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1、任务二:PCR扩增目的基因,一、实验目的,1、掌握PCR扩增DNA的技术与原理 2、学习PCR扩增仪的使用,二、实验原理,聚合酶链式反应是一种体外DNA扩增技术,具有灵敏度高、特异性强、操作简便和应用广泛等特点。 PCR工作原理类似于DNA的体内复制过程,是将待扩增的DNA片段和与其两侧的已知序列合成两个与模板DNA互补的寡核苷酸作为引物,引物序列将决定扩增序列片段的特异性和片段长度。,标准的PCR过程分为三步: 1.模板变性(92-96):双链DNA模板在热作用下,氢键断裂,形成单链DNA 2.低温退火(37-65):系统温度降低,引物与DNA模板结合,形成局部双链。 3.延伸(72):在T
2、aq酶(在72左右最佳的活性)的作用下,以dNTP为原料,从引物的5端3 端延伸,合成与模板互补的DNA链。,三、实验仪器,PCR扩增仪 台式高速离心机 移液器 高压灭菌后的Eppendorf管(0.5mL ) 电泳仪,四、材料与试剂,1、模板DNA(0.1g/L):用牙签挑取单 菌落悬浮到50L的裂解液中(1%TritonX- 100,20mmol/LTris-HCLpH8.2,2mmol/L EDTA),95温浴10min,10000r/min 离心5min,取2L上清液用于总体积50L的PCR反应。,2、TaqDNA聚合酶(5U/L),10扩增 缓冲液,dNTP(1mmol/L):购买。
3、 3、引物(100pmol/L):设计并合成与目的DNA两侧互补的引物。,五、实验操作,1.准备PCR反应溶液,(1)按序将如下成分混合置于Eppendorf管内 a.10扩增缓冲液 10L b.4dNTPs 8L c.引物11L d.引物2L e.模板DNA 1L(10ng) f.TaqDNA聚合酶L (2.5U) 加水至终100L,(2)手指轻弹Eppendorf管底部 离心2s,(3)加石蜡油50L封住溶液表面,2.PCR扩增反应,加好样的Eppendorf管置于PCR扩增仪内 变性:95 5min 951min 退火:55 45s 延伸:72 1min 重复循环30次 循环结束后72 延伸8min 反应完毕,取样置-4 待用,3.结果观察,取样进行琼脂糖凝胶电泳 溴化乙锭(EB)染色 观察DNA条带,高度灵敏的荧光染色剂 染色效果好 操作方便 稳定性差 强致癌剂 中度毒性,六、注意事项,1、PCR结果若出现非特异性的扩增条带,有 必要进一步优化反应条件,包括改变退火 温度和时间,调整Mg2+浓度等。 2、PCR反应特异性强,引物浓度、TaqDNA聚合酶和dNTP的量不宜过多。 3、引物设计要合理。,Thank you !,再 见!,