14 QNS-SQX二合一检测细则.pdf

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1、福建森宝食品集团股份有限公司企业标准 Q/JCWI 02142013 动物性食品中“动物性食品中“QNSQNS- -SQXSQX”二合一药物残留检”二合一药物残留检测测 酶联免疫吸附法酶联免疫吸附法 2013 - 08 - 01 发布 2013 - 08 - 01 实施 福建森宝食品集团股份有限公司 发 布 Q/JCWI 02142013 1 前 言 本标准按照GB/T 1.1标准化工作导则 第1部分：标准的结构和编写给出的规则起草 本标准由公司检测中心提出并审核 本标准起草单位：检测中心 本标准起草人：张超红 本标准批准人：黄金兰 本标准于2013年8月1日首次发布。 Q/JCWI 0214

2、2013 2 修改履历表修改履历表 版本版本 章节章节 条款条款 修改内容或记录号修改内容或记录号 修改人修改人 （起草人）（起草人） 批准人批准人 修改日期修改日期 （发布日期）（发布日期） 实施日期实施日期 A/0 全新发布 张超红 黄金兰 2013.8.1 2013.8.1 Q/JCWI 02142013 3 动物性食品中“QNS-SQX”二合一药物残留检测 酶联免疫吸附法 1 范围 本标准规定了动物可食性组织中氟喹诺酮类、 磺胺喹噁啉药物残留量， 酶联免疫检测方法的制样和检测方法。 本标准适用于猪肌肉、鸡肌肉氟喹诺酮类、磺胺喹噁啉药残留量的测定。 2 试验原理 试剂盒采用竞争ELISA

3、方法，在酶标板微孔条上预包被偶联抗原，样本中残留的氟喹诺酮类药物、磺胺喹噁啉和相对应的酶标板微孔条上预包被的偶联抗原竞争抗氟喹诺酮类药物或抗磺胺喹噁啉抗体，加入酶标二抗后，用TMB底物显色，样本吸光度值与其所含残留物氟喹诺酮类药物或磺胺喹噁啉的含量成负相关，与标准曲线比较，再乘以其对应的稀释倍数，即可得出样本中氟喹诺酮类药物或磺胺喹噁啉的残留量。 3 交叉反应率 3.1 氟喹诺酮类药物交叉反应率 诺氟沙星100% 双氟沙星84% 恩诺沙星100% 氟甲喹126% 沙拉沙星107% 达氟沙星110% 培氟沙星146% 环丙沙星110% 依诺沙星66% 氧氟沙星（消旋体）58% 左氧氟沙星 10%

4、 噁喹酸28% 洛美沙星 4% 麻保沙星 4% 3.2 磺胺喹噁啉交叉反应率 磺胺喹噁啉100% 磺胺二甲基嘧啶3.2% Q/JCWI 02142013 4 磺胺甲基嘧啶1.1% 磺胺甲氧哒嗪3.4% 磺胺甲基异噁唑0.9% 磺胺间甲氧嘧啶0.8% 磺胺噻唑 0.55% 4 设备及试剂 以下所用材料，除特别注明者外，均为分析纯；水为符合GB/T 6682规定的二级水。 4.1 设备 微孔板酶标仪 450/630nm 旋转蒸发仪/氮气吹干装置 均质器 涡旋仪 离心机 天平：感量 0.01g 刻度移液管：10ml 洗耳球 容量瓶：500ml 聚苯乙烯离心管：2 ml 、50ml 微量移液器：单道

5、20200l、1001000l 多道 250l 4.2 试剂 乙腈(分析纯) 正己烷(分析纯) 去离子水 5 试剂盒提供的材料与试剂 5.1 96 孔酶标板 1 块（ 氟喹诺酮类） 96孔酶标板 1块（ 磺胺喹噁啉） 5.2 标准品 6 瓶：（2ml/瓶） 0ppb0ppb，0.0.5 5ppbppb，1.51.5ppbppb，4.54.5ppbppb，13.513.5ppbppb，40.540.5ppbppb 5.3 高浓度标准品：（2ml/瓶） 1ppm1ppm 5.4 酶标二抗浓缩液 2ml 5.5 抗体工作液 15ml 5.6 底物液 A 液 15ml Q/JCWI 02142013

6、5 5.7 底物液 B 液 15ml 5.8 终 止 液 15ml 5.9 20浓缩洗涤液 40ml 5.10 4 浓缩复溶液 50ml 6 溶液的配制 配液1: 复溶工作液（用于组织样本复溶） 用去离子水将4 浓缩复溶液按 1：3体积比进行稀释（1份4 浓缩复溶液 +3份去离子水）用于样本的复溶。复溶工作液在4（39.2）环境可保存一个月。 配液2:洗涤工作液 用去离子水将20浓缩洗涤液按1：19体积比进行稀释（1份20 浓缩洗涤液+19份去离子水）用于酶标板的洗涤，洗涤工作液在4（39.2）环境可保存一个月。 7 样本前处理步骤 7.1 处理任何样本时，都必须注意： a) 实验中必须使用一

7、次性吸头，在吸取不同的试剂时要更换吸头。 b) 实验之前须检查各种实验器具是否洁净，必须使用洁净实验器具，以避免污染干扰实验结果。 7.2 样本前处理方法 称取 2.0 0.05g 均质后的组织样本至 50ml 聚苯乙烯离心管中，加入 8ml 乙腈，用振荡器振荡5min，混匀，3000g 室温（20-25/68-77）离心 5min； 移取 2.5ml 上层有机相至 10ml 洁净干燥玻璃试管中，于 50-60（122-140）水浴氮气流下吹干； 加入 1ml 正己烷，用涡旋仪涡动 1min，再加入 1ml 复溶工作液(见配液 1)用涡旋仪涡动 30s，混匀，3000g 室温（20-25/68

8、-77）离心 5min； 除去上层有机相，取下层水相 50l 用于分析。 8 检测步骤 8.1 测定前应须知： 8.1.1 使用之前将模具内所有试剂与酶标板放实验桌回温至室温（20-25/68-77）。 8.1.2 使用之后立即将所有试剂放回 2-8（36-46）。 8.1.3 在 ELISA 分析中的再现性，很大程度上取决于洗板的一致性，正确的洗板操作是 ELISA 测定程序中的要点。 8.1.4 在所有恒温孵育过程中，避免光线照射，用盖板膜封住微孔板。 8.2 操作步骤： Q/JCWI 02142013 6 8.2.1 将所需试剂从冷藏环境中取出，按照上述方法进行回温，注意每种液体试剂使用

9、前均须摇匀。 8.2.2 取出需要数量的微孔板，将不用的微孔板放回铝箔袋重新真空密封，保存于 2-8（36-46）环境中。 8.2.3 浓缩洗涤液和浓缩复溶液在使用前也需按上述方法回温。 8.2.4 编号：编号：将样本和标准品对应微孔按序编号，每个样本和标准品做 2 孔平行，并记录标准孔和样本孔所在的位置。 8.2.5 加标准品加标准品/ /样本：样本：加标准品/样本 50l 到对应的微孔中。 8.2.6 抗体工作液和酶标二抗浓缩液的混合：抗体工作液和酶标二抗浓缩液的混合：将抗体工作液和酶标二抗浓缩液按 10:1 体积比混合并混匀。（注：此混合液不能保存，混合均匀后立刻进行加样）。 8.2.7

10、 加抗体工作液和酶标二抗浓缩液的混合液：加抗体工作液和酶标二抗浓缩液的混合液： 加抗体工作液和酶标二抗浓缩液的混合液 50l/孔，轻轻振荡混匀，用盖板模盖板后置 25（77）避光环境中反应 30min。 8.2.8 洗板：洗板：小心揭开盖板膜，将孔内液体甩干，加入洗涤工作液（见配液 2）250l/孔，充分洗涤4-5 次，每次间隔 10s，泼掉板孔内洗涤液，用吸水纸拍干（拍干后未被清除的气泡可用未使用过的枪（拍干后未被清除的气泡可用未使用过的枪头戳破）头戳破）。 8.2.9 显色：显色：加入底物液 A 液 50l/孔，再加入底物液 B 液 50l/孔，轻轻振荡混匀，用盖板膜盖板后置 25（77）

11、避光环境中反应 15min（见注意事项 8）。 8.2.10 测定：测定： 加入终止液 50l/孔， 轻轻振荡混匀， 设定酶标仪于 450nm 处 （建议用双波长 450/630nm检测，请在 5min 内读完数据），测定每孔 OD 值。( (若无酶标仪，若无酶标仪，则不加终止液用目测法可进行判定则不加终止液用目测法可进行判定) )。 9 结果判定 9.1 氟喹诺酮类药物结果判定 氟喹诺酮类药物结果判定有两种方法，粗略判定可用第1种方法，定量判定用第2种方法。注意样本吸光度值与其所含氟喹诺酮类的含量成负相关。 9.1.1 用样本的平均吸光度值与标准值比较即可得出其浓度范围(ppb)。假设样本

12、1 的吸光度值为0.501， 样本 2 的吸光度值为 0.912， 标准品吸光度值分别是： 0ppb 为 1.792； 0.5ppb 为 1.407； 1.5ppb为 1.159； 4.5ppb 为 0.641； 13.5ppb 为 0.245； 40.5ppb 为 0.111。则样本 1 的浓度范围是4.5ppb-13.5ppb 再再乘以其对应的稀释倍数乘以其对应的稀释倍数即可得出样本中氟喹诺酮类药物残留的浓度范围即可得出样本中氟喹诺酮类药物残留的浓度范围；样本 2 的浓度范围是 1.5ppb-4.5ppb再再乘以其对应的稀释倍数乘以其对应的稀释倍数即可得出样本中氟喹诺酮类药物残留的浓度范围

13、即可得出样本中氟喹诺酮类药物残留的浓度范围。 9.2 磺胺喹噁啉结果判定 磺胺喹噁啉结果判定有两种方法，粗略判定可用第1种方法，定量判定用第2种方法。注意样本吸光度值与其所含磺胺喹噁啉的含量成负相关。 9.2.1 用样本的平均吸光度值与标准值比较即可得出其浓度范围(ppb)。假设样本 1 的吸光度值为0.301， 样本 2 的吸光度值为 0.901， 标准品吸光度值分别是： 0ppb 为 2.069； 0.5ppb 为 1.619； 1.5ppb为 0.980； 4.5ppb 为 0.384； 13.5ppb 为 0.126； 40.5ppb 为 0.035。则样本 1 的浓度范围是Q/JCW

14、I 02142013 7 4.5ppb-13.5ppb 再再乘以其对应的稀释倍数乘以其对应的稀释倍数即可得出样本中即可得出样本中磺胺喹噁啉磺胺喹噁啉残留的浓度范围残留的浓度范围；样本 2 的浓度范围是 1.5ppb-4.5ppb 再再乘以其对应的稀释倍数乘以其对应的稀释倍数即可得出样本中即可得出样本中磺胺喹噁啉磺胺喹噁啉残留的浓度范围残留的浓度范围。 9.2.2 定量分析 1) 百分吸光率的计算， 标准品或样本的百分吸光率等于标准品或样本的平均吸光度值 （双孔）除以第一个标准品（0 标准）的平均吸光度值，再乘以 100%，即 B 百分吸光率（%） 100% B0 B标准品或样本溶液的平均吸光度

15、值 B00ppb标准溶液的平均吸光度值 2) 标准曲线的绘制与计算 以标准品百分吸光率为纵坐标，以氟喹诺酮类药物或磺胺喹噁啉标准品浓度（ppb）的对数为横坐标，绘制标准曲线图。将样本的百分吸光率代入标准曲线中，从标准曲线上读出样本所对应的浓度，乘以其对应的稀释倍数即为样本中乘以其对应的稀释倍数即为样本中氟喹诺酮类药物或氟喹诺酮类药物或磺胺磺胺喹噁啉喹噁啉的的实际浓度实际浓度。 样本稀释倍数样本稀释倍数 组织样本稀释倍数：2 倍 10 检测方法灵敏度、准确度、精密度 10.1 试剂盒灵敏度：0.5ppb 样本最低检测限：样本最低检测限： 组织 1ppb 10.2 准确度： 组织 90%20% 1

16、0.3 精密度： 试剂盒的板内、板间变异系数均小于10% 。 11 注意事项 11.1 室温低于 20（68）或试剂及样本的温度没有回到室温（20-25/68-77）会导致所有标准的 OD 值偏低。 11.2 在洗板过程中如果出现板孔干燥的情况，则会出现标准曲线不成线性，重复性不好的现象。所以洗板拍干后应立即进行下一步操作。 11.3 每加一种试剂前需要将其摇匀。 11.4 反应终止液为高浓度硫酸，避免接触皮肤。 Q/JCWI 02142013 8 11.5 不要使用超出有效期的试剂盒； 也不要使用超出有效期的试剂盒中的任何试剂， 掺杂使用超出有效期的试剂盒会引起灵敏度的降低；不要交换使用不同

17、批号试剂盒中的试剂。 11.6 储存条件 保存试剂盒于2-8（36-46），不要冷冻，将不用的微孔板放回铝箔袋重新密封。标准物质和无色的发色剂对光敏感，因此要避免直接暴露在光线下。 11.7 试剂变质的迹象 发色试剂有任何颜色表明发色剂变质，应当弃之。0标准品的吸光度（450/630nm）值小于0.5 （A450nm0.5 ）时，表示试剂可能变质。 11.8 在加入底物液 A 液和底物液 B 液后， 一般显色 15min 即可。 若颜色较浅， 可延长反应时间到 20min（或更长），但不得超过 30min。反之，则减短反应时间。 11.9 该试剂盒最佳反应温度为 25（77），温度过高或过低将导致检测吸光度值和灵敏度发生变化会直接影响检测结果。 12 贮藏条件及保存期 贮藏条件：保存试剂盒于2-8(36-46)环境中。 保存期：该产品有效期为12个月。 _