苯硫脲尝味遗传大实验.ppt

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1、苯硫脲尝味的遗传学调查,遗传学大实验注意事项,1实验的每一步都要详细地记录操作内容、时间、步骤、结果等，以备查询。 2对任何自己不熟悉的实验仪器都不要随意操作（尤其是微量移液器）。在操作的过程中发现任何意外的现象都要及时向任课教师汇报。 3在实验的过程中制造的任何垃圾都要丢到垃圾筐里（或先放在自己的桌面一角），严禁随地投弃！特别注意对废弃细菌的杀灭和有毒垃圾的定点投放。 4.实验结束后要把用过的器皿清洗后归放整齐并清点数目，向教师汇报征得同意后方可离开实验室。,1.实验目的,（1）测定人群中PTC 尝味基因的表现型和基因型，理解孟德尔遗传基因型与表现型的对应关系。 （2）了解酶切扩增多态序列（

2、cleaved amplified polymorphic sequence，CAPS） （又称为PCR-RFLP）技术的原理，学会用CAPS 技术检测单核苷酸多态性 （SNPs）。在分子水平上测定PTC 尝味的基因型。 （3）计算群体中PTC 尝味的基因频率，判断群体是否达到Hardy-weiberg 平衡。,2. 实验原理,2.1 苯硫脲尝味的遗传形式 苯硫脲（phenylthiocarbamide，PTC）是硫脲的 苯基衍生物（图2.1），为白色结晶粉末，因含有硫代酰胺基（N-C=S）官能团而有苦涩味。能尝1/750,0001/50,000 PTC 浓度溶液味道的人（苦涩味，少数人感到甜

3、味）称为苯硫脲“尝味者（taster）”；只能尝出PTC 浓度大于1/24,000 溶液的味道（甚至对PTC 的结晶物也尝不出苦味）的人称为苯硫脲“味盲者（nontaster）”。,PTC 尝味能力是受单基因控制的孟德尔遗传性状，是由位于7 号染色体上（7q35-7q36）的一种苦味味觉感受器基因TAS2R38 决定的，属于常染色体不完全显性遗传。尝味者中显性基因T的纯合子(TT)能尝出1750,000 16,000,000的PTC 溶液的苦味，杂合子(Tt) 只能尝出1480,000l380,000 的PTC 溶液的苦味。因此可以利用对PTC 的尝味能力测定家族中的基因传递和人群中的基因频率

4、。,2.2 人类苯硫脲尝味的基因 人类的 PTC 尝味基因Homo sapiens taste receptor, type 2, member38(TAS2R38)(NM_176817)，又名PTC、T2R38 或 T2R61。绝大多数尝味者与味盲者的区别在于三处单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphisms，SNPs)：,第一处：145 位，味盲者为G145（编码丙氨酸ala），尝味者为C145（编码脯氨酸pro）； 第二处：785 位，味盲者为T785（编码缬氨酸val），尝味者为C785（编码丙氨酸ala）； 第三处：886 位，味盲者为A886（编码异

5、亮氨酸ile），尝味者为G886（码缬氨酸val）。,因此味盲者PTC 多肽中三处对应的氨基酸分别是ala49、val262 和ile262，被称为AVI 等位基因，而尝味者的三处是pro49、ala262 和val262，被称为PAV 等位基因（图2.2，2.3）。,图 2.2 味盲者PTC 尝味基因编码区（CDS）序列,图2.3 味盲者PTC 多肽,味盲者的PTC 编码区有五个限制性内切Fnu4H1 的识别位点（识别序列5-GCNGC-3），如果是尝味者，则其第785 位SNP 恰好形成了一个额外的Fnu4H1 识别位（GCTGC）。因此可以利用这个SNP 造成的限制性位点多态性，设计引物

6、扩增包含785 位SNP 位点的PTC 基因编码区的一部分，然后用Fnu4H1切割扩增产物，根据是否能把扩增产物切开而判定是某个人的单倍型（haplotype）。,4. 实验步骤,（1）讲解实验目的、实验原理、实验技术路线。 （2）讲解口腔上皮细胞总DNA 的快速提取、基因PCR 扩增、DNA 电泳、PCR 产物纯化、DNA 酶切、遗传学分析等实验方法及注意事项。 （3）讲解高压蒸气灭菌锅、高速离心机、小型瞬时离心机、电泳仪、水平电泳槽、涡旋振荡器、磁力搅拌器、电子天平、PCR 仪、微波炉、紫外分光光度计、电磁炉、恒温水浴锅、恒温干热议、凝胶成像仪、制冰机、超净工作台、通风橱、恒温振荡摇床、3

7、7培养箱、pH 计、微量移液器、冰箱、-80超低温冰箱等主要仪器设备以及必须的电脑软件的使用方法、注意事项；,4.2.1 实验材料 4.2.1.1 主要仪器设备 高压蒸气灭菌锅、磁力搅拌器、电子天平、超净工作台、恒温水浴锅、冰箱。 洁净、经121高压灭菌20min 的容量瓶、量筒、烧杯、螺口试剂瓶，一次 性医用无菌PE 手套、乳胶手套、塑料滴管，一次性纸杯，记号笔。,4.2 PTC 尝味能力的测定,4.2.1.2 试剂和材料 （1）材料：受试者为全体修读遗传学大实验的学生。 （2）试剂：苯硫脲（PTC）结晶，娃哈哈纯净水。,4.2.1.3 溶液配制 （1）原液（1 号液）：称取PTC 结晶0.

8、65 g，加娃哈哈纯净水500 ml，在室温(20左右)下溶解l2d（经常摇晃）（或60水浴中1 h 充分溶解），PTC 浓度约为1750，过滤灭菌。 （2）稀释液：用娃哈哈纯净水逐级稀释原液214 倍，编为2-14 号（表4.1）。 将配好的14 种浓度的PTC 溶液，过滤灭菌，分别置于灭菌过的100 ml 螺口试剂瓶中。另取娃哈哈纯净水作为第15 号液。,4.2.2 实验方法 （1）让受试者正坐，仰头张嘴伸舌，用滴管滴23 滴 15 号液于受试者舌根部，让受试者慢慢咽下反复咂嘴品味液体尝味，然后用纯净水做同样的试验，交替给 受试者尝味，避免受试者的臆意猜测而影响结果的准确。 （2）询问受试

9、者能否鉴别此两种溶液的味道。 （3）若不能鉴别或鉴别不准，则依次用 141 号溶液 重复试验，直到能明确鉴别出PTC 的苦味为止。 （4）复尝味3 次，3 次结果相同时，才是可靠。 （5）记录所品出苦味的液体的编号和稀释浓度。,注：统计民族、生源地是想调查PTC 味盲分布与民族和地理位置是否有相关性。（此生源地统计的不是受试者户籍所在地，而是其家族或家庭成员长期生活的地方）,4.3 人口腔上皮细胞总 DNA 的提取,4.3.1 实验材料 4.3.1.1 主要仪器设备 高压蒸气灭菌锅、磁力搅拌器、电子天平、超净 工作台、恒温水浴锅、涡旋振荡器、高速离心机、 恒温振荡摇床、微量移液器、电磁炉、冰箱

10、、 -80超低温冰箱、计时器、pH 计。 洁净、经 121高压灭菌 20min 的量筒、烧杯、螺口试剂 瓶、牙签、1.5 mL灭菌微量离心管、微量移液器 吸头（枪头），离心管架，一次性医用无菌 PE 手套、乳胶手套、口罩，记号笔。,4.3 人口腔上皮细胞总 DNA 的提取,4.3.1.2 试剂和材料 （1）材料：每实验小组选取 1 名受试者，用灭 菌牙签刮取口腔上皮细胞。 （2）试剂：灭菌水，pH 标准液，细胞基因组 DNA 提取试剂盒,4.3 人口腔上皮细胞总 DNA 的提取,4.3.2 实验方法 （1）在 1.5 ml 灭菌微量离心管中加入 100 L 灭菌水。 （2）受试者用无菌牙签轻刮

11、口腔腮内侧，刮下来 的细胞在灭菌水中漂洗。 （3）涡旋振荡器涡旋振荡混匀 10 s， （4）离心机瞬时离心 10 s。 （5）沸水浴中煮沸 5 min。 （6）离心机 13200rpm 离心 2 min。 （7）基因组 DNA 4C 保存备,4.5 PTC 基因PCR扩增产物的电泳检测,4.5.1. 主要仪器设备 高速离心机、小型瞬时离心机、电泳仪、水平电泳槽、电子天平、微波炉、凝胶成像仪、制冰机、超净工作台、通风橱、微量移液器、冰箱、-80超低温冰箱。 洁净、经121高压灭菌20min 的、微量移液器吸头（枪头），离心管架， PCR管架，三角瓶，一次性医用无菌 PE手套，记号笔，保鲜袋，微波

12、炉用手套，三角瓶，搪瓷盘。,4.5.2. 试剂和材料 （1）材料：受试者PTC 基因PCR 产物 （2）试剂：Tris 碱，冰乙酸，Na2EDTA.2H2 O,溴化乙锭，琼脂糖，Marker I 4.5.3. 溶液配制 （1）50 TAE 电泳缓冲液（储存液，pH约8.5）：Tris 碱 242g，57.1ml 冰乙酸，37.2g Na2 EDTA.2H2 O ，去离子水定容至1L （2）1 TAE 电泳缓冲液（工作液）：取50TAE 电泳缓冲液，去离子水稀释50倍,(3）0.5mg/ml 溴化乙锭（EB）（1000 储存液）：50mg 溴化乙锭溶于100mL dd water，4C 避光储存

13、）。 (4) 溴化乙锭（EB）工作液：0.5mg/ml EB（1000 储存液），去离子水稀释 1000倍。（注：EB为扁平分子，可以嵌入DNA，为潜在诱变剂，接触时须带一次性医用无菌PE手套，但也不是洪水猛兽，不小心溅到皮肤上时，不会被皮肤吸收只是停留在表面，用大量流水冲洗即可）。,（1）配制 1.2%琼脂糖凝胶：称取 0.6g 琼脂糖粉，放入三角瓶，加入50ml 1 TAE电泳缓冲液，放入微波炉中加热，并不断取出混匀，注意观察烧瓶中的琼脂糖粉末，直至完全熔解（烫，戴手套）。50ml 正好倒一块大胶（切不可让胶溶液溢出到微波炉中！）。（2）将胶液置桌面上室温冷却致热但不烫手（约50-60）。

14、,4.5.2 实验方法,（3 ）把梳子插到凝胶灌制模具的正确位置后缓缓倒入胶溶液。胶溶液倒至与模具的矮边缘相平即可。在桌面上静置10-20 分钟待胶完全凝固.（剩下的胶溶液封口后留待以后再熔化使用），小心拔出梳子，凝胶没入电泳槽电泳液中，凝胶上有样品孔的一侧要朝向电泳槽的负极。,（4）取 1 片光面纸，点 5uL 灭菌水、2uL 6 加样缓冲液，再加入 5uL PCR 产物制成10uL DNA 样品。 （5）在凝胶上选择相邻的加样孔。用10ul 的吸液头 分别依次加入5uL Marker I 对照，各小组12uL PCR 产物电泳样品（互相比较） （6）根据电泳槽的长度把电泳仪的电压调至120

15、V (10V/cm)，电泳2030min。（注意正负电极的位置连 接正确）。 （7）把凝胶小心放入盛有 EB的搪瓷盘中，染色 10分钟 后，取出用自来水浸泡10min 。 （8）放入凝胶成像系统中拍照。,4.6.1 实验材料 4.6.1.1 主要仪器设备 高压蒸气灭菌锅、高速离心机、小型瞬时离心机、涡旋振荡器、磁力搅拌器、恒温水浴锅、恒温干热议、制冰机、紫外分光光度计、微量移液器、冰箱、-80超低温冰箱。 洁净、经121高压灭菌20min 的1.5 mL 灭菌微量离心管、微量移液器吸头（枪头），离心管架，一次性医用无菌PE 手套，塑料饭盒，记号笔。,4.6 PTC 基因PCR 产物酶切,4.6

16、.1.2 试剂和材料 （1）材料：受试者PTC 基因PCR 产物 （2）试剂：限制性内切酶Fnu4H1,4.6.2 实验方法 （1） 提前2 h 将恒温水浴锅或恒温干热仪(或恒温水浴锅)电源打开，调节工作温度稳定至37 C。 （2）从制冰机中盛取碎冰（0C ），从冰箱中取出所需试剂，在碎冰中解冻 （3）将试剂在涡旋振荡器上涡旋振荡混匀10 s （4）瞬时离心10 s。 （5） 取1L 受试者 PTC 基因纯化DNA，用紫外分光光度计测定其260nm、280nm 下的紫外吸光光度值，进行DNA 定量分析。,（6）在碎冰上按照配方和顺序在1.5 mL 微量离心管中配制酶切缓冲液（为保持酶活性及DNA 切割效率，始终在低温下配制）： 灭菌超纯水 补足15L 10酶切缓冲液 1.5L 5 units/L Fnu4H1 1L PTC 基因纯化DNA 1g （根据DNA 定量结果加入适当体积溶液） 总体积 15L （7）37C 恒温酶切过夜 （8）酶切产物4C 保存备用,Thank You !,