法用于所有动物、植物类食品的蛋白质含量的

9、测定，但因样品中含有核酸、生物碱、含氮类脂、卟啉以及含氮色素等非蛋白质含氮化合物，所以测定结果为粗蛋白质含量。 若要测定样品的蛋白氮,则需要向样品中加入三氯乙酸溶液,使其最终浓度为5%,然后测定未加入三氯乙酸的样品及加入三氯乙酸溶液后样品中的含氮量,进一步计算出蛋白质含量: 蛋白氮=总氮-非蛋白氮,任务五：试验器具的清洗整理,【拓展学习】,1、其他蛋白质测定方法分光光度法 （1）原理 食品中的蛋白质在催化加热条件下被分解，分解产生的氨与硫酸结合生成硫酸铵，在pH 4.8 的乙酸钠-乙酸缓冲溶液中与乙酰丙酮和甲醛反应生成黄色的3,5-二乙酰-2,6-二甲基-1,4-二氢化吡啶化合物。在波长400

10、nm下测定吸光度值，与标准系列比较定量，结果乘以换算系数，即为蛋白质含量。 （2）特点 快速、污染少、操作简单、省时 国家标准测定蛋白质第二法,2、改良式凯氏装置,3、自动凯氏定氮法 1.原理 同常量凯氏定氮法 2.主要仪器 自动凯氏定氮仪：该装置内具有自动加碱蒸馏装置，自动吸收和滴定装置以及自动数字显示装置。 消化装置：由优质玻璃制成的凯氏消化瓶及红外加热装置组合成的消化炉。 3、试剂 除硫酸铜与硫酸钾制成片剂外，其他试剂与常量测定相同。 4、优点 灵敏、准确、快速以及用量少,准确称取某乳粉样品0.800克，经凯氏法消化定容至100ml，移取5ml消化液进行蒸馏，用20ml硼酸吸收，再用0.

11、05000mol/lHCl滴定，结果消耗5.00ml，试计算该乳粉的蛋白质含量？ 试述蛋白质测定中，样品消化过程所必须注意的事项，消化过程中内容物颜色发生什么变化？为什么？ 样品经消化进行蒸馏前，为什么要加入氢氧化钠？这时溶液发生什么变化？为什么？如果没有变化，说明什么问题？须采用什么措施？,子项目二 14酱油中氨基酸态氮的测定 （GB/T 5009.39-2003 ）,任务一：相关仪器设备及试剂的准备,仪器设备：碱式滴定管、移液管、200mL烧杯、100容量瓶、酸度计、磁力搅拌器、滴定台 试剂：浓度为36%中性甲醛；氢氧化钠标准溶液：0.05mol/L（需临用前标定）,任务二：成分分析,1.

12、原始记录表格的设计,2.样品中游离酸中和,吸取5mL试样100mL容量瓶中定容混匀后吸取20.0mL200mL烧杯加水60mL插入酸度计的指示电极和参比电极开动磁力搅拌器0.050mol/L氢氧化钠标准溶液滴定至酸度计指示pH8.2记录消耗体积,3.滴定样品中氨基酸酸基含量,上述烧杯加入10mL甲醛溶液混匀再用0.05mol/L氢氧化钠标准的溶液继续滴定至pH9.2记录消耗体积V1,【拓展】,本法原理： 氨基酸含有酸性的-COOH和碱性的-NH2，它们相互作用使氨基酸成为中性的内盐，不能直接用碱液滴定它的羧基。当加入甲醛时，氨基与甲醛结合，其碱性消失，使羧基显示出酸性，这样就可以用氢氧化钠溶液滴定-COOH，并用间接法测定氨基酸的总量。,4.空白试验,取80mL蒸馏水200mL洁净烧杯先用氢氧化钠标准溶液滴定pH8.2加入10.00mL中性甲醛溶液用氢氧化钠标准溶液（0.050mol/L）滴定至pH9.2记录消耗体积V2,5.数据处理,精密度：在重复性条件下的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的10%,任务三：试验器具的清洗整理,