体外受精技术.ppt

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1、关于体外受精技术现在学习的是第1页，共71页体体外外受受精精的的概概念念狭义：将动物受精过程中的精卵结合在体外环境下完成的现象。包括自然条件下的体外受精(两栖类和鱼类)，和人为培养条件下的体外受精(哺乳动物)。广义：经过特殊处理的精子在体外使卵母细胞受精的技术，所以体外受精的胚胎移植后所生婴儿又称为“试管婴儿”。包括卵母细胞的体外成熟和受精卵的体外培养两项配套技术。优点：与体内受精相比，所需精子数减少，提高精液利用率。Example: 流式细胞含仪分离的性控精子只能用于体外受精。现在学习的是第2页，共71页国国内内外外研研究究现现状状 1878年，Schenk(Germany)将体内成熟的家兔

2、和豚鼠卵子与附睾精子放入子宫液中培养，观察到第二极体的排出和卵裂现象； 1945年，张明觉(华裔)偶然获得兔体外受精卵，但无重复性，且无试管动物出生； 1951，张明觉与Austin(澳)同时发现精子获能现象；1959年，他首次获得体外受精兔； 80年代以来，对胚胎需求量的加大，促进了家畜体外受精的研究，牛、绵羊、山羊、猪等体处胚相继获得了成功，国内90年代在家畜上也获得了成功； 现已将卵母细胞体外成熟-体外受精-早期胚体外发育-冷冻保存结合在一起，建立工厂化胚胎生产。现在学习的是第3页，共71页国国内内外外研研究究现现状状世界体外受精的首创纪录 动物种类 首创纪录文献 兔 Thibault(

3、1954) 叙利亚仓鼠 Yanaginmachi,chang(1963) 小鼠 Whittingham(1968) 中国仓鼠 Pickworth,Chang(1969) 猫 Hammer(1970) 土拨鼠 Yanagimachi(1972) 大鼠 Miyamoto,Chang(1973) 狗 Mahi,Yanagimachi(1976) 牛 Brackett(1978) 猪 Iritani,Niwa(1977) 绵羊 Bondioli,Wright(1980) 山羊 花田章(1985) 现在学习的是第4页，共71页国国内内外外研研究究现现状状我国体外受精的首创纪录 动物种类 首创纪录文献 小

4、鼠 陈秀兰(1986) 兔 范必勤(1987) 绵羊 旭日干(1989) 牛 旭日干(1989) 山羊 钱菊汾(1990) 猪 范必勤(1990) 水牛 蒋和生(1993) 现在学习的是第5页，共71页体体外外受受精精技技术术流流程程 卵母细胞的体外成熟 精子的体外获能 卵母细胞的体外受精 受精卵的体外发育 配子的冷冻保存现在学习的是第6页，共71页体体外外胚胚胎胎生生产产技技术术要要点点卵母细胞的采集与体外培养1. 1. 离体采集离体采集：30min内取卵巢，置生理盐水或PBS（25-35），3h内回收。 卵泡抽吸法：卵泡抽吸法： 针头穿刺，一次进针可抽吸卵巢皮质的多个卵泡 优点：回收速度快

5、，不易造成卵母细胞的污染； 缺点：容易损伤卵母细胞周围的卵丘细胞，影响其随后的成熟。 现在学习的是第7页，共71页体体外外胚胚胎胎生生产产技技术术要要点点卵母细胞的采集 卵巢解剖法卵巢解剖法：卵巢切为两半，去掉中间的髓质部分，刀片划破卵泡，在培养液中反复冲洗 优点：能保持卵母细胞周围卵泡细胞的完整性，回收率也相对较高；缺点：回收的速度相对较慢，容易造成污染。 现在学习的是第8页，共71页体体外外胚胚胎胎生生产产技技术术要要点点卵母细胞的采集2. 2. 活体采集活体采集(Ovum Pick-Up,OPU)(Ovum Pick-Up,OPU) 腔镜法腔镜法：腹壁切开一小口，插入腹腔镜，操作杆和穿刺

6、针，配合将卵母细胞抽吸出来优点：比较直观，容易掌握；缺点：工作量大，对母牛有损伤，不能频繁手术。现在学习的是第9页，共71页体体外外胚胚胎胎生生产产技技术术要要点点卵母细胞的采集 B B型超声波法：型超声波法：超声波探头和采卵器插入到阴道子宫颈的一侧穹隆处。术者通过直肠将卵巢贴在探头上，根据B超屏幕上所显示的卵泡位置进行穿刺而将卵母细胞抽出 优点：不用手术，操作速度快，对母牛损伤小，可频繁采卵，且亦可对妊娠母牛采卵；缺点：操作技术较难掌握，并需要昂贵的超声设备。 现在学习的是第10页，共71页体体外外胚胚胎胎生生产产技技术术要要点点卵母细胞的筛选 只有周围包被着完整卵丘（A级）或部分卵丘脱落（

7、B级）(1层以上卵丘细胞）、胞浆均质并充满于透明带内的卵母细胞才能进行成熟与胚胎发育的培养。A级：卵丘细胞致密，至少有5层以上；B级：卵丘细胞为2-4层；C级：卵母细胞大部分被包裹；D级：卵母细胞少量被包裹；E级：裸卵。 A、B级可用于培养，C、D级成熟率低。现在学习的是第11页，共71页体体外外胚胚胎胎生生产产技技术术要要点点卵母细胞的体外成熟卵母细胞成熟目的： 提供可利用的卵母细胞用于体外受精、克隆等； 研究其体内成熟的模型。卵母细胞体外成熟的特征 生发泡破裂； 染色体凝集； 纺缍体形成； 极体排出； 透明带软化； 卵丘细胞扩展。现在学习的是第12页，共71页体体外外胚胚胎胎生生产产技技术

8、术要要点点卵母细胞的体外成熟卵母细胞成熟培养液 以TCM-199较好，可使牛、羊、猪的卵母细胞体外成熟率高达80%以上。添加成分： 促性腺激素：FSH、LH FCS、BSA：有认为FCS比BSA好，而发情牛血清或发情羊血清比FCS好。 抗生素现在学习的是第13页，共71页体体外外胚胚胎胎生生产产技技术术要要点点卵母细胞的体外成熟培养Oocyte Collection Medium (OCM) 最常用的是碳酸氢钠或Hepes缓冲的TCM-199;2. Oocyte Maturation Medium （1) Bovine steer serum (2) Folltropin (3) Estrad

9、iol (4) Na Pyruvate (5) Glutamine 现在学习的是第14页，共71页体体外外胚胚胎胎生生产产技技术术要要点点卵母细胞的体外成熟培养2. 2. 成熟培养时间成熟培养时间 一般22h-24h，但猪40h-44h，马30h-36h，兔仅12h-15h 3. 3. 成熟培养的温度和气相环境成熟培养的温度和气相环境 人和啮齿类动物：37 牛、猪、羊和马等：3839。 pH：7.7好于7.1，7.4，8.0 渗透压：330 Osm/kg好于300，320 气相： 5%CO2 5%CO25%O290%N2 现在学习的是第15页，共71页体体外外胚胚胎胎生生产产技技术术要要点点卵

10、母细胞的体外成熟培养4.IVM4.IVM系统系统 开放培养系统开放培养系统 1ml-2ml成熟培养液直接置于平皿内或培养板内，放入50枚-200枚卵母细胞培养，上面不盖石蜡油。 优点：简单，对培养液中的脂溶性物质没有若影响，能同时培养大量细胞 缺点：渗透压变化较大，容易污染 现在学习的是第16页，共71页体体外外胚胚胎胎生生产产技技术术要要点点卵母细胞的体外成熟培养 微滴培养系统微滴培养系统 将成熟培养液在做成50-500l的微滴，覆石蜡油，将卵母细胞置于其中培养。 优点：渗透压比较稳定，不易污染； 缺点：对脂溶性物质有稀释作用，成本高，培养结果易受石蜡油质量的影响。 密闭培养系统密闭培养系统

11、 置12ml培养液的试管中，胶塞，在培养箱或恒温水浴中培养；若采用培养皿或微滴培养，则可将其装入密闭的塑料袋内。 优点：不要CO2培养箱，方便运输 缺点：pH不如前者稳定。 现在学习的是第17页，共71页体体外外胚胚胎胎生生产产技技术术要要点点卵母细胞的体外成熟卵母细胞成熟的标志 第一极体的排出、卵丘细胞的扩展可作为成熟的标志，而生发泡破裂(GVBD)是卵母细胞恢复减数分裂的主要标准，因此常用地衣红染色才可判断。牛卵母细胞体外成熟标准：1级成熟卵：卵丘细胞完全扩展，卵丘细胞至少向外扩展3倍于裸卵直径；2级成熟卵：卵丘细胞中等扩展，卵丘细胞至少向外扩展2倍于裸卵直径；3级成熟卵：卵丘细胞轻度假扩

12、展，卵丘细胞仍紧紧粘附于透明带上。 1级和2级卵通常均已排出第一极体。现在学习的是第18页，共71页体体外外胚胚胎胎生生产产技技术术要要点点卵母细胞体外成熟的质量评定 形态观察：形态观察：细胞质均匀、没有空泡 固定染色法固定染色法 ：0.1%透明质酸酶 醋酸酒精或醋酸甲醇（1:3）固定24h48h 1%间苯二酚兰（Lacmoid）或1%地衣红（Orcein）的40% %醋醋酸溶液染色酸溶液染色 受精和胚胎发育潜能的评定受精和胚胎发育潜能的评定 现在学习的是第19页，共71页体体外外胚胚胎胎生生产产技技术术要要点点卵母细胞的体外成熟影响卵母细胞成熟的因素 卵母细胞的来源：不同种类的动物、不同生理

13、阶段的动物(小牛低于成年牛)、卵母细胞的质量等；（1 1）动物种类与年龄：）动物种类与年龄： 牛、羊效果较好，而马、猪较差。 小牛卵母细胞的平均直径（118.041.15m）比成年母牛的（122.840.74m）小。 体外成熟的小牛卵母细胞体外受精后发育潜力也低于成年卵母细胞现在学习的是第20页，共71页体体外外胚胚胎胎生生产产技技术术要要点点卵母细胞的体外成熟（2）卵母细胞的形态 A、 76.2%； B、67%； C、22%； D、11.4% （3）卵巢贮存时间与温度 30C 对成熟和胚胎发育不利(First & Parrish） 绵羊的卵巢贮存在22C数小时对成熟无明显影响，但体温条件下则

14、会使卵母细胞的质量下降 (Moodie & Graham )现在学习的是第21页，共71页体体外外胚胚胎胎生生产产技技术术要要点点卵母细胞的体外成熟2. 2. 激素激素 目前大多数都离不开FSH或LH或两者的混合物，但仍有争议 GH能显著提高精子的受精率，促进卵裂及胚泡的形成 甲状旁腺激素相关蛋白（PTHrP） 胰岛素 激活素 现在学习的是第22页，共71页体体外外胚胚胎胎生生产产技技术术要要点点卵母细胞的体外成熟3. 3. 生长因子生长因子 目前已经证实与卵母细胞成熟有关的生长因子有：上皮细胞生长因子（EGF）、转化生长因子和（TGF-，）、成纤维细胞生长因子（FGF）、胰岛素类生长因子和（

15、IGF-，）4. 4. 血清血清 胎牛血清（FBS）、发情牛血清（OCS）、发情前期母牛血清（POS）、超排母牛血清（SCS）、公牛血清（SS）。 现在学习的是第23页，共71页体体外外胚胚胎胎生生产产技技术术要要点点卵母细胞的体外保存1. 371. 37保存保存 应考虑保存时间与卵老化 2.2.低温保存低温保存 0-10 兔:10，受精能力显著降低。 现在学习的是第24页，共71页体体外外胚胚胎胎生生产产技技术术要要点点卵母细胞的体外保存 3. 3. 冷冻保存冷冻保存 借鉴胚胎冷冻方法，现已建立了几种卵母细胞冷冻程序 ： A 慢速冷冻、慢速解冻法 B 慢速冷冻、快速解冻法 C 快速冷冻、快速

16、解冻法 D 一步冷冻法 E 玻璃化法 F 超快速冷冻法 现在学习的是第25页，共71页体体外外胚胚胎胎生生产产技技术术要要点点影响卵母细胞成熟的因素培养条件： 温度：37C较好，但各种动物最适温度不同，如兔子低于体温3C较好，牛35-39C都可，但38-39C最合适； 培养基：水、血清（无血清、有血清)、 无血清时添加BSA等；有血清时如胎牛血清、发情牛血清、公牛血清、超排牛血清等；现在学习的是第26页，共71页体体外外胚胚胎胎生生产产技技术术要要点点精子的分离与洗涤洗涤的目的：去掉精浆中抑制精子获能的因子和死精子，或洗去防冻剂及卵黄等成分，以获得活力好的精子。 精子分离及洗涤方法 悬浮法(S

17、wim-up)：利用精子上游的特性将高活力的精子与死精子及精浆成分分开。 将精液置于获能液或受精液中，培养箱中孵育龄10-30分钟，吸取上层液体，再离心洗涤1-2次即可。精子的分离、洗涤与体外获能现在学习的是第27页，共71页体体外外胚胚胎胎生生产产技技术术要要点点精子的分离、洗涤与体外获能 离心洗涤法：对于活力好的精子直接将其放入获能液或受精液中，离心洗涤若干次便可。 BSA/Percoll密度梯度离心法：利用形态正常精子密度高于异常精子的原理。如将BSA制成不连续的密度梯度或将Percoll制成30-40%或45-90%梯度，经平衡离心从而得到高受精力的精子。 玻璃棉过滤法：采作小玻璃珠过

18、滤除去死精子。因其成本高，较少采用。现在学习的是第28页，共71页（二）精子获能处理方法（二）精子获能处理方法 1. 1. 血清白蛋白法血清白蛋白法 将精子与血清白蛋白溶液进行长时间孵育 。 该法由于需要的时间较长，且诱发精子获能的作用不强，故仅在IVF技术研究的初期进行过尝试，具有一定作用，目前仅作为精子获能的一种辅助手段。2. 2. 高渗盐法高渗盐法 精子表面含有许多被膜蛋白，即所谓的“去能因子”。当用高离子强度溶液处理精子时，这些被膜蛋白将从精子的表面脱落，从而导致精子获能。 由于高离子强度溶液对精子具有渗透打击作用，会影响精子的活力，故目前已废除不用。 现在学习的是第29页，共71页（

19、二）精子获能处理方法（二）精子获能处理方法3.3.卵泡液孵育法卵泡液孵育法 卵泡液含有来自血清的大分子物质，并含有诱发精子获能和顶体反应的因子，故在精液中添加一定浓度的卵泡液可诱发精子获能。 10%卵泡液，牛受精分裂率（40.3% Vs 87.5%）和囊胚发育率（8.3% Vs 40.4%）均显著下降，但加入50%的卵泡内膜细胞条件液则能 。 卵泡液可以用于精子的获能处理，但不能用于IVF系统。现在学习的是第30页，共71页（二）精子获能处理方法（二）精子获能处理方法4. 4. 钙离子载体法钙离子载体法 钙离子载体A23187能直接诱发Ca2+进入精子细胞内，提高细胞内的Ca2+浓度，从而导致

20、获能。 0.5mol/L1.0mol/L A23187溶液处理精子5 min，然后加入等量含1% BSA的BO溶液终止A23187的作用，即可将获能精子加到含卵母细胞的受精滴中进行IVF。 注意控制A23187的工作浓度和作用时间，否则会导致精子的活力下降和死亡。 现在学习的是第31页，共71页（二）精子获能处理方法（二）精子获能处理方法 5. 5. 肝素法肝素法 肝素是一种高度硫酸化的氨基多糖类化合物，与精子结合后，能引起Ca2+进入精子细胞内部而导致精子获能。 最初，制备好的精子常用含有肝素（100mg/L）的获能液预处理15 min，然后加到受精滴中进行IVF。 现直接将肝素（50mg/

21、L）添加到受精液中进行受精。 现在学习的是第32页，共71页（三）精子获能的检测（三）精子获能的检测 1. 精子形态及运动方式的观察 头部膨大，活力增强，超活化 2. 顶体反应的检测 （1）双重染色法 优点：无需昂贵设备，简单易行； 缺点：易发生误判 （2）透射电镜观察 成本高，制片繁琐，可操作性不强。 现在学习的是第33页，共71页三、IVF培养系统 （一）微滴系统（一）微滴系统 20-40l微滴受精液，覆石蜡油，每滴放入IVM的卵母细胞10-20枚及获能处理的精子（1.0-1.5）106个/ml，孵育6 -24 h 优点：受精液及精液的用量均较少，IVF的效果亦较好； 缺点：结果易受石蜡油

22、质量影响，操作繁琐，成本较高。 现在学习的是第34页，共71页 （二）四孔培养板系统（二）四孔培养板系统 每孔加入500ml受精液和100-150枚IVM的卵母细胞，然后加入获能处理的精子（1.0-1.5）106个/ml，孵育6h-24h。 优点：操作相对比较简单，受精结果不受石蜡油质量的影响； 缺点：精子的利用率相对较低，IVF效果不如微滴法稳定。 三、IVF培养系统 现在学习的是第35页，共71页 通常以精子穿透率、原核形成率、受精分裂率和囊胚发育率来衡量。其中，囊胚发育率最为可靠。 （一）固定染色法（一）固定染色法 受精810h 精子穿透率和多精子受精率；受精1820h 双原核形成率（二

23、）体外培养（二）体外培养 受精48h 2-8细胞比例，7d 囊胚发育率，9d 囊胚的孵化率 三、IVF质量评定现在学习的是第36页，共71页体体外外胚胚胎胎生生产产技技术术要要点点精子的分离、洗涤与体外获能 Sperm Swim-upIt is slower than the Percoll procedure, sometimes it does not give better results. 1. Thaw 6 to 8 straws of frozen semen in the cyto-thaw for 60 seconds. If possible, use semen from

24、different bulls. 2. Combine contents of straws in 5 ml Sp-TALP. Place sample into the incubator (38.5C) for 5 minutes. 3. Centrifuge semen (200 x g; 5 min) and discard all but the bottom 1 ml of supernatant. 4. Prepare 4 to 5 test tubes containing 1 ml Sp-TALP. Add approximately 250 l of sperm suspe

25、nsion very slowly to the bottom of each tube using a 20 gauge needle and 1 ml syringe. Place tubes in incubator (38.5C) for 1 h. 5 At the end of sperm swim-up, aspirate the top 800 l from each tube and combine samples. Centrifuge (1000 rpm) the combined sample for 5 minutes. Discard all but the bott

26、om 500 l of supernate. 现在学习的是第37页，共71页体体外外胚胚胎胎生生产产技技术术要要点点精子的分离、洗涤与体外获能 Glass- wool FiltrationThis filtration procedure usually requires 10-15 minutes and generally yields nearly 100% viable sperm. 1. Prepare in advance 0.2 ml glass wool columns in 1 ml syringes that are rinsed 10X with Milli-Q wate

27、r and autoclaved. 2. Immediately before starting purification, rinse column several times with Hepes-TALP and finally with Sperm-TALP to equilibrate column. 3. Frozen-thawed semen (3-5 straws) is washed twice with 10-15 ml Sperm-TALP by centrifugation at 200 x g (10 min) and then resuspended in 0.6-

28、0.8 ml IVF-TALP. 4. Sperm suspension is then layered over the wet column and allowed to filter by gravity. 5. The number and viability of filtered sperm is determined. 现在学习的是第38页，共71页体体外外胚胚胎胎生生产产技技术术要要点点精子的分离、洗涤与体外获能现在学习的是第39页，共71页 Thaw strawLayering of sperm onto Percoll. After cutting the tip of t

29、he straw (Left panel), the contents of the straw are expelled onto the top of the Percoll gradient (right panel). Here, removal of the semen is facilitated by using a homemade plunger. Percoll gradient: up to bottom45-90%现在学习的是第40页，共71页Removal of sperm from the bottom of the Percoll gradient. Washin

30、g sperm in Sp-TALP. The left panel shows the washed and centrifuged sperm. The right panel shows the pellet of sperm remaining in the tube after aspiration of the supernatant. Percoll method现在学习的是第41页，共71页Hemacytometer used for counting sperm. 现在学习的是第42页，共71页体体外外胚胚胎胎生生产产技技术术要要点点精子的分离、洗涤与体外获能2.精子的体外获

31、能(1)卵泡液孵育法：卵泡液含有来自血清的大分子物质，并含有诱发精子获能和顶体反应的因子，故在精液中添加一定浓度的卵泡液可使精子获能。但不能用于体外受精(卵裂率和囊胚率下降)。(2)钙离子载体法：钙离子载体A23187能诱发Ca进入精子细胞内，诱发精子的超活化和顶体反应，从而导致获能。但其作用时间和浓度对于获能非常关键。现在学习的是第43页，共71页体体外外胚胚胎胎生生产产技技术术要要点点精子的分离、洗涤与体外获能(3)肝素法：它与精子孵育后，能引起Ca进入精子内，导致获能。这是被广泛采用的获能法。原来将肝素(100mg/ml)获能液预处理精液，再受精，现在直接将肝素(50mg/ml)添加到受

32、精液中受精。 实际操作时，常将多种因素共同使用，如咖啡因-肝素-BSA系统。现在学习的是第44页，共71页体体外外胚胚胎胎生生产产技技术术要要点点精子的分离、洗涤与体外获能3. 精子获能的检测(1)精子形态及运动方式改变(常用)： 获能后的精子头部膨大，运动增强。(2)顶体反应的检测： 双重染色法：取样固定染色(快绿FCF和曙红)涂片干燥观察若头部有厚的蓝绿区为无获能，若出现粉经为获能。 电镜法：现在学习的是第45页，共71页2. 体外授精 授精通常在覆盖下的微滴中进行，微滴以50-100ul，一般每滴中加5-10个卵母细胞，精子最终浓度为1X106个/ML。培养条件：5%CO2、39C培养，

33、BO液中6-8h，TALP液中18-24h。体体外外胚胚胎胎生生产产技技术术要要点点精子的体外获能与体外受精(牛)现在学习的是第46页，共71页1. Remove plates containing matured oocytes from the incubator and place on the slide warmer. 2. Add 25 ml sperm preparation and 25 ml PHE mix into each well. When pipetting the sperm, place the pipette in the middle of the sper

34、m suspension rather than on the bottom to avoid grabbing debris that can settle to the bottom of the tube. 3. Return 4-well plate to incubator for 8-10 h. Many people do fertilization for 18-20 h. When we were establishing IVF in our lab, 8-10 h gave better results than longer incubation times. Rece

35、ntly, however, we have gotten good results with 18-20 h fertilization times. In addition, longer fertilization times make it easier to remove cumulus cells after fertilization. To determine the incidence of parthenogenesis, one well should be prepared without sperm, but with PHE. After 8 10 h, place

36、 these oocytes into a separate culture medium drop and culture for 2 days before looking at rate of parthenogenesis. 体体外外胚胚胎胎生生产产技技术术要要点点体外受精现在学习的是第47页，共71页体体外外胚胚胎胎生生产产技技术术要要点点早期胚胎的体外发育阻滞期： 各种动物的早期胚胎体外发育时都存在阻断期，因此可通过改善培养条件和在培养液中添加生长因子(TGF-或bFGF等)或细胞外基质因子克服阻断。但目前的发育率仍然比较低，约为40%，是限制体外受精应用的一个突出问题。各种动物阻

37、断期： 牛： 猪： 羊： 现在学习的是第48页，共71页体体外外胚胚胎胎生生产产技技术术要要点点早期胚胎的体外发育 培养液添加的成分：(1)丙酮酸钠和乳酸钠：作为能量底物。(2)生物体液和蛋白质：FCS、NCS、发情母畜血清、BSA等。(3)激素：PMSG、FSH、胰岛素、雌激素等，提高囊胚率。(4)生长因子及多肽：IGF，促进卵母细胞的成熟、受精和早期胚胎发育；EGF促进胚胎的分化和囊胚的形成；TGF促使牛的胚胎通过早期阻断；LIF(白血病抑制因子)提高孵化囊胚发育率，并抑制胚胎干细胞的体外分化。现在学习的是第49页，共71页体体外外胚胚胎胎生生产产技技术术要要点点早期胚胎的体外发育 2.

38、胚胎的体外培养系统常规培养系统：微滴法和培养板法。输卵管离体培养法：克服阻断，但因繁琐不常用。(1) 与体细胞共培养：如输卵管上皮细胞、滋养层细胞、颗粒细胞、子宫内膜细胞等。现在学习的是第50页，共71页体体外外胚胚胎胎生生产产技技术术要要点点胚胎的冷冻保存常规的慢速冷冻法常规的慢速冷冻法冷冻液: 1.5M甘油+0.25M蔗糖+PBSS液+0.1mg/mlPVP 1.5M乙二醇+0.25蔗糖+P BSS液+0.1mg/mlPVP冷冻方法： 在室温下，先将牛胚胎放入防冻液中平衡一段时间； 装管； 以每分钟1的速度降温至7； 植冰； 以每分钟0.5的速度降温至35；平衡10分钟后，投入液氮中保存。

39、现在学习的是第51页，共71页体体外外胚胚胎胎生生产产技技术术要要点点胚胎冷冻保存2. 2. 玻璃化冷冻玻璃化冷冻冷冻液： EFS40：40%乙二醇+0.3M蔗糖+18%聚蔗糖+PBSS冷冻步骤： 首先将胚胎放入20%乙二醇溶液（EFS20）中平衡5min； 用移卵管移入玻璃化溶液中平衡10min； 装管，封口； 将细管投入液氮冷冻保存。现在学习的是第52页，共71页影影响响体体外外受受精精的的因因素素卵母细胞的成熟精子的体外获能现在学习的是第53页，共71页（一）卵母细胞的成熟度（一）卵母细胞的成熟度现在学习的是第54页，共71页（二）精子体外获能（二）精子体外获能现在学习的是第55页，共7

40、1页 （三）公畜的影响（三）公畜的影响现在学习的是第56页，共71页Some instruments used to pick up embryos and oocytes. From left to right are a 1 cc syringe with an extension of rubber tubing connected to a Unopette, a wiretrol (from Drummond Scientific), the same device as #1 without the rubber tubing extension and a 5 ml Drummo

41、nd Microdispenser. 现在学习的是第57页，共71页Use of the wiretrol using two hands (left panel) or one hand (right panel). 现在学习的是第58页，共71页Two methods for using the Unopette tip. The device on the left panel has been modified to include a piece of rubber tubing between the Unopette and syringe to give the technic

42、ian greater control over the volume aspirated. 现在学习的是第59页，共71页 (A) On a Petri-dish (i.e. Intergrid plate) place 3 microdrops of 70 l holding medium side by side. (B) Place one blastocyst into the middle drop(C(C-D) Insert the cotton plug side of a 0.25 ml French straw into the wide end of the pipet

43、tip. D( (E) Aspirate one empty drop.A (E) Aspirate air to create a 0.5 cm columnA (F) Aspirate the microdrop containing embryo (make sure that the embryo is aspirated by observing under the microscope; A (F) Aspirate air to create a 0.5 cm columnh (G) Aspirate the remaining empty drop until the cott

44、on plug is wet.R (H) Remove transfer straw from syringe and place on slide warmer until use.现在学习的是第60页，共71页Who should be treated with in vitro fertilization? In vitro fertilization can be used as an effective treatment for infertility of all causes except for women with infertility caused by an anat

45、omic problem with the uterus, such as severe intrauterine adhesions. It is generally used in couples who have failed to conceive after at least one year of trying who also have one or more of the following:1. Blocked fallopian tubes or pelvic adhesions with distorted pelvic anatomy. Women that have

46、had tubal ligation and are considering tubal reversal surgery as well as men that are considering vasectomy reversal surgery might also consider IVF. 2. Severe male factor infertility (low sperm count or low motility) 3. Failed 2-6 cycles of ovarian stimulation with intrauterine insemination 现在学习的是第

47、61页，共71页Who should be treated with in vitro fertilization?4. Advanced female age - over 385. Reduced ovarian reserve, which means lower quantity (and sometimes quantity) of eggs. A day 3 FSH and estradiol test and antral follicle counts are often done as screening tests for egg quantity (and quality

48、). Reduced egg quantity and quality is usually treated with either IVF, or with IVF using egg donation from another woman.6. Severe endometriosis现在学习的是第62页，共71页 The graph shows live birth rates for all 23 reporting Illinois IVF centers for 2002 These clinics reported live birth rates ranging from 13

49、.5% to 47.4% per egg retrieval for women under 35 Five Illinois IVF programs failed to report their outcome data to the government (US law requires reporting annually)现在学习的是第63页，共71页How is in vitro fertilization performed?1. Basic screening tests are performed on both partners at all IVF clinics.In

50、general, some testing of ovarian reserve should be done on the female prior to starting the injections. We use day 3 FSH testing as well as antral follicle counts for this purpose. The results of these tests give us some ability to predict whether her ovaries will respond well to the drugs (make suf