基因重组与基因工程.ppt

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1、关于基因重组与基因工程现在学习的是第1页，共49页第二节 工具酶第三节 自然界的基因转移和重组第一节 概述第四节 基因载体第五节 目的基因第六节 重组DNA技术的基本过程第七节 基因工程在医学上的应用第十五章基因重组与基因工程现在学习的是第2页，共49页分子克隆：在体外对DNA分子按照既定的目地和方案进行人工重组，将重组DNA分子导入合适的受体细胞中，使其在细胞中扩增繁殖，以获得目地DNA分子的大量拷贝，并使受体细胞获得新的遗传性状的过程。基因工程：利用分子克隆技术操作目地基因，并改变生物遗传性状的过程，即采用类似工程技术的方法，在体外进行基因重组，使重组基因在适当的宿主细胞中得到表达。第一节

2、 概述 结束放映返回目录现在学习的是第3页，共49页第二节 工具酶 指能用于DNA和RNA分子的切割、连接、聚合、反转录等基因操作有关的各种酶系，统称为工具酶。结束放映返回目录现在学习的是第4页，共49页结束放映返回目录常 用 的 工 具 酶(接下表)DNA连接酶连接双链DNA分子中的单链切口形成磷酸二酯键工具 酶名称 主 要 功 能DNA聚合酶I53DNA聚合酶活性限制性核酸识别双链DNA的特异序列，切割DNA53外切酶活性35 外切酶活性内切酶现在学习的是第5页，共49页常 用 的 工 具 酶 工具 酶名称 主 要 功 能在3-OH末端进行同一多聚物加尾反转录酶DNA末端转移酶碱性磷酸酶去

3、除DNA、RNA、dNTP的5磷酸基团结束放映返回目录以RNA或DNA链为模板合成互补的cDNA链，水解杂化双链中的RNATaq DNA 聚合酶能在高温（72）下，以单链DNA为模板，从53方向合成新生的互补DNA链现在学习的是第6页，共49页限制性核酸内切酶按限制性核酸内切酶的分解模式，分为三类类型I 有识别位点,切割长短不一且无特异性类型II 具有识别和切割的特异性，切割后产 生粘性末端或平头末端类型III 界于I和II之间1、限制性核酸内切酶的分类结束放映返回目录现在学习的是第7页，共49页 均能严格地识别特定核苷酸的序列（4 8个碱基对 ）。 大多数识别位点具有180度旋转对称的 结构

4、形式（回文结构）。 能在识别的核苷酸序列当中或附近切割 双链DNA。2、II型酶识别序列特点：结束放映返回目录现在学习的是第8页，共49页3、II型限制性内切酶的切割方式三种切割方式 一种是在对称轴5 侧切割产生5粘端， EcoRI 5-N GAATTC N-3 5-NG AATTGN-3 结束放映返回目录 3-N CTTAAG N-53-NCTTAACN-5 5粘性末端GAATTCCTTAAG现在学习的是第9页，共49页结束放映返回目录另一种是在对称轴的3侧切割产生3粘端，PstI5-N CTGCAG N-33-N GACGTC N-5CTGCAGGACGTC5-N CTGCA3-N GCT

5、GCAGG N-3ACGTC N-5GACGTC3-粘性末端现在学习的是第10页，共49页第三种切割方式是在对称轴处切割，就产生平末端 SmaI5-N CCC GGG N-33-N GGG CCC N-5CCC GGGGGG CCC5-N CCC3-N GGGCCCGGGGGG N-3CCC N-5GGGCCC平头末端结束放映返回目录现在学习的是第11页，共49页4、某些限制性内切酶的识别切割序列结束放映返回目录Hind NotPst Pvu TthBamHCla EcoREcoRHae5- GGATCC- 3 5-ATCGAT-3 5- GAATTC-3 5-GATATC-3 5 -GGCC

6、-3 5- AAGCTT-3 5- GCGGCCGC-3 5- CTGCAG-3 5- CAGCTG-3 5-GACNNNGTC-3 现在学习的是第12页，共49页 DNA连接酶 连接双链DNA分子中的单链切口,形成磷酸二酯键 主要应用：DNA片段粘性末端连接。DNA片段平头末端连接（效率低100-200倍） 结束放映返回目录OH5533P连接酶5533现在学习的是第13页，共49页末端脱氧核苷酸转移酶能催化dNTP依次聚合到DNA的3末端。以3端突出的DNA末端最好。主要应用：给目的DNA、cDNA和载体加上互补的多聚脱氧核苷酸尾巴 (人工粘性末端)。结束放映返回目录现在学习的是第14页，共

7、49页结束放映返回目录53355533载体DNA+dGTP目的DNA+dCTP末端脱氧核苷酸转移酶3333PolyGPolyGPolyCPolyCPolyGPolyC同聚物加尾连接法现在学习的是第15页，共49页逆转录酶以mRNA为模板，利用逆转录酶催化合成与mRNA互补的DNA。合成的产物称cDNA(complementary DNA)主要应用：逆转录合成cDNA及DNA探针，补平和标记粘性末端。结束放映返回目录现在学习的是第16页，共49页mRNA3AAAAAA5TTTTTT5逆转录酶4种dNTPRNA-DNAAAAAAA533TTTTTT 5结束放映返回目录RNA-DNA杂交体的生成现在

8、学习的是第17页，共49页DNA聚合酶I主要应用：DNA序列分析、催化DNA切口平移制备探针、DNA 3端标记、cDNA第二链的合成。结束放映返回目录现在学习的是第18页，共49页第三节 自然界的基因转移和重组-细菌中遗传物质的几种转移形式:接合转化转导转座结束放映返回目录现在学习的是第19页，共49页接合染色体DNAF因子转移细菌接合：指通过细菌鞭毛的直接接触，遗传信息从供体细胞单向转移到受体细胞的过程。1、接合作用结束放映返回目录供体细胞受体细胞现在学习的是第20页，共49页2、转化作用转化：自动的获取或人为的供给外源DNA，使细胞或培养的受体细胞获得新的遗传表型。细胞溶解新细菌摄取DNA

9、重组图 15-2 转化作用结束放映返回目录供体细胞受体细胞现在学习的是第21页，共49页3、转导作用、转导作用转导：通过病毒或噬菌体介导发生在供体细胞与受体细胞之间的DNA转移及基因重组。溶 菌感 染重 组感 染细 菌噬菌体结束放映返回目录供体细胞受体细胞现在学习的是第22页，共49页4、转座转座：由插入序列和转座子介导的基因转移或重排。 结束放映返回目录现在学习的是第23页，共49页第四节第四节 基因载体基因载体一、载体的概念 携带和运载目的DNA进入宿主细胞的一些DNA分子, 它可以使目的DNA随着宿主细胞的增殖而无性繁殖或/和在宿主细胞中表达目的DNA。 可分为克隆载体和表达载体。 结束

10、放映返回目录现在学习的是第24页，共49页 作为载体的作为载体的DNADNA分子有质粒分子有质粒DNADNA，噬，噬菌体菌体DNADNA和病毒和病毒DNADNA等。它们经人为改造等。它们经人为改造后在宿主细胞中只具有自我复制能力的后在宿主细胞中只具有自我复制能力的DNADNA为克隆载体；能使插入的目的为克隆载体；能使插入的目的DNADNA无无性繁殖，并使其在宿主细胞中表达而特性繁殖，并使其在宿主细胞中表达而特意设计的意设计的DNADNA为表达载体。为表达载体。结束放映返回目录二、载体的种类现在学习的是第25页，共49页 质粒：质粒：是是存在于细菌染色体外小型存在于细菌染色体外小型双链环状双链环

11、状DNADNA，能在宿主细胞中独立，能在宿主细胞中独立地复制，并在细胞分裂时传递给子代地复制，并在细胞分裂时传递给子代细胞，其细胞，其DNADNA分子上的基因对宿主细分子上的基因对宿主细胞的代谢活动和抗药性的表型均有一胞的代谢活动和抗药性的表型均有一定的作用定的作用。可赋予细菌特定的表型，可赋予细菌特定的表型，如抗生素抗性，是如抗生素抗性，是筛选转化子细菌的筛选转化子细菌的遗传标志。遗传标志。结束放映返回目录现在学习的是第26页，共49页pUC192686bpEcoRISaclKpnlSmal XmalBamHlXbalHincllPstlSphlHindlllamprlacllac Zori

12、0447Amlll 806Ppai 1765Ctr10i1 1779Gsul 1784Scal 2177Xmnl 2294Sspl 2501Aatll 26117EcoO 1092674Ndel 183Narl 235Plac质粒质粒 pUC19pUC19结束放映返回目录现在学习的是第27页，共49页三、载体的特点1、载体必须是复制子，在宿主 细胞中能大量复制。2、同一限制性核酸内切酶在载 体上只有单一酶切位点。3、具有选择性遗传标志。现在学习的是第28页，共49页 一、概念 为基础研究和应用研究的需要而分离获得的某一感兴趣的基因（DNA序列），或者是为得到某一感兴趣的蛋白质或RNA所对应的D

13、NA序列。有两种类型，既cDNA和基因组DNA。 二、目的基因的获取（见后）第五节 目的基因结束放映返回目录现在学习的是第29页，共49页第六节 重组DNA技术的基本过程制备目的基因和相关载体。将目的基因和载体进行体外连接。将重组的载体DNA导入宿主细胞。DNA重组体的筛选和鉴定。DNA重组体的扩增表达。结束放映返回目录现在学习的是第30页，共49页载 体+重组子转化或转染目的DNA细 菌重组DNA增殖筛选含重组质粒的细菌（以质粒为载体的DNA克隆过程）结束放映返回目录阳性克隆的筛选及扩增现在学习的是第31页，共49页一、目的基因的获取一、目的基因的获取1、从基因组DNA中分离获得2、从基因文

14、库中筛选获得 （基因组文库及cDNA文库）3、化学合成法4、PCR扩增5、mRNA逆转录结束放映返回目录现在学习的是第32页，共49页1 1、从基因组、从基因组DNADNA文库中筛选获得文库中筛选获得（1）基因组DNA文库：分离组织或细胞染色体DNA，用限制性核酸内切酶将其切割成许多片段后将它们与克隆载体拼接成重组DNA，将所有的重组DNA分子都引入宿主细胞并进行扩增，得到分子克隆的混合体称基因组DNA文库。结束放映返回目录现在学习的是第33页，共49页（2）文库的筛选：n直接选择法：抗药性选择、分子探针、标志补救（如-互补筛选）。 免疫学方法：利用特异抗体与目的基因表达产物相互作用进行的筛选

15、（如酶免检测分析）。结束放映返回目录现在学习的是第34页，共49页多克隆位点 启动子裂开的N端裂开的N端外源DNA 半乳糖苷酶N端编码序列染色体重组体pUC18细菌在含X-gal和乳糖操纵子诱导剂的琼脂上培养细菌在含X-gal和乳糖操纵子诱导剂的琼脂上培养pUC18含重组体pUC18的白色菌落蓝色菌落含载体pUC18的蓝色菌落 半乳糖苷酶C端编码序列转化转化 ampr Ampr(利用 互补原理筛选重组子Puc18)pUC182686bppUC182686bp结束放映返回目录现在学习的是第35页，共49页结束放映返回目录现在学习的是第36页，共49页硝酸纤维膜菌落琼脂培养板硝酸纤维膜复制培养溶菌

16、、中和蛋白酶处理漂洗、烘干 1、32P探针杂交 2、放射自显影 鉴定克隆（含感兴趣DNA） 原位杂交结束放映返回目录现在学习的是第37页，共49页2、从cDNA文库中筛选获得（1）cDNA文库：将总mRNA逆转录生成cDNA，再复制成双链cDNA的混合体并与适当的载体进行拼接成重组DNA，使每一个cDNA分子只与一个载体分子拼接成重组DNA。将所有的重组DNA分子都引入宿主细胞并进行扩增，得到分子克隆的混合体，这样一个混合体就称为cDNA文库（2） cDNA文库的筛选：（见上）结束放映返回目录现在学习的是第38页，共49页3、化学合成法 用DNA合成仪合成所需要的目的基因片断。 结束放映返回目

17、录 PCR是一种在体外利用DNA聚合酶催化反应获得特异序列的基因组DNA或cDNA的技术。 （详见后第22章PCR）4、PCR法：现在学习的是第39页，共49页二、目的基因与载体的连接二、目的基因与载体的连接粘性末端连接利用人工接头连接加入同聚体尾连接结束放映返回目录现在学习的是第40页，共49页细菌质粒CCGGGGCCHpaIICGG C C GGCCCGG CCGGGGCC GGCC哺乳动物DNA片断HpaIICGG C C GGC+混合、DNA连接酶催化细菌质粒与哺乳动物DNA片断共同构重的重组质粒(同一限制酶切割DNA粘性末端的连接)CCGGGGCCCCGGGGCC结束放映返回目录现在

18、学习的是第41页，共49页三、重组三、重组DNA导入宿主细胞导入宿主细胞常用的方法有以下几种：（一）转化（二）感染（三）转染结束放映返回目录 选择适当的宿主细胞，处理使之成为感受态细胞，然后导入重组DNA。现在学习的是第42页，共49页四、目的基因的筛选和鉴定 （见前DNA文库的筛选）结束放映返回目录 举例：以质粒PBR322为载体的目的基因DNA克隆过程现在学习的是第43页，共49页质粒载体PBR322现在学习的是第44页，共49页pstI限制性内切酶目的基因DNADNA连接酶转化E.coli细胞宿主rr结束放映返回目录现在学习的是第45页，共49页宿主转化E.coli细胞转化细胞的筛选所有

19、的克隆都含质粒含四环素的琼脂平板转移接种检测克隆含有重组质粒的克隆含四环素的琼脂平板（对照） 含氨苄青霉素+四环素的琼脂平板现在学习的是第46页，共49页五、克隆基因的表达 以上部分内容为基因克隆，采用该技术还可进行基因表达以实现研究、医药或商业目的。克隆基因的表达是指通过将外源目的基因克隆后在宿主细胞中通过正确的转录、翻译合成相应的蛋白质或RNA的过程。表达可以在原核及真核系统中进行。结束放映返回目录现在学习的是第47页，共49页 外源基因在载体上表达必须具备：强的启动子、核糖体结合位点、翻译起始位点。1、原核表达体系 如：大肠杆菌、枯草杆菌表达系统。2、真核表达体系 如：酵母、昆虫、哺乳动物细胞表达系统。结束放映返回目录现在学习的是第48页，共49页感谢大家观看现在学习的是第49页，共49页