荧光原位杂交(FISH)实验步骤(3页).doc

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1、-荧光原位杂交(FISH)实验步骤-第 3 页仪器设备 1、 医用微波炉； 2、 水浴锅； 3、 OLYMPUS BX51荧光显微镜； 4、 OLYMPUS DP11数字显微照相机。FISH试剂 （1）1PBS：由10PBS溶液稀释而成，储存于4； （2）20SSC（pH7.0）； （3）2SSC，由20SSC溶液稀释而成； （4）25mg/ml蛋白酶K消化液。 （5）变性液(70甲酰胺+2SSC，pH7.0)：4ml 20SSC；8ml蒸馏水；28ml甲酰胺。每次新鲜配制。 （6）杂交后洗涤液： 20SSC 4ml；蒸馏水16ml；甲酰胺20ml。每次新鲜配制。调节pH前升至室温。实验步骤

2、1、脱蜡： 1）二甲苯脱蜡3次，每次5min； 2）100酒精两次，每次2min； 3）移出酒精，斜置切片，标记末段向下，空气干燥。 2、蛋白酶处理: 1）每个染色缸40ml蛋白酶K消化溶液，配制方法如下：2SSC 40ml倒人Facal管，在水浴槽中预热。将消化酶液加入管内，摇动直到酶溶解。 2） 37水浴槽中预热染色缸和蛋白酶K溶液。37孵育20min。 3） SSC在室温下漂洗切片3次，每次1min。 4）梯度酒精脱水（-20预冷）。 3、变性： 1）每一个立式染色缸配制40ml变性溶液； 2）78水浴槽中平衡预热混合液染色缸； 3）78孵育8min； 4） 即移入-20预冷70%酒精的

3、染色缸内2min，再依次移入80%、90%和100%的-20预冷酒精内，每缸2min； 5）空气干燥。 4、杂交： 1）准备探针； 2）取一个较大的湿盒，交叉放置切片； 3）滴10l探针在切片的组织上，加盖玻片； 4）盖上湿盒盖，37孵育12h16h。 杂交后的水洗： 5）镊子小心去除盖玻片； 6）43预热杂交后水洗溶液40ml水洗切片15min； 7）2SSC(37)洗两次，每次10min； 8）切片放人染色缸的1PBS内待检测，勿使切片干燥。 检测： 9）从1PBS中取出切片，除去过多的水分，避免标本干燥。把切片放入湿盒内，同时处理4张切片。 10）每张切片使用30l60l罗丹明抗-地高辛

4、抗体或FITC卵白素，室温下孵育20min； 11）去掉塑料盖膜，把切片放入含1PBS的染色缸。1PBS室温下洗3次，每次2min。扩增： 12）从1PBS中取出切片，斜置切片使液体排出； 13）每张切片滴30l60l抗-卵白素抗体，加塑料盖膜，室温孵育20min； 14）去掉塑料盖膜，把切片放人含1PBS的染色缸。1PBS室温下洗3次，每次2min； 15）从1PBS中取出切片，斜置切片使液体排出； 16）每张切片滴30l60l抗-卵白素抗体，加塑料盖膜，室温孵育20min； 17）1PBS室温下洗3次，每次2min。 5、细胞核染色： 1）张切片加10l20l DAPI，覆盖盖玻片并在室温

5、下孵育25ml； 2）尽可能快的在荧光显微镜下观察或封闭盒内保存在-20冰箱。切片在染色之后1h内可以在显微镜下观察。PRINS步骤 1、常规脱蜡浸入0.01mol/LPBS； 2、用0.2mol/L盐酸处理5min； 3、蛋白酶K(25g/m1)消化37 15min； 4、分别用80，95和100酒精脱水，室温干片； 5、加PCR混合液25L(10mmol/L Tris-HCl，50mmol/L KCl，1.5mmol/L MgCl2，各加200mol/L dATP，dCTP，dGTP，1.5mmol/L dig-11-dUTP l.5l，引物250ng，Taq DNA聚合酶2U)，加盖片； 6、94变性5min后置入65湿盒中5min； 7、用0.1SSC液，65洗5min； 8、片于65 10s20s；用4SSC-0.1吐温20液42洗5min，2次； 9、经Buffer I液洗后滴加20羊血清封闭30min； 10、加地高辛抗体复合物(1:500)室温下2h； 11、Buffer液洗5min； 12、用BCIP-NBT显色1h2h，在镜下控制，终止显色； 13、用中性红或核固红衬染，酒精脱水，二甲苯透明，树脂封片。