医学分子生物学复习思考题及答案.doc

《医学分子生物学复习思考题及答案.doc》由会员分享，可在线阅读，更多相关《医学分子生物学复习思考题及答案.doc（20页珍藏版）》请在得力文库 - 分享文档赚钱的网站上搜索。

1、医学分子生物学复习思考题及答案第十三章 真核基因及基因组1、 什么是基因组？答：基因组（genome）是指一个生物体内所有遗传信息总和。人类基因组包含了细胞核染色体DNA（常染色体和性染色体）及线粒体DNA所携带所有遗传信息。不同生物基因及基因组大小及复杂程度各不相同，所贮存信息量和质存在着巨大差异。2、 真核基因基本结构包括哪些？试述之。答：真核基因基本结构包括编码序列及非编码序列 编码序列（coding seguence）：包括编码蛋白质及功能RNA（mRNA、rRNA、tRNA、特定小分子RNA）核苷酸序列。真核基因编码序列由外显子及内含子组成，外显子及内含子相间排列，称断裂基因。内含子

2、数目较外显子数少一个，组蛋白编码基因例外，不含有内含子。外显子决定表达蛋白多肽及RNA一级结构。因此，外显子序列结构通常比较保守，一个碱基突变常致基因功能改变，而内含子序列相对变异较大。每个内含子5末端和外显子相接处，常为GT，3末端和外显子相接处常为AG，这一共有序列是mRNA剪接加工时剪接识别信号。非编码序列（non-coding sequence）：包括编码序列两侧（上游及下游）对基因表达具有调控作用一些调控序列：如启动子、增强子等外显子（exon）；在基因序列中，出现在成熟mRNA分子上序列。内含子（intron）：外显子之间、和mRNA剪接过程中被删除部分相对应间隔序列。3、 什么事

3、顺式作用元件？其化学本质是什么？顺式作用元件主要有哪些？答：非编码序列对基因表达起调控作用，又称调控序列。位于结构基因（编码序列）上游及下游，称它们为顺式作用元件（cis-acting element），包括启动子、增强子、沉默子、上游调控元件、加尾信号等。4、 真核基因启动子功用是什么？其位置如何？答：DNA分子上能介导RNApol和DNA结合并形成转录起始复合物序列，称之为启动子。大多数真核基因启动子都位于结构基因上游，启动子本身不被转录。但也有一些真核基因启动子DNA序列位于转录起始点下游，它们可以被转录，如编码tRNA基因启动子。5、 试述真核基因三类启动子？答：（1）类启动子：具有类

4、启动子基因主要编码rRNA，它能被 RNApol识别结合，转录产物是rRNA，类启动子结构特征是富含GC。（2）类启动子：具有类启动子基因主要编码mRNA（蛋白质）及一些小分子RNA。它能被 RNApol 识别结合，转录产物是mRNA及小分子RNA。类启动子结构特征是具有TATA盒。有类启动子在TATA盒上游还存在CAAT盒及GC盒（274） （3）类启动子：含有类启动子基因主要编码tRNA。此外，也编码5SrRNA，它能被 RNApol识别结合，转录产物主要是tRNA。其结构特征是含有A盒、B盒及C盒。 A盒：TGGCNNAGTGG B盒：GGTTCGNAACC6、试述增强子特点？答：（1）

5、效率：增强子是增强真核基因启动子工作效率顺式作用元件，是真核基因表达中最重要调控序列，它决定着基因表达水平。（2）位置：增强子既可在启动子上游（多数），也可在启动子下游，有增强子还可位于内含子中,因此，增强子作用不受序列方向影响。（3）距离：增强子和所调控基因之间距离可近可远，近几十个碱基，远可达数千个碱基。因此，它能进行远距离调控。（4）无基因特异性：一种增强子能对任何真核基因发挥作用，甚至病毒增强子在真核基因中同样能发挥作用。如病毒SV40增强子插入到真核-珠蛋白基因附近时，能使其转录效率增强200倍。7、什么是沉默子？答：沉默子是能抑制基因转录特定DNA序列，当其和相应反式作用因子结合时

6、，对基因转录起阻遏作用，使基因沉默。沉默子是负调控。8、真核基因组结构特点有哪些？答：（1）、真核基因组中编码序列所占比例远小于非编码序列：人基因组中编码序列仅占全基因组1%，一个基因全部序列中，编码序列只占5%。（2）、高等真核基因组含有大量重复序列：可占到全基因组80%以上，人基因组中重复序列可达50%以上。（3）、真核基因组中存在着多基因家族及假基因：人染色体基因组编码约2万2.5万个基因，其中存在着1.5万个基因家族。基因家族中有假基因（一个基因家族中，不具备正常功能家族成员称假基因。后述）。（4）、人基因组中大约60%能进行可变剪接，其中80%可变剪接会使蛋白质氨基酸序列发生改变，产

7、生功能相关不同蛋白质。（5）、真核基因组DNA和蛋白质结合形成染色体储存于细胞核内。9、什么是高度重复序列？按结构特点不同主要分为哪两种?试述之？答：重复频率可达106 以上，人基因组中约占20%，高度重复序列按结构特点不同主要分为二种：反向重复序列及卫星DNA 1、反向重复序列（Inverted repeat sequence） 反向序列：两段具有相同碱基顺序，彼此间存在碱基互补，在同一条DNA链上反向排列。也称回文结构。这两段反向互补序列组成一个重复单位，其长度约300bp。这种重复单位多数是散在分布于基因组中，其总长度约占人基因组 5% 。2、卫星DNA（satellite DNA） 重

8、复单位长度一般为210bp，呈串联状排列,也称短串联重复序列（STR）在人基因组中约占 5%6% 。 高度重复序列功用： 参和复制水平调节 参和基因表达调控 参和染色体配对调控10、什么是中度重复序列？根据重复片段长度不同又分为哪两种类？试述之。什么是Alu家族？什么是Kpnl家族？答：重复频率在数十次至数万次，重复片段大多数呈散在分布，和单拷贝基因间隔排列，少数呈串联状排列在某一区域。约占总基因组1%30%。 根据重复片段长短又可分为两种类型。 1， 短分散重复片段（序列）：重复频率可达数万次，重复片段平均长度约300500bp，和平均长度为1000bp单拷贝序列间隔排列。如Alu家族等。2

9、，长分散重复片段：重复片段平均长度约3500bp5000bp，和平均长度为13Kbp单拷贝序列间隔排列。1，Alu家族：重复频率可达3050万次，Alu家族成员长度约300bp，和6kbp序列间隔排列。约占人基因组3%6%。由于300bp片段中，有限制性内切酶Alu酶切位点 AG CT，酶切后得到130bp及170bp。故称Alu家族。Alu家族是人基因组中含量最丰富一种短分散中度重复序列。 2，kpn家族：仅次于Alu家族，重复频率约30004800，重复片段长度约6.4Kbp，其中，含有限制性内切酶 kpn三个酶切位点，酶切后得到1.2Kbp, 1.5Kbp, 1.8Kbp和 1.9Kbp

10、 四个片段，故名 kpn家族.11、什么是单拷贝序列？答：单拷贝序列在单倍体基因组中只出现一次或几次，大多数蛋白质编码基因属于这一类,在基因组中单拷贝序列两侧常常是散在分布重复序列。单拷贝序列改变常常导致表达蛋白质结构和功能异常，临床多种疾病发生都和这种改变有关。12、什么是多基因家族？什么是假基因？答、多基因家族（multigene family）：多基因家族是真核基因组结构另一特征，它是指某一祖先基因经过重复和变异所产生一组结构相似、功能相关基因。多基因家族中，不能表达蛋白质或功能RNA那个基因，称之为假基因。假基因往往缺少内含子。假基因产生可能是由原来有功能基因发生缺失、倒位或点突变，在

11、转录得mRNA后，经剪接修饰得mRNA，再经逆转录得到cDNA（无内含子），然后整合到染色体DNA中所致。13、线粒体DNA共编码几个基因？分别编码哪些物质？答：mtDNA 独立编码线粒体中一些蛋白质，mtDNA全长16569bp，共编码37个基因，其中13个编码 mRNA(mt-mRNA)。翻译出和呼吸链相关一些酶及蛋白质。22个编码mt-tRNA，2个编码mt-rRNA。第十八章 基因表达调控1、什么是基因表达？答、基因表达（gene expression）就是基因转录得相应RNA（mRNA），再翻译成多肽链并加工成具有特殊生物学活性蛋白质。有基因转录得功能RNA（rRNA、tRNA等）不

12、产生蛋白质这一过程，也属于基因表达。基因表达就是基因携带遗传信息表现为表型过程。2、基因表达基本特点（基本规律）有哪些？答：（一）基因表达具有时间特异性及空间特异性（二）基因表达方式多样性（三）基因表达受顺式作用元件及反式作用因子共同调节（四）基因表达调控呈现多层次和复杂性（五）基因表达调控是生物体生长和发育基础3、什么是基因表达时间特异性、空间特异性？答：1. 基因表达具有时间特异性(Temporal specificity):某一特定基因表达，是严格按照一定时间顺序发生。从一个受精卵发育成一个成熟个体，在各个发育不同阶段，各个基因都严格按照特定时间顺序开放表达或封闭，生物体表现为分化、发育

13、相应时间性。因此，基因表达时间特异性又称阶段特异性。又如甲胎蛋白（AFP），胎儿时，肝细胞活跃表达，成人后表达极低。患肝癌时这一基因又被激活表达。2. 基因表达空间特异性（Spatial specificity）:同一机体不同组织细胞中都含有相同各种基因，但同一种基因在不同组织细胞表达情况不一样。如编码胰岛素基因只在胰岛细胞 中表达，和思维相关一些基因只在脑细胞中表达，和物质代谢相关一些基因主要在肝细胞中表达等。因此，基因表达空间特异性，也称基因表达组织特异性或细胞特异性。不同组织细胞表达差异，称差异性基因表达。机体内决定不同类型细胞，不是基因本身，而是基因表达模式不一样。4、 什么是管家基因

14、？什么是基本基因表达？答：（1）管家基因（house-keeping gene）：这类基因在一个生物体所有细胞中都持续表达，变化较小，不易受内外环境影响，其表达产物对生物体全部生命过程都是必需，必不可少，称这类基因为管家基因。(2) 基本基因表达（组成性基因表达）：管家基因表达称基本基因表达，它只受启动子及启动子和RNA聚合酶相互作用影响，而不受其他调节机制影响。如TAC中一些酶编码基因及其表达。5、什么是诱导表达？阻遏诱导？答：(1) 诱导表达：某些基因，在特定环境信号刺激下被激活，基因表达产物增加，这类基因称可诱导基因。可诱导基因表达过程称为诱导表达。如DNA损时，DNA修复酶基因被诱导激

15、活。 (2) 阻遏表达：某些基因，在特定环境信号刺激下，其活性被抑制，基因表达产物减少，这类基因称为可阻遏基因。可阻遏基因表达过程称为阻遏表达。如在细菌培养基中加入色氨酸时，细菌体内和色氨酸合成有关酶编码基因就会被抑制。6、什么是反式作用因子？基因表达调控分子基础是什么？答：反式作用因子（trans-acting facter）:是一些蛋白质因子，它对结构基因表达起调控作用。编码反式作用因子基因位于远离结构基因同一条DNA链上，也可在另一条DNA链上。蛋白质-DNA以及蛋白质-蛋白质相互作用是基因表达调控分子基础。7、基因表达调控呈现在哪些层次？其中，最重要调控位点是什么？答、基因表达体现在基

16、因、转录及翻译，在这些层次上均存在基因表达调控机制，因此，调控表现为多层次和复杂性。 1. 基因调控（量和结构调控） (1) 基因拷贝数多，表达产物量也多。某种特定细胞能选择性扩增某个基因，于是，该基因相应蛋白质呈现高表达。 (2) 基因DNA甲基化,DNA重排等均可在基因信息水平上影响基因表达，以适应机能需要。2. 转录调控 (1) 转录过程多环节调节 (2) 真核生物转录得mRNA要进行加工修饰，如mRNA选择性剪接， mRNA编辑等，是基因表达调控重要位点。 (3) 成熟 mRNA从细胞核进入细胞液调控。 (4) 非编码RNA（如miRNA 即 微小RNA，micro-RNA ）在转录水

17、平上对基因表达调控。3. 翻译调控 (1) 蛋白质合成过程调控：翻译起始，肽链合成延长是常见调控位点。 (2) 翻译后加工修饰调节：调节改变蛋白质结构（如水解肽段、磷酸化、羟基化等），从而调节蛋白质功能。 上述多层次复杂调控中，转录水平，尤其是转录起始水平调节是基因表达最重要调控点。8、原核基因结构特点有哪些？答：1. 基因组中很少有重复序列。 2. 结构基因连续排列，多为单拷贝基因，但编码 rRNA基因仍然是多拷贝基因。 3. 结构基因在基因组中所占比列较大，约50%，远远大于真核基因组。 4. 原核基因组中结构基因，多数是以操纵子为单位排列。操纵子是原核基因转录调控基本单位 5. 原核基因

18、可边转录边翻译。能在同一空间内完成，时间上差异不大。9、原核基因转录调控基本单位是什么？操纵子结构有哪些？分别简述之。答：操纵子（operon）是原核基因转录调控基本单位操纵子结构包括：结构基因和调控序列 1. 结构基因：由几种功能相关蛋白质结构基因串联排列而成，常称之为编码区。这些结构基因共同使用一个启动子及一个转录终止信号。 2. 调控序列：包括启动子、操纵元件及调节基因（稍远离结构基因）10、调节基因表达哪些蛋白质？这些蛋白质各有何作用？答：调节基因（I）：位于结构基因上游稍远处，它编码三类蛋白质：特异因子、阻遏蛋白、激活蛋白 特异因子：它决定RNA聚合酶对一个或一套启动序列识别能力。

19、阻遏蛋白：能特异识别结合操纵元件（序列），抑制转录过程（负性调节） 激活蛋白：能和启动子上游邻近DNA序列结合，从而提高RNA聚合酶和启动子结合能力。增强转录活性。这种效应称之为正性调控（positive regulation）。如分解代谢物基因激活蛋白（CAP， Catabolite gene activator protein）就是典型激活蛋白11、乳糖操纵子结构包括哪些？分别试述之。答：乳糖操纵子（Lac operen）包括结构基因及调控序列 1. 结构基因：乳糖操纵子结构基因含有编码和乳糖代谢有关三种酶结构基因，即：Z基因、Y基因及A基因。 Z基因：编码酶是-半乳糖苷酶 Y基因：编码酶

20、是通透酶 A基因：编码酶是乙酰基转移酶2. 调控序列：包括 (1) 启动子（P） (2) 操纵序列（元件）（O） (3) 调节基因（I）：I 基因表达产物阻遏蛋白和O序列结合，于是，RNA聚合酶不能滑向结构基因，操纵子不能转录而处于关闭状态。 (4) CAP结合位点：位于启动子上游，CAP结合该部位后，能增强转录过程。12、细胞周围环境中有乳糖时及无乳糖时，乳糖操纵子表达是如何调节？答：1. 细胞周围环境中不存在乳糖时：I 基因表达产物阻遏蛋白和O序列结合，阻碍RNA聚合酶和启动子结合及滑动，于是，转录终止，和乳糖代谢有关三种酶基因不表达。 2. 周围环境有乳糖时：乳糖代谢产物半乳糖，能和阻遏

21、蛋白结合，于是阻遏蛋白分子构象改变，随之和O序列分离，结果，RNA聚合酶能和P序列结合，并滑向结构基因，转录开放，表达出和乳糖代谢有关三种酶，对乳糖进行利用代谢。13、真核基因有哪些特点？答：（一）真核基因组远大于原核基因组 （二）真核哺乳类基因组中，编码蛋白质及功能RNA（rRNA、tRNA等）序列只占总基因组10%，其余90%基因结构序列中，包含有大量重复序列，功能至今还不十分清楚。 （三）真核生物编码蛋白质基因是不连续，由一些内含子间隔，故称为断裂基因（四）真核生物一个结构基因只转录生成一条mRNA（单顺反子），它包含一种蛋白质编码信息。即使蛋白质四级结构中不同亚基，都是由不同基因表达。

22、（原核结构基因转录生成一条mRNA ，称多顺反子，它包含了几种功能相关蛋白质编码信息） （五）真核基因在细胞核内和多种蛋白质结合构成染色质，染色质结构状况也直接影响着基因表达。 （六）真核生物基因信息不仅存在核DNA上，还存在线粒体DNA（mtDNA）上。14、染色质如何参和基因表达调控？答：（一）染色质结构致密，不易转录，染色质结构松弛，容易转录。在缺乏核小体结构“裸露”DNA链，特别容易转录，称之为转录超敏位点（hypersensitire site） （二）组蛋白修饰调节 1. 乙酰化修饰：组蛋白（主要是H3、H4）乙酰化修饰，使染色质由紧密变得松弛，有利于转录。2. 甲基化修饰：组蛋白

23、（主要是H3、H4）甲基化，使组蛋白和DNA亲和力增加，染色质变得紧密，不易转录。反之，去甲基化，则有利于转录 3. 磷酸化修饰：组蛋白磷酸化修饰能激活基因转录过程。15、什么是反式作用蛋白调控？答：反式作用蛋白特异地结合在相应顺式作用元件，通过DNA-蛋白质相互作用调节基因表达强弱，称反式调节作用，包括反式激活作用及反式抑制作用。编码反式作用蛋白基因位于远离被调控基因同一条DNA链上或位于另一条DNA链上。反式作用蛋白调控是真核基因表达调控最基本最主要方式。16、什么是顺式作用蛋白调控？答：基因表达某些蛋白产物，能特异识别结合这个基因自身顺式作用元件（调控序列），从而调节该基因表达，称之为顺

24、式调节作用。这个具调节作用蛋白质称为顺式作用蛋白17、什么是通用转录因子？什么是特异转录因子？答：通用转录因子（general transcription factor）:这类蛋白质因子帮助RNApol和启动子结合，并起始转录过程，它们作用对所有基因转录都是必需。它们存在没有组织特异性，因此，对基因表达时间特异性及空间特异性并不重要。如TF D、TF H等。特异转录因子（special transcriprion factor）：这类转录因子是个别基因转录所必需，它决定该基因表达时间特异性及空间特异性。这类转录因子有起转录激活作用，有起转录抑制作用，分别称为转录激活因子及转录抑制因子。转录激活

25、因子常常是一些增强子结合蛋白。转录抑制因子多数是沉默子结合蛋白。18、转录因子DNA结合结构域有哪些？简述之。答：(1) 锌指模体结构(p372)：是一种蛋白质空间结构，外形似手指。它含有23个AA残基，形成一个-螺旋及两个反向平行折叠。 -螺旋上有二个组氨酸残基。每个-折叠上各有一个半胱氨酸残基。这四个氨基酸残基这四个AA残基通过配位键和锌离子相连，就形成了外形似指 结构。它插入DNA双螺旋大沟，从而实现转录因子和DNA结合 (2) 碱性螺旋-环-螺旋模体结构（bHLH ）：它至少含有二个-螺旋及一小段短肽形成环所组成，其中一个-螺旋富含碱性氨基酸而显碱性，容易和带负电DNA结合。(3) 碱

26、性亮氨酸拉链（bZIP）模体结构：在其肽链C-末端AA序列中，每隔六个AA残基出现一个亮氨酸残基（疏水性），这段肽形成-螺旋时，亮氨酸有规律出现在-螺旋一侧。二个这种结构通过亮氨酸之间疏水作用结合成二聚体，外形如同拉链。这个二聚体N-末端富含碱性氨基酸，而显正电，容易和带负电DNA结合。19、mRNA稳定性受哪些因素影响？答：1. mRNA 5端帽结构对mRNA稳定性影响 mRNA 5端帽结构能增加mRNA稳定性，促进转录，其原因是： (1) 帽结构可对抗细胞内 5-核酸外切酶 对mRNA 降解作用 (2) 帽结构和帽结合蛋白结合，提高翻译效率 (3)帽结构促进mRNA从细胞核进入细胞质，便于

27、起模板作用2. mRNA 3端 polyA尾对mRNA 稳定性影响： 尾结构增加mRNA 稳定性，促进转录，其原因是：(1) polyA尾结构能防止3-核酸外切酶对mRNA降解 (2) polyA尾结构参和翻译起始过程 (3) 促进mRNA从细胞核转入细胞质 (4) mRNA 3 端常形成发夹式结构，能防止核酸酶攻击（水解） (5) mRNA 3端若是富含AU序列（ARE，AU rich sequence), 能促进使核酸酶切除 polyA, 使mRNA降解，因此，3 端含有ARE 区mRNA通常都不稳定。20、非编码小分子RNA主要有哪些？它们作用是什么？答：有siRNA (干扰小RNA ，

28、small interfering RNA)、mi RNA (微小RNA，micro RNA)、核酶、snRNA (细胞核小分子 RNA)等；它们都能抑制 mRNA，产生转录后基因沉默。21、eIF2磷酸化对翻译有何影响？举例说明之。eIF4E磷酸化对翻译有何影响？答：1. eIF-2磷酸化可抑制翻译起始，抑制翻译起始复合物形成。如干扰素作用机理是 dsRNA可激活蛋白激酶，进而促使eIF-2磷酸化，从而抑制蛋白质合成起始；又如血红素能促进珠蛋白合成是由于它能抑制蛋白质激活酶活性，使eIF-2 磷酸化水平降低。2. eIF-4E 及 eIF-4E结合蛋白 磷酸化能激活翻译起始，促进翻译起始复合

29、物形成，增强翻译过程。如生长因子能增加eIF-4E磷酸化，于是翻译加快，促进细胞生长22、举例说明RNA结合蛋白对翻译过程调节？答：RNA结合蛋白（RBP，RNA birding protein）能和 RNA 特异序列结合，从而参和调节翻译过程。如铁反应元件结合蛋白（IRE-BP）（IRE: Iron response element,铁反应元件）和mRNA结合后，能促进ALA合成酶合成等。23、miRNA对基因表达有何影响？miRNA特点有哪些？答：miRNA（micro-RNA，微小RNA）属于小分子非编码 RNA，长度约20个碱基，它和一些蛋白质共同组成 RNA诱导沉默复合体 RISC（

30、RNA-induced silencing complex）,它能和mRNA结合，从而抑制 mRNA翻译功能。miRNA特点： (1) 长度为20-25个碱基。 (2) 在不同生物中普遍存在，昆虫、家鼠、人类乃至植物中均含有。 (3) 同一种类生物体内，其序列结构具有一定保守性，但动植物之间其序列结构不存在一致性。 (4) miRNA 表达具有明显时间特异性及空间特异性。 (5) miRNA基因以单拷贝、多拷贝或基因簇形式存在于非编码区，它具有高度多样性。24、siRNA 对基因表达有何影响？什么是RNAi？答：siRNA：干扰小RNA是由细胞内一类双链RNA（dsRNA, double-st

31、randed RNA），在特定条件下，由相应酶酶切作用，产生了特殊序列小片段dsRNA，长度约21-23碱基，称之为siRNA。这种双链 siRNA参和组成RISC，并能和特异靶 mRNA互扑结合，导致mRNA降解，阻断翻译过程。这种由 siRNA介导抑制基因表达作用，称之为RNA干扰（RNAi，RNA inlerference）， 它被广泛用于基因功能研究及基因治疗。第二十章 常用分子生物学技术原理及应用1、 什么是核酸分子杂交？答：核酸分子杂交：根据核酸单链片段之间碱基互补而相结合原理，用一已知碱基顺序DNA或RNA单链片段作为探针来检测未知待测DNA或RNA中核苷酸顺序。若对探针进行标记

32、，根据有无标记信号而确定有无杂交体存在。又根据探针碱基顺序，按碱基配对规则就可以测定待测DNA或RNA碱基顺序。2、 什么是核酸探针？核酸探针来源有哪些？探针标记方法有哪些？答：（1）核酸探针:核酸探针是一已知碱基顺序DNA或 RNA单链片段，它能和待测 DNA或RNA 按碱基配对规则进行杂交反应。为了便于观察是否发生杂交反应以及杂交反应位置及强弱，必须对探针进行标记，从而确定待测核酸（基因）是否存在，进而确定待测核酸碱基顺序。(2) 核酸探针来源 人工合成：用核酸合成仪按预定目标合成一已知碱基顺序寡核苷酸片段，常用是DNA片段。 从基因组获得：用 PCR法扩增基因组中某个基因片段。 cDNA

33、探针：从真核细胞液中提取mRNA，经逆转录得到CDNA, 用cDNA全长或其部分片段作为探针。 RNA探针：由于RNA不太稳定，常较少用。(3) 探针标记 放射性核素标记：用放射性同位素标记探针，检测标记信号，采用放射性自显影法。 荧光染料标记：用荧光染料物质（如溴乙锭等）标记探针，检测标记信号：能直接看到荧光 或采用特殊仪器收集荧光信号信息（如基因芯片用激光共聚集扫描收集荧光信号）。 生物素标记探针：用生物素标记探针。检测标记信号：生物素分子上连接有特定酶，加入相应底物后，通过特定酶催化反应过程，产生具有一定有色物质。3、 什么是Southern印迹？有何应用？简述Southern blot

34、ting 基本过程原理？答：DNA印迹（DNA blotting）也称southern blotting,是 E.Southern 最先发明使用于检测DNA，顾称之。其具体过程原理是： (1) 将待测DNA用限制性核酸内切酶酶切水解得到大小不同DNA片段。(2) 将这些片段进行琼脂糖凝胶电泳，大小不同DNA片段停留在凝胶板上不同位置形成不同区带。 (3) 将含不同DNA片段凝胶板放到DNA变性溶液（如0.5mol/L NaOH等）中进行变性处理，使双DNA成为单链DNA (4) 将凝胶板上变性DNA转移到硝酸纤维膜（NC膜 ，Nitrocellulose）上：用多量吸水纸吸附毛细管作用，使凝胶

35、板上DNA转移至NC膜上，由于NC膜具有很强吸附DNA作用，一旦胶板上DNA转移到NC膜上时，就能牢固吸附在膜上，并保持原来位置不发生变化。(5) 将转移后NC膜经80真空加热或紫外交联仪处理，DNA就能非常牢固固定在NC膜上，便于进行杂交。 (6) 杂交反应：将标记探针和NC膜进行杂交，68杂交12小时。 (7)杂交信息监测：放射自显影或荧光信号监测确定有无杂交体、杂交体位置及强弱。应用：根据探针碱基顺序确定目基因碱基顺序，对相关基因进行定性分析，还能进行定量析，以及对重组质粒进行分析等。4、 什么是Northern印迹？有何应用？Northern印迹和Southern印迹有何异同？答：RN

36、A印迹（RNA blotting）也称Northern Blotting，其基本过程及原理和Southern blotting 相同，只是监测对象由 DNA换成 RNA。由于被检测RNA分子较小，常无需限制性内切酶来酶切。电泳RNA转移至NC膜上以及杂交信息检测，都和Southern blotting 相同。由于RNA极不稳定，易受RNA酶降解，因此实验过程中要加入RNA酶 抑制剂DEPC(焦磷酸二乙酯，diethlpyrocarbonate)应用:主要用于RNA定量分析 (1) 检测组织细胞中某一已知特异 mRNA表达水平 (2) 比较不同组织细胞中同一基因（ mRNA ）表达情况5、 什么

37、是Western印迹？有何应用？Western印迹基本过程原理是什么？答：蛋白质印迹常称为Western blotting（和Southern blotting, Northern blotting 相对应）。由于检测蛋白质不是用探针，而是用该蛋白质特异相应抗体。因此，也称免疫印迹（immoublotting）。1. 实验原理： （1）将混合组分蛋白质通过聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）将各组分逐一分开停留在凝胶不同区带 （2）通过转移电泳方法（和DNA，RNA转移方法不同）将凝胶板上各组分蛋白质转移至NC膜上。（3）用被检蛋白质相应特异性抗体（称第一抗体）和NC膜上各组分蛋白质进行免疫反应。于

38、是，特异性抗体就和NC膜上相应特异性蛋白质结合成抗原抗体复合物。（4）用和第一抗体相对应特异性第二抗体，将它进行碱性磷酸酶标记或辣根过氧化物酶标记或放射性核素标记。将这种标记第二抗体和第一抗体抗原复合物反应。于是标记了第二抗体就和第一抗体进行特异性结合。形成了三种物质三元复合物。（5）印迹信号检测： 显色检测：加入相应底物，在碱性磷酸酶或辣根过氧化物酶作用下，使底物反应产生具有一定颜色物质。 放射性自显影检测：用于放射性核素标记信号检测。2.应用： （1）蛋白质特别是微量蛋白质定性检测：一复合物组分蛋白质中含有微量目蛋白质时，可用Western blotting 进行定性检测。 （2）特异蛋白

39、质半定量分析：特异蛋白质经蛋白质印迹质显色后，和标准量蛋白质比较，经扫描方法可进行半定量测定。6、 什么是斑点印迹（DNA点杂交）？什么是细胞原位杂交？答：斑点印迹（dot blotting）:将待测DNA或RNA，不需经电泳分离直接点样在NC膜使之呈点状。再用标记已知碱基顺序探针和之杂交。如出现阳性杂交体，根据探针碱基顺序，按碱基配对规则就可确定待测DNA或RNA存在以及它们含量。细胞原位杂交（ISH，in situ hybridigation）：用组织切片或细胞涂片或细胞印片，对其进行一定处理，使细胞膜通透性增加，用标记探针和之杂交，在细胞DNA原位置处形成杂交体。常用于肿瘤基因诊断。7、

40、 什么是PCR？基本原理是什么？答：PCR (polymerase chain reaction) 称聚合酶链反应，是由美国生化学 Mullis 于1983年创建方法。使一个基因片段在试管内经 2-3小时反应后，其拷贝数可增加至百万倍以上，不需要经复杂分子克隆技术就可得到基因片段大量拷贝，使得过去很多不能进行分子生物学实验得以顺利进行。PCR基本原理 利用DNA半保留复制原理结合体外DNA在不同温度下变性、复性原理建立了高温变性、低温复性、适温（称延伸温度）下合成链延伸三步连续反应不断循环： 1，高温变性：94左右时，双链DNA中两条单链之间氢键断裂，解开成两条单链，便于起模板作用，但又不影响

41、3，5-磷酸二酯键稳定性。此温度时，单链DNA引物自身间聚合也完全解开，引物便于充分发挥作用。2. 低温复性，便于DNA单链引物和单链模板DNA之间结合：在55左右时，一对（两条）小DNA单链引物中，一条引物和一条模板链3端互补结合。另一条引物和另一条模板链两条3端互补结合。 3. 适温下DNA链合成延伸：在72左右时，在耐热DNApol（ Taq DNApol ）催化下，以四种dNTP为原料，从引物3-OH上开始延长合成DNA上述三步连续反应组成一轮（个）循环，上一轮循环产物又可作为下一轮循环模板。三步连续反应不断循环，经过 25-30 轮循环后，扩增基因片段拷贝数可达到百万倍以上。扩增DN

42、A片段长度基本是两条引物 5端之间 DAN片段。8、 PCR引物应具备哪些条件？答：1、PCR引物为一对（两条）DNA单链：其中一条引物和模板双链DNA中一条模板单链3端相应部位碱基互补。另一条引物和另一条模板单链3端互补结合。 2、引物长度：约15-20个核苷酸。 3、引物和模板DNA非扩增区不应该存在碱基互补，否则，将产生一些非特异性扩增产物。4、引物 3端碱基，一定要和模板互补，否则将不产生延伸效应。 5、引物 5端碱基和模板互补要求不十分严格，甚至可游离十几个碱基而不影响 PCR 扩增反应。 6、PCR扩增片段长度：复性时两条引物 5端之间DNA片段。9、 PCR主要用途有哪些？试述之

43、。答：（一）获得目基因，用于目基因克隆 根据目基因两端碱基顺序，设计合成一对引物从基因组DNA 或 cDNA中进行 PCR扩增，获得目基因片段。（二）体外基因定点突变 根据对突变要求（点突变、缺失突变等）设计合成相应突变引物，然后进行分段PCR扩增，最后将分段扩增产物再融合扩增。于是定点突变（引物）就嵌入到基因组中。（三）对微量DNA及RNA进行分析 在PCR未出现之前，由于微量DNA信号太弱，不易进行分析 。PCR具有高度敏碱性，微量DNA（哪怕是一滴血或一根头发中一个DNA分子）经PCR扩增后可得到基因大量拷贝，便于进行定性及定量分析。这在基因诊断、法医中犯罪对象认定及亲子鉴定等方面，都有

44、广泛应用前景。（四）DNA序列测定 从基因组DNA经PCR扩增得相应目DNA片段后，通过DNA自动测序仪或手工操作法进行DNA直接测序。也可用核酸杂交等方法进行间接测序。（五）基因点突变分析 1，引物特异性PCR2，PCR-SSCP（单股链构象多态性） 3，等位基因特异性寡核苷酸探针分析(PCR-ASO) 4，基因芯片技术10、 什么是引物特异性PCR？什么是PCRASO？答：（1）、引物特异性PCR：从基因组DNA经PCR扩增得到目基因，针对目基因突变点碱基性质设计合成 3 端和之互补引物，又进行PCR扩增，于是，突变阳性基因有扩增产物，突变阴性基因，没有扩增产物，称之为引物特异性PCR。等

45、位基因特异性寡核苷酸探针分析(PCR-ASO)： （2）、PCR 扩增突变基因，合成针对突变点探针，将它和扩增产物杂交，杂交阳性说明有相应基因突变存在。11、 什么是RTPCR？什么是原位PCR？答：（一）RTPCR（逆转录PCR） RTPCR（reverse transcription PCR）是将 RNA 逆转录反应和 PCR反应联合应用一种技术。首先，以RNA为模板，经逆转录得到cDNA，再以cDNA为模板，经 PCR 扩增目基因。目前，RTPCR是真核细胞mRNA进行定性及半定量分析有效方法。（二）原位PCR 原位PCR（in situ PCR）是在组织切片或细胞涂片细胞内进行PCR。

46、对扩增产物用特异性探针和之进行原位核酸杂交，从而检测出待测DNA或RNA存在以及存在部位。虽然这种方法灵敏度不高，但它是目基因定位一个最佳方法。12、 非探针类实时荧光定量PCR基本原理是什么？答：原理：在常规PCR时，加入特殊荧光染料SYBR Green，这种染料能和双链DNA小沟区域结合。当这种染料未和DNA结合处于游离状态时，荧光信号强度极低。一旦它和双链DNA通过小沟区域结合后，荧光信号大大增强，约为游离时1000倍。PCR扩增产物双链DNA越多，荧光信号就越强，下一轮循环变性时，双链DNA能形成单链，荧光近消失，待这一轮循环结束，产生双链DNA时，又出现大量荧光。这样，实时记录了荧光量即DNA量。13、 探针类实时荧光定量PCR有哪三种？试述TaqMan探针法基本原理。答：根据使用探针不同又分为：TagMan探针法，分子信标探针法及荧光共振能量转移探针法。TaqMan探针法基本原理：在常规PCR反应体系中，加入一条能和模板DNA特异结合TagMan探针，这个探针5端标记有荧光报告基团R（reporter， R），3端标记有荧光淬灭基团Q（quencher，Q）。当探针上报告基团R及淬灭基团Q同时存在时，无荧光信号释放。当R基团和Q基团分离时，R基团便能产生荧光信号。PCR扩增时，DNA链合必延长，当遇到和模板DN