银杏内生真菌的分离及其对核盘菌生防活性研究，戴红星.docx

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1、分类号 S4 7 6 . 8 单位代码 10183 研究生学号 200986J006 密 级公开 吉林大学 硕士学位论文 银杏内生真菌的分离及其对核盘菌生防活性研究 Study on isolation of endophytic fungi from Ginkgo biloba and its biocontrol activity against Sclerotinia sclerotiorum 作者姓名：戴红星 专 业：植物保护 研究方向：植物病害生物防治 指导教师：潘洪玉教授 培养单位：植物科学学院 2012 年 12 月 银杏内生真菌的分离及其对核盘菡生防活性研究 Study on

2、isolation of endophytic fungi from Ginkgo biloba and its biocontrol activity against Sclerotinia sclerotiorum 作者姓名：钺红星 专业名称：植物保护 指导教师：潘洪玉 学位类别：农业推广硕士 答辩 fH 期： 2012年 12 月 未经本论文作者的书面授权，依法收存和保管本论文 书面版本、电子版本的任何单位和个人，均不得对本论文 的全部或部分内容进行任何 形式的复制、修改、发行、出 租、改编等有碍作者著作权的商业性使用 （ 但纯学术性使 用不在此限 ） 。否则，应承担侵权的法律责任。 吉

3、林大学硕士学位论文原创性声明 本人郑重声明：所呈交学位论文，是本人在指导教师的指导下， 独立进行研究工作所取得的成果。除文中己经注明引用的内容外， 本论文不包含任何其他个人或集体己经发表或撰写过的作品成果。 对本文的研究做出重要贡献的个人和集体，均己在文中以明确方式 标明。本人完全意识到本声明的法律结果由本人承担。 银杏内生真菌的分离及其对核盘菌生防活性研究 中文摘要 菌核病 (sclerotia )是由核盘菌 （ Sc/51.17 / DH5a)由吉林大学植物科学学院有 害生物防治实验室保存 3.1.2 培养基与试剂 3.1.2 培养基与实验试剂 (1) PDA 培养基（用于真菌分离培养 ）

4、 ： 马铃薯： 200g， 葡萄糖： 20g， 琼脂： 8g， 蒸馏水： 1L。 (2) LB 培养基 （ 用于细菌培养 ） ： peptone： 10g, Yeast： 10g, 氯 化 钠 ： 10g， 灭菌去离子水 ： 950mL， 调节 pH至 7.0,蒸馏水定容至 1L， 配置固体则加 20g 琼脂粉。在 121C 高温下高温灭菌 20min (3) 实验化学试剂 Taq DNA polymerase:上海生工公司； dNTPs:上海生工公司； DNA marker:大连宝生物工程有限公司； SanPrep 胶回收试剂盒：上海生工； 1%多聚赖氨酸浓盐酸乙醇革兰氏碘液甲基红试剂 V-

5、P 试剂异丙醇乙醚香柏油 (4) 试剂浓度 TE Buffer: lmmol/L Tris-HCl， lmmol/1 EDTA (乙二胺四乙酸 ）， pH 8.0; CTAB： 1M Tris-HCl， 5M NaCl， 0.25M EDTA, CTAB 5g， 力口 ddH20 定容 至 250mL; 19 第三章银杏内牛真菌 No.OOll 的鉴定 SDS (十二烷基磺酸钠 ） ： 10%(mg/v); EDTA (乙二胺四乙酸 ） ： O.5mol/L; 酚 /氯仿 /异戊醇： 25: 24: 1 (V/V/V); 氯仿 /异戊醇： 24: 1 (V/V); 70%乙醇： 70mL 无水

6、乙醇，加 ddH20 定容至 lOOmL; RNase 溶液： 10mg/mL; 溶液 I: Tris-HCl 25mmol/L (pH 8.0)，葡萄糖 50 mmol/L， EDTA lOmmol/ L (pH 8.0)； 溶液 II (1 mL) : 10%SDS 100(iL， 0.2mol/L NaOH 20(iL; 溶液 III (100 mL):冰 乙 酸 11.5 mL， 乙 酸 钾 5 mol/L 60 mL， 水 28.5 mL。 (5) 实 验 仪 器 光学显微镜： Nikon 仪器有限公司；超纯水系统：美国 Millipore 公司 Milli-Q Academic A

7、10； 离心机：美国贝克曼库尔特 （ BECKMAN Coulter); 电 热 恒 温 水 浴锅：上海一恒科技有限公司；真空浓缩仪：德国艾本德公司 （ Eipendorf); PCR 仪：美国伯乐 （ Bio-Rad); 3.2 实验方法 对从银杏中分离筛选出的内生真菌进行形态学鉴定和分子生物学分析。形态学 鉴定主要根据宏观的菌落特征，微观的个体形态特征及一些生物学特性进行经典分 类研究，观察菌丝形态、子囊壳，参照中国真菌志确定筛选出内生真菌的分类 学地位。分子生物学鉴定为 ISSrRNA 鉴定。 3.2.1 形态学鉴定 3.2.1.1 培养性状 将 PDA 培养基制成平板，点接法接种 一一

8、 用灭菌的牙签挑取少量菌丝点在平板 的中央位置，倒置， 28C 培养 7d 进行观察，用肉眼观察并拍照。 3.2.1.2 内生真菌显微观察 菌株在 PDA 培养基上培养 7d， 观察子囊果。用牙签挑取肉眼可见的黑色子囊 果，观察黑色子囊果的形态，之后压碎，注意观察子囊壳及子囊孢子的有无。同时 用牙签粘少量菌丝，放在载玻片上， 20 倍光学显微镜下观察菌丝形态。 3.2.2 18S rDNA 分子生物学鉴定 3.2.2.1 基因组 DNA 的提取： (1)取 0.3g 菌丝于离心管中， 12000rpm 离心 l-2min; 20 第三章银杏内牛真菌 No.OOll 的鉴定 (2) 弃上清液，沉

9、淀中加入 60 nL TE 缓冲液，旋涡振荡使其悬浮，再加入 3 0(iL10%SDS， 37C 温水浴 lh; (3) 加入 lOOuLSmol/L N a C l， 充分振荡混匀，再加入 80(iLCTA 麵 aCl 溶液， 65(：水浴 20-3 111111; (4) 加入等体积氯仿 /异戊醇，混匀， 12000rpm 离心 4-5min; (5) 吸上清转入新离心管中。当白色物质较多或者较黏时，可重复步骤 4、 5 一次； (6) 加入 0.6-0.8 倍体积的异戊醇，放入 -20C 冰箱中，过夜沉淀； (7) 取出后， 4C,12000rpm 离心 lOmin; (8) 沉淀用 7

10、0%乙 醇洗涤两次； (9) 将 DNA 放入真空浓缩仪，之后加入 15-25nLddH20， 将 DNA 溶解； -20C 下保存备用。 3.2.2.2 PCR 扩增 PCR 扩增引物：引物采用真菌 18SrDNA 通用引物 PR: 5-GGAAGGGRTGTATTTATTAG-3, PF: 5-CCTCTAAATGACCAAGTTTG-3,； PCR 扩增后片段约为 1500bp。 PCR 扩增反应体系 将上述提取的基因组 DNA 作为 PCR 扩增模板， PCR 扩增反应体系为 25L 反 应体系： lOxPCR Buffer (Mg2+) ： 2.5(iL dNTPs(10mmol/L

11、) ： l.OL PF(100pmol/L) ： 1.0(iL PR(100 pmol/L)： l.OjxL Taq Polymerase ： 0.2jxL 模板 DNA : l.OiL ddH20 ： 18 鄭 L Total ： 25jxL 离心充分混匀，进行 PCR 扩增反应。 PCR 扩增反应条件： 95C 预变性 5min 94C 变性 30s 58C退火 30s 72C 延伸 lmin， 30 循环 21 第三章银杏内生真菌 No.OOll 的鉴定 72C 延伸 lOmin PCR 扩增产物检测 将 PCR 扩增产物，在 1%的琼脂糖凝胶上进行电泳检测， EB 染色，紫外凝胶 成像

12、仪拍照。 3.2.2J PCR 产物回收 利用上海生工凝胶回收试剂盒回收所需目的片段，操作步骤如下： (I) 打开紫外灯，在紫外灯下用干净的手术刀小心切下含有所需的目的片段琼 脂糖凝胶，然后把胶移入 1.5mLEP管中 (注：切胶时要迅速，避免将 DNA 长时间暴 露于紫外灯下，防止 DNA 突变损伤 )。 (2 )称量凝胶质量，按 1: 3 或 1: 6 的比例加入 Buffer B2。 （ 注：若凝胶质 量小于 lOOmg， 则用水补足 lOOmg。） (3) 50C 水浴中 5-lOmin, 每隔 2 min 颠倒混勻一次。 （ 注：凝胶块必须融化 完全，否则影响回收质量，并且胶块溶化时

13、间不能过长，否则可能造成 DNA 损伤。 ） (4) 将上述混合液全部转移到回收柱中，于 9000g/mm 离心 30s。 离心后弃去 收集管内液体。 (5) 取 500iLWashSolution， 加入回收柱中 ， 8000g/min 离心 30s。 弃去收集 管内液体，再将回收柱放回。 (6) 重复上述步骤。 (7) 将空回收柱和收集管离心， 9000g/mm 离心 1mm， 完全去除残留液体。 然后将回收柱置于新无菌的 1.5mLEp 管中。 (9) 在回收柱中央加 20(iL 去离子水，室温静置 2mm。 (10) 9000g/min 离心 1mm， 洗脱 DNA 于 1.5mLEp

14、 管中，此步骤可重复一次 能显著提高目的片段回收产量。 (II) 弃去回收柱，取 5pL 回收片段进行 1%琼脂糖凝胶电泳检测。剩余回收 DNA-20C 保存。 3.2.2.4 连接 PCR 回收产物与 pMD 18-Tvector 进行连接，其连接体系为 : T-Vector ： 0.2jxL 22 第三章银杏内生真菌 No.OOll 的鉴定 回收产物： 4单 Solution I： 5jxL Total ： 10iL 16C 反应过夜， 得到的产物下一步进行热激转化。 3.2.2.5 连接产物的转化 (1) 将 10 nL 感受态细胞置于冰上，完全解冻后轻轻混匀，将上述连接产物 加入到 1

15、00HL 感受态细胞中，无菌条件下，轻轻混合均匀，冰上放置 20mm; (2) 42C 水浴中热击 90s， 冰 浴 3 mm (3) 转化后的菌液加入到 70 nL 不含抗生素的 LB 液体培养基中， 37C 振荡 培养 45-60min。 (4) 振荡培养后，将液体 6000 rpm 离心 lmin， 吸掉 700xL 上清，剩余 100xL 左右的上清液，用枪混匀并吸出，涂布到含有抗生素且终浓度为 5 ng/mL 的 LB 培 养基平板上， 37C 倒置培养 12h。 3.2.2.6 阳性克隆的初筛 当含有外源片段重组质粒成功转入大肠杆菌细胞中后，它可在含 Amp+抗性的 LB培养基上生

16、长。用灭菌的牙签挑取单个菌落于含 Amp+的液体 LB 抗性培养基中， 37C摇床 180r/min 振荡培养。 3.2.2.7PCR 鉴定 以菌夜为模板进行 PCR 扩增，用以检测克隆子。若能扩增出 1500bp 条带，说 明该质粒为阳性克隆，质粒 PCR 扩增反应体系： 质粒 DNA: 1.0(iL 10*PCRBuffer (含 Mg2+) : 2.5(iL dNTP(10mmol/L) ： 0.5(iL PI (lOOpmol/L) ： 1.0(iL P2 (100 pmol/L)： 1.0(iL Taq Polymerase ： 0.5iL ddH20 ： 18.5(iL Total

17、 ： 25iL 充分混匀后，瞬间离心，进行 PCR 扩增， PCR 扩增反应条件如下 : 95C 预 变 性 ：5 min 23 第三章银杏内生真菌 No.OOll 的鉴定 94C 变性： 30s 58C 退火： 30s 72C 延伸： lmin， 30 个循环 72C 延伸： lOmin 3.2.2.8 测序及分析 将已验证正确的阳性克隆子送往华大基因公司测序，并将结果提交于 NCBI 上 进行BLAST 比对。 3.2.2.9 绘制系统进化树 MEGA4.0 软件分析序列并绘制该菌株的系统进化树。 33 结果与分析 3.3.1 No.OOll 菌株形态学的鉴定 通过观察生防菌株菌落培养性状

18、、个体形态和显微观察该菌株的子囊果及其子 囊孢子来鉴定菌株 (图 3-1)。 菌株 No.OOll 在 PDA 基本培养基的形态特征为 :菌落有浅橙色或无色的分泌物， 颜色较浅，；附属丝较多，褐色，具有疣状的突起；子囊果表生，球形、倒卵形或 卵圆形，有孔口， 7 天左右开始成熟，在反射光下呈现橄榄褐色或灰褐色；子囊棍 为棒状，簇生 ，一 般具有 8 个子囊孢子，容易消解；子囊孢子褐色，多为柠檬形， 厚较壁，两侧平滑，两端突起，且有一个明显的顶生萌发孔。 图 3-1 菌株 No.OOll 的照片 A.菌株 No.OOll 子囊果； B.子囊孢子在 40 倍光学显微镜 Fig. 3-1 Pictu

19、res of Strain No.OOll A.Pictures of ascocarp； B. ascospore in 40 times 24 第三章银杏内牛真菌 No. OOll 的鉴定 3.3.2 18S rDNA 对内生真菌 No.OOll 的分子鉴定 3.3.2.1 内生真菌基因组 DNA 的提取 基因组 DNA 提取如图 3-2,由图可知该 DNA 可以满足下步 PCR 扩增所要求的 浓度和纯度。 3.3.2.2 18S rDNA 的 PCR 扩增 引物 ： 18 S-F1 (5 -GGAAGGGRTGT ATTTATTAG -3 ） 18S-Rl (5， - TCCTCTAAA

20、TGACCA AGTTTG-3， ） 基因组 DNA 经过以上引物的 PCR 扩增，并通过琼脂糖凝胶电泳检测，清楚地 看到了大小约为 1500bp 的条带，即为该菌株 18S rDNA 的序列。结果见图 3-3，从 图3-3 的电泳图可知， 18S rDNA 的扩增条非常特异，没有非特异性条带。扩增的 18SrDNA 条带经过切胶，通过试剂盒进行回收后，吸取 I*进行电泳 PCR 检测， 溴化乙淀染色后，凝胶成像仪观察，在 1500bp 左右处出现荧光条带，与预期结果一 致。 3.3.2.3 TA 克隆阳性重组子的筛选 选取克隆后再次测序的方法可以进一步分析 PCR 产物的一致性和可靠性。 将

21、所测序列提交到 NCBI 中， BLAST 比对的结果可以得出，菌株 No.OOll 与球 毛壳菌属的同源性高达 99%。 3J.2.4 No.OOll 的系统发育树状图 用 MEGA4 软件做菌株 No.OOll 的系统发育树状图（图 3-4) 25 第三章银杏内生真菌 No.OOll 的鉴定 图 3-3 菌株 No.OOl 1PCR 扩增产物电泳 Fig. 3-3 Strain No.0011 electrophoresis of PCR 图 3-4 菌株 No.OOll 的系统发育树状图 Fig. 3-4 The phylogenetic tree of strain No.0011 根

22、据形态学鉴定和系统进化树的结果可知，菌株 No.OOll 被鉴定为球毛壳菌 (Cheatomsum globsum ) 3.4 小结与讨论 在本章中通过对菌株 No.OOll 形态学分析和分子生物学鉴定相结合的方法，确 定该内生真菌菌株为球毛壳菌。并且发现球毛壳菌可以产生具有活性的次生代谢产 物，那么在后续实验中，我们将对该菌株对抗核盘菌的次级代谢成分进行提取分离 以及活性研究。 26 第 四 章 球 毛 壳 菌 No.OOll 次生代谢产物的提取分离及活性测定 第四章球毛壳菌 No.0011 次生代谢产物的提取分离及活性测 定 在本验中，不仅发现了菌株 No.0011 具有良 好的抑制核盘菌

23、活性，而且通过分 离鉴定，证明该内生真其属于球毛壳菌属。 在实验中，利用液体发酵法获得大量球毛壳菌菌体及其发酵代谢产物，通过对 峙培养法鉴定球毛壳菌 No.OOll 的发酵代谢产物对核盘菌的抑制效果，同时通过层 析分离不同次级代谢成分，分别测定这些不同代谢产物对核盘菌的抑制效果的强弱。 对球毛壳菌次生代谢产物进行分离、提取和活性测定可以掲示次生代谢产物中活性 物质的结构和性质，为其在化学或生物合成上提供了可行性，对真菌内生真菌代谢 产物抑菌活性的研究也为植物病害的生物防治提供了理论依据。 4.1 实验材料 4.1.1 菌种 从银杏的组织中分离纯化得到银杏内生球毛壳菌株 No.0011。 4.1

24、.2 供试培养基与试剂 (1) 固体培养基 PDA: 200g 土豆， 20g 葡萄糖， 1L 水， 20g 琼脂粉。称取 200g 马铃薯，切成 小块，煮 30min 后用纱布过滤，取清液，加入 20g 葡萄糖和 20g 琼脂粉，定容到 1L， 121C高压灭菌 20min。 (2) 液体发酵培养基 燕麦培养基：燕麦 30g， 麦芽糖 20g， 去离子水 1L， PH6.0-7.0。 称取 30g 燕麦， 煮20mm 后用纱布过滤，取清液，加入 20g 麦芽糖，用蒸馏水定容到 1L， 调 PH 为 6.0-7.0，121C 高压灭菌 20min。 (3) 试剂 甲醇，乙酸乙酯，安替福明，二甲

25、基亚砜，丙酮等均购于金泰化玻公司，琼脂 . 葡萄糖等购于汕头市西陇化工厂 27 第 四 章 球 毛 壳 菌 No.OOll 次牛代谢产物的提取分离及活性测定 4.1.3 主要仪器设备 柱层析硅胶 （ 100-200 目， 200-300 目），旋转蒸发仪，冰箱，电热鼓风干燥箱， 净化工作台，移液枪， 4C 冰箱，水浴锅，薄层层析硅胶，恒温摇床，凝胶成像分析 仪，恒温培养箱， 80C 超低温冰箱，三用紫外线分 析仪，低温冷却循环泵，真空干 燥箱。 4.2 实验方法 4.2.1菌种的活化 将保藏的球毛壳菌菌种 No.0011 在 PDA 平板上活化备用。 4.2.2 液体发酵 在 500mL 的锥

26、形瓶中加入液体发酵培养基 200mL， 待培养基冷却至 40C 后在 超净工作台内挑取球毛壳菌株菌饼，直径为 9mm， 接种于 OAT 发酵培养基中，置 于 28C的摇床上 200 rmin1 震荡培养 5d。 当菌丝体球充满整个发酵液体时停止摇培， 得到培养物 20L， 过滤获得菌丝体和发酵液。 4.2.3 发酵物提取 向过滤得到的发酵液中加入等体积乙酸乙酯，取上层得乙酸乙酯萃取物，在真 空条件下浓缩得到浸膏 15.3g。 球毛壳菌丝体利用 3 次甲醇超声提取，浓缩成浸膏 19.1g。 4.2.4 次级代谢产物的分离 4.2.4.1 硅胶柱层析 硅胶柱层析技术是主要根据物理吸附差别进行分离。

27、 在本次试验中采用的是干法上柱和洗脱。干法上柱和洗脱具有分离效果好的特点， 但也有一定的缺陷，会造成样品的损失量增大，因此对于小含量化合物的分离并不 适用。 4.2.4.2 凝胶柱 （ Sephadex)层析 凝胶柱层析法是利用分子筛分离物质的一种层析方法。其中葡聚糖凝胶是常用 28 第 四 章 球 毛 壳 菌 No.OOll 次牛代谢产物的提取分离及活性测定 的载体，是不可溶于水，但可膨胀成球形的具有三维空间的网状结构的颗粒。 4.2.5 发酵物提取物对核盘菌抑菌活性测定 取分离得到的发酵物提取物 5 nl 点在无菌滤纸片上，吹干发酵液，在 PDA 培 养基中央接种 9mm 直径的核盘菌菌块

28、，供试银杏内生真菌活性菌株的发酵物提取 物滤纸片接在距离菌块 40mm 处，设置将只有 501 DMSO 滤纸片作为阴 性对照， 28C 恒温培养， 2-4d 时观察抑菌效果，抑菌带越大，表示抑菌效果越强。 抑菌率按以下列公式计算： 抑制率 (%) 对照组病原菌生长半径 （ mm) 处理组病原菌生长半径 （ nmi) 对照组病原菌生长半径 （ mm) x 100% 4.2.6 发酵物中不同分离化学组分对核盘菌的活性测定 通过 TLC 检测常规柱层析下来的组分经，合并具有的相同点，然后用 DMSO 溶解各个分离组，浓度稀释为 5mgmL-l， 取 5 nl 于无菌滤纸片上吹干，在室温下 28C

29、下培养箱培养， 3-5d 后然后观察抑菌圈的有无及抑菌带的大小，选取抗核盘菌 抑制活性好的部分进行下一步的分离，达到高效分离纯化有活性的组分目的，以期 达到分离目标化合物。 4.3 结果与分析 4.3.1 球毛壳菌 No.0011 发酵物的提取 将乙酸乙酯部分和甲醇部分浓缩后的浸膏在 TLC 板上展开，两部分（甲醇超声 部分和乙酸乙酯萃取部分）组分差异性不大，应对其合并后进行分离。如图 4-1 所 ZpN 4.3.2 球毛壳菌 No.0011 发酵物的分离 将乙酸乙酯提取物蒸干至溶液挥尽，上硅胶，以二氯甲烷：甲醇 （ 100:1)开始 洗脱，得到组分 Frl， 对其进行薄层层析分析，如图 4-

30、2 所示。 29 第四章球毛壳菌 No.OOll 次生代谢产物的提取分离及活性测定 图 4-1 浓缩浸膏薄层层析分析 注： 1 菌体甲醇超声； 2 菌液乙酸乙酯萃取；（展 开剂：二氯甲烷：甲醇 =15:1) 图 4-2 组分 Frl 薄层层析分析 注：展开剂：二氯甲烷：甲醇 =20:1 紫外 365nm 荧光 根据 TLC 薄层色谱分析，将组分 Frl 流份合并为四部分，并将 2, 3 部分分别 上Sephadex LH-20 分离，并将流份进行 TLC 进行分析如图 4-3、 4-4 所示。 图 4-3 组分 Frl. 2 薄层层析分析 注：展开剂：二氯甲烷：甲醇 =20:1 紫外 365n

31、m 荧光 30 第四章球毛壳菌 No.OOll 次牛代谢产物的提取分离及活性测定 图 4-4 组分 Frl. 3 薄层层析分析 注：展开剂：二氯甲烷：甲醇 =20:1 香草醛显色 4.3.3 发酵物提取物对核盘菌抑菌活性测定 由图 4-5 可知，发酵物提取物对核盘菌有较强的抑制效果。测得其抑菌率为 34.5%。 图 4-5 发酵物提取物对核盘菌的皿内对峙培养 注： A 为发酵物提取物， B 为潮霉素， C 为 DMSO (阴性对照） 4.3.4 不同化学组分的抗核盘菌活性测试 对获得 41 个 化 学 组 分 都 采 用 纸 片 扩 散 法 对 核 盘 菌 （ 又 进 行 活 性 测试。如图

32、4-6 所示。 31 第 四 章 球 毛 壳 菌 No.OOll 次生代谢产物的提取分离及活性测定 编号为 25、 26、 27、 28、 30、 31、 32、 33、 34 等 9 种化合物组分对核盘 菌表 现 出 明 显 的 抑 制 活 性 ， 测 得 其 抑 菌 半 径 （ cm) 分别为： 16， 0.3， 0.2， 0.8， 0.2， 0.4, 0.4， 0.3， 0.8。 4.4 小结与讨论 本章主要对球毛壳菌 No.OOll 进行大量发酵，并对其发酵产物进行提取分离以 及活性鉴定，从发酵产物的提取物中利用活性跟踪分离技术，共分离了 41 个 化学组 分，其中活性部分为 9 个。

33、 内生真菌发酵产生活性物质的产量低使我们在研究过程中发现内生真菌的一个 重要缺点，这也是目前国内内生真菌研究领域存在的最大障碍，本研究利用燕麦麦 芽糖液体培养基进行发酵培养，在发酵液中分离出了大量抗核盘菌的活性组分，这 为后续实验的进行提供了材料，为新型生物农药的开发提供理论依据。 32 第 五 章 结 论 第五章结论 1 从银杏不同组织上共分离出 307 株内生真菌，其中老叶的组织分离率最高为 33.2 %，新叶为 18.4%，树皮为 30.5 %，树根和果实的组织分离率分别为 10.5 %和 14.5 %。对分离得到的 307 株银杏内生真菌对核盘菌皿内对峙培养进行初步筛选， 发现 93

34、株内生真菌菌株对核盘菌有不同的抑制效果，筛选到两株对核盘菌具有拮抗 效果较好的菌株，其中 No.0011 对核盘菌 （ S. scfcror/orwm)的活性最好。 2 利用形态学和对分子生物学对分离得到的银杏内生菌株 No.0011 进行遗传分 析和鉴定，结果表明银杏内生真菌菌株 No.0011 为 球 毛 壳 菌 。 3 利用液体发酵法获得大量银杏内生球毛壳菌菌体和发酵产物，采用乙酸乙酯 和甲醇对发酵物进行萃取，获得了较多的次生代谢的活性组分。这些代谢产物通过 对峙培养测定其抑菌活性，结果表明 No.0011 的发酵物提取物对核盘菌很较强的抑 制活性，我们利用硅胶柱层析 (SCC)、 凝胶

35、柱层析 (GFC)法、反相柱层析 (ODS)分离 得到 41 份不同代谢产物化学组分中，其中有 9 份对核盘菌的抑制效果 较强。 33 参考文献 参考文献 I -卩 臧宪朋植物与核盘菌 (分 jc/e7-(7ft.(777. 77)互作分子牛 /物学的初步研究 D杭州 :浙 江大学 2010:9-10 3 张伟大豆菌核病综合防治技术研究 D哈尔滨 :永北农大 2009: 4 4 赵丹 .许艳丽等大豆菌核病的识別与综合防治 J.大豆通报 .2006(03):1 5 宋淑云 .晋 齐 大 豆 品 种 对 大 豆 菌 核 病 加 ;/7Jc/m/(777077)的抗性分析 J.吉林农业科学， 200

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