2022年应用Real_timePCR对基因芯片结果的验证分析归类 .pdf

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1、现代医药卫生年卷第期成细胞凋亡异常关系的研究中华皮肤科杂志， ， ： 田辉凯 ， 夏天， 蒋春笋 ， 等促进小鼠肝线粒体膜通透性转运孔的开放生物化学与生理学报， ， （）： ， ， ， ： ， ， ，（）： 刘红涛 ， 王玉刚 ， 张颍妹 ， 等 凋亡相关新基因的克隆、 表达和功能研究高技术通讯， ， ： ， ，： 收稿日期 ： 如果希望筛选特定肿瘤发生、发展和转移等病理过程牵涉的所有基因表达， 基因芯片是目前最有效的工具。我们用人基因表达芯片对（）质粒转染和（）转染后细胞进行基因表达差异分析。研究结 果 发 现 ， 芯 片中共有倍表达 差 异 的 基 因共条 ， 其 中条表 达 下调 ，条表

2、达上调。这些表达变化显著的基因包括原癌基因和抑癌基因、 细胞周期蛋白类、细胞信号和传递蛋白、细胞凋亡相关蛋白等。说明基因对肿瘤细胞的影响可能涉及到细胞生长的多个方面。为提高芯片结果的可信度， 我们选取基因表达谱 芯 片 分 析 结 果 中 的和 基 因 的 表 达 情 况 应 用方法进行实验验证。材料转 染（）空 质 粒 和 转 染（）的细胞为本室保存并经鉴定。胎牛血清购自灏洋生物公司，二甲亚砜为公司产品。为公司的产 品 ，试 剂 盒 购 自 日 本公 司 。 。 扩 增 引 物 （： ， ； ： ， ； ， ） 由上海欧易生物科技有限公司设计合成。方法细胞复苏与培养： 分别将转染（）（ 实验

3、组 ） 、（）（ 对 照 组 ）细 胞 常 规 复 苏 ，胎 牛 血 清 的培养液培养， 根据细胞生长情况传代， 收获生长良好细胞。细胞总抽提 ： 每 个细胞加入提取试剂 ， 提取实验组和对照组细胞的总， 液氮中保存。 通过琼脂糖凝胶电泳检测、和条带变化。 检测和的表达差异： 根据基因芯片检测结果， 我们选取了上调表达差异基因和， 用做内参照 ， 在实验组与对照组样品中分别进行定量检测。第一链合成： 在 管中配制 的反应溶液并变性 ：加入 （）（ ） ，总 ， 加水补足 ，预变性分钟 ， 冰浴。在上述管中加入反应缓冲液 ， ，（） ， 。 置于仪中进行探针标记反应，保温分钟后 ， 加入（ ，）

4、 。将管置于仪中保温分钟后 ，变性分钟 ， 保存 ； 将模板稀释倍进行下一步反应。制备标准曲线样品： 取模板进行目的基因的扩增， 产物连续做倍梯度稀释， 做个点 ， 用于制备标准曲线样品 。反 应 体 系 与 反 应 条 件 ： 体 系 中 加 入 ， ， 正 、 负 引 物 各 ，聚 合酶 ， 模 板 ， 加 水 补 足 。 预 变 性 分 钟 ， ， ， 分 钟 ，个 循 环 。 （ 每 个 检 测 基 因和内参照基因需分别进行） 。定量检测 ： 采用荧光定量仪分别扩增目的基因和内参基因， 测定标准曲线和熔解曲线， 确保扩增的准确性和专一性 ， 用值表示样品中模板 的 相 对 含 量 。

5、荧 光定 量的 反应体系与循环条件： 反应体系中加入正、负引物 （ ）各 ， ， 模 板 ， 加 水补 足。 预 变 性 分 钟 ， ， ， 分钟，个循环。 产物熔解曲线测定条件为： 分钟 ， 分钟， 每升高保持 ， 至。 根据反应数据， 通过计算获得目的基因的差异表达倍数。结果【 摘要】目的 ： 应用方法对基因表达谱芯片分析结果进行验证， 并提高芯片结果的可信度。方法 ： 从基因转染细胞前后的芯片分析差异基因中选择和 基因 ， 用检测其在转染前后细胞中的相对含量， 与芯片分析结果进行比较。结果 ：对、检测 ， 实验组的表达量分别为对照组的倍和倍（ 芯片检测结果分别为和倍） ， 与芯片检测结果

6、具有相同的方向性， 且数据非常接近。结论 ：基因芯片和分析基因表达变化均可信， 基因芯片筛选基因表达谱具有高通量大规模的特点， 而则适合单个基因表达变化的研究，两者互为补充和印证。【 关键词】 实时荧光定量； 基因芯片；基因文章编号：（）中图分类号：文献标识码：应用 对基因芯片结果的验证分析袁才佳， 聂新民中南大学湘雅三医院检验科， 湖南长沙；湘南学院医学检验系， 湖南郴州）基金项目 ： 国家自然科学基金资助项目（ ）名师资料总结 - - -精品资料欢迎下载 - - - - - - - - - - - - - - - - - - 名师精心整理 - - - - - - - 第 1 页，共 3 页

7、 - - - - - - - - - 现代医药卫生年卷第期基因名称 平均值表 和基因在两个样本中的相对表达量 （ 以对照组为）组别对照组实验组相对表达量基因名称 基因芯片（）表两个差异表达基因的基因芯片与检测结果比较转染细胞提取总质量检测结果： 采用试剂抽提转染（） 的（）和 转 染 空 质粒（ ）的（）培养细胞的总， 通过琼脂糖凝胶电泳检测质量 ， 可见条清晰的带：、和， 且条带明显亮于（ 见图） 。图培养细胞提取总电泳图 验证和 基因的表达改变： 结果用值表示样本中测定模板的起始拷贝数，值越小 ， 起始拷贝数越多 ，值越大 ， 起始拷贝数越小。通过制备每个目的基因的样品标准曲线和熔解曲线保

8、证扩增结果的准确性和专一性， 标准曲线的线性回归系数， 扩增效率在 之间 ； 解链温度一致 （ 图，） 。 结果显示两个样本中内对照的表达量非常接近， 而和 的 表 达 量 有 差 异 ， 经 计算 其 相对 含 量 ，和 在 转 染基 因 后 的 表 达 量 分 别 为空质粒转染的和倍 （ 见图，； 表） ， 与芯片结果方向一致 ， 结果非常接近（ 见表） 。图 标准曲线图 扩增产物的熔解曲线图 基因在两个样本中的表达量图 基因在两个样本中的表达量讨论基因芯片是将克隆到的成千上万个基因特异的探针或其片段固定在一块芯片上，用不同荧光（红和绿）标记来源于不同的个体（正常人与患者）、 组织、细胞周

9、期、 发育阶段、分化阶段、 病变、刺激（包括不同诱导、不同治疗手段）下的细胞内或反转录后产生的， 并与芯片上的探针进行杂交， 将支持物上未发生互补结合反应的片段洗去，通 过 激 光 共聚焦显微镜扫描，借助计算机系统对荧光信号强弱的分析处理，推测出样品中大量相关基因的定量信息。从而对这些基因表达的 个 体 特 异 性 、 组 织特 异 性 、 发 育 阶 段 特 异性 、 分 化 阶 段 特 异性、 病变特异性、 刺激特异性进行综合的分析和判断，迅速将某个或几个基因与疾病联系起来，极大地加快这些基因功能的确定，同时可进一步研究基因与基因间相互作用的关系。其特点是高效、快速、自动微型化、 高通量、

10、 高度并行性及高度敏感性。自年斯坦福大学等在美国 科学杂志发表第一篇利用基因芯片技术研究基因表达谱的文章和等利用基因芯片技术研究人类肿瘤以来，这一崭新技术已成功地应用于多种肿瘤的基因表谱分析、肿瘤进展相关基因及诊断指标筛选，特别是用于多种恶性肿瘤分子学分类、分型及对治疗的反应、肿瘤转移复发和预后的预测等研究 。荧光实时技术最早是在年由日本人提出 ， 该方法可以对待测样品中的目标基因进行准确定量。发展早期就是运用最简单的方法，在反应体系 中，加 入 过 量荧 光 染 料 ，荧 光 染料特异性地掺入双链后 ， 发射荧光信号 。 在反 应 体 系中加入过量的该染料，扩增过程中随着反应的进行合成的增多

11、 ， 结合的染料增多， 荧光强度也就增加， 通过测定各反 ： （）； ： （）名师资料总结 - - -精品资料欢迎下载 - - - - - - - - - - - - - - - - - - 名师精心整理 - - - - - - - 第 2 页，共 3 页 - - - - - - - - - 现代医药卫生年卷第期现回顾分析我院年月 年月确诊的例十二指肠恶性肿瘤患者的临床资料， 对其临床表现、诊断及治疗方法进行分析 ， 以期加强临床医生对该病的认识， 提高早期诊断率，改善患者的预后。临床资料一般资料： 本组例 ， 男例 ， 女例 ， 年 龄 岁 ， 中位年龄岁 ， 病程个月 年。主要临床表现为腹

12、痛例， 多为隐痛及胀痛 ，例患者伴有消瘦、纳差 ；例患者进食后腹胀、恶心、呕吐 ， 均伴有不同程度的贫血；例患者出现黄疸或腹部包块。诊断手段主要是十二肠镜， 胃肠钡餐 ， 以及检查 ， 其中行十二指肠镜检查发现例， 十二指肠气钡双重造影例，发现例。肿瘤部位及手术方式：例患者均行手术治疗， 术中见肿瘤位于十二指肠乳头上部例， 乳头周围部（不包括乳头部）例 ，乳头下部例。肿瘤侵犯胰头部例， 侵犯肠系膜上动静脉例。例行节段性十二指肠切除术，例行胰十二指肠切除术，例行姑息手术和无法手术（包括单纯胃空肠吻合术例及胃空肠吻合及胆肠吻合双吻合例 ， 无法手术例）。 本组手术切除率为， 术后发生并发症例，例胰

13、肠吻合口漏及例胆肠吻合口漏。 无手术死亡。例患者均完全随访， 其中例胰十二指肠切除患者术后，年生存率分别是，例 十二 指肠区段切除患者于术后 个月内死亡，例姑息手术和无法手术患者均于术后个月内死亡。肿瘤病理类型： 本组中病理报告腺癌为例 ， 有胰腺浸润例， 淋巴结转移例 ， 平滑肌肉瘤例， 未见淋巴结转移， 恶性淋巴瘤例。讨论十 二 指 肠 恶 性 肿 瘤 中 ， 腺 癌 发 病 率 较 高， 本 组 为（）， 原因尚不清。 一般认为十二指肠恶性肿瘤多发生于十二指肠降部， 这可能与进入肠道的胆酸在肠液和细菌的作用下形成胆蒽和甲基胆蒽等致癌物有关。 本病缺乏特征性表现， 早期多为上腹部不适， 继

14、而出现腹痛、消瘦、黄疸、呕吐、消化道出血及腹部包块、 贫血等症状， 少部分可见食欲不振、腹胀、发热、乏力等表现。 临床表现与肿瘤部位有关， 球部肿瘤的首发症状为消化道出血、肠道梗阻； 降部肿瘤位于十二指肠乳头周围部【 摘要】目的 ： 探讨原发性十二指肠恶性肿瘤的诊断和治疗方式， 提高诊治水平。 方法 ： 对我院年月 年月明确诊断的例十二指肠恶性肿瘤患者的临床资料进行回顾性的分析。结果 ： 本组患者分别通过十二指肠镜， 消化道造影，诊断确诊率分别是，。 其中作胰十二指肠切除例 ， 术后，年生存率分别是，。 姑息手术和无法手术的有例， 均于术后个月内死亡。例作十二指肠区段切除， 于术后 个月内死亡

15、。 结论 ： 十二指肠镜对十二指肠肿瘤的诊断率较高， 胰十二指肠切除可以提高患者的生存率。【 关键词】 十二指肠； 恶性肿瘤； 外科诊治文章编号：（）中图分类号：文献标识码：原发性十二指肠恶性肿瘤 例外科诊治体会刘庆（ 泸州医学院附属医院普外科， 四川 泸州）应管的荧光信号与荧光域值线的交叉点所对应的循环次数（ 指数扩增的开始阶段， 即循环阈值（） 反映样品中目的基因的起始模板数。 该方法利用的概念 ， 在指数扩增的开始阶段进行检测 ， 此时样品间的细小误差尚未放大， 因此该值具有极好的重复性和准确性， 是检测样本中目的基因拷贝数多少的可靠方法。荧光染料的优势在于它能监测任何序列的扩增，不需要

16、探针的设计，使检测方法变得简便，同时也降低了检测的成本。引物二聚体的问题目前可以用带有熔解曲线（）分析的软件加以解决。本实验中的熔解曲线很好地显示了扩增产物的一致性。对、检测 ， 实验组的表达量分别为对照组的倍和倍 （ 芯片检测结果分别为和倍 ） ， 与芯片检测结果具有相同的方向性， 且数据非常接近。总 之 ，基 因 芯 片 和分 析 基 因 表达 变 化都是准确可信的。基因芯片筛选基因表达谱具有高通量大规模的特点 ， 而则适合单个基因表达变化的研究，两者互为补充和印证， 在基因表谱分析、肿瘤进展相关基因及诊断指标筛选研究上具有极其重要的作用。参考文献： ， ， ， ， （）： ， ， ，（）： ，： ， ，（）： ， ， ， ， ，（）： ， ， ，（）： ， ， ， ， ， （）： ， ， ， （）： ， ， ， （ ） ， ， （）：收稿日期 ： 名师资料总结 - - -精品资料欢迎下载 - - - - - - - - - - - - - - - - - - 名师精心整理 - - - - - - - 第 3 页，共 3 页 - - - - - - - - -