连苯三酚法-邻苯三酚法用于SOD 超氧自由基清除-过氧自由基清除-过氧阴离子自由基清除-过氧阴离子清除-超氧阴离子自由基清除-超氧阴离子清除.docx

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1、改进的连苯三酚法：一种适用于所有抗氧化剂超氧自由基（.0Q清除试验（适用于SOD）【名词辨析】Of：该微粒既含有一个成单的电子，所以，可以属于自由基，又带一个单位负电荷，也属 于阴离子。所以，可以称为“超氧自由基”、“过氧自由基”、“过氧阴离子自由基”、“过氧阴 离子”、“超氧阴离子自由基”、“超氧阴离子”。SOD：过氧化物歧化酶，使过氧自由基发生岐化反响，而清除之。连苯三酚：有些文献也称为“邻苯三酚”。但邻苯三酚是不准确的名称。因为分子含有三个 取代基，应当称为“连二连第三酚结构工连第三酚结构工【操作示意图】37 37 A 325nmA 325nm操作示意图操作示意图的说明：最初的连苯三酚（

2、1,2,3-三羟基苯）法是专门为超氧化物歧化酶开发的， 现在广泛用于测最其他抗氧化剂的超氧化物清除。然而，强烈的pH影响被忽略了。在本研 究中，首次系统地研究了影响因素，大量实验证明pH值至关重要。由于主要抗氧化剂含有 拨酸、酯或内酯基团，pH 8.2应改为生理pH 7.4。改进的程序如下。将连苯三酚溶液（在1 M HCI中）与pH 7.4的Tris-HCI溶液充分混合；在37P下每隔30秒测量一次A325nm值，持 续5分钟。由于AA325nm，控制值反映基质一的初始浓度-，应妥善控制，以保证方法的准 确性。改进的连苯三酚法是一种可靠且廉价的超氧自由基清除试验，适用于所有类型的抗氧 化剂。用

3、石英比色皿，不能用玻璃比色皿，因为玻璃比色皿在325nm处有吸收。【详细介绍】有几种方法可以测定食品的超氧阴离子交换活性，包括细胞色素还原、硝基四氮理蓝 （NBT）、电子自旋共振（ESR）、化学发光、荧光和高效液相色谱。所有这些方法都需要特殊 且昂贵的仪器或生物试剂。连苯三酚（1,2,3-三羟基苯）自氧化法相对廉价。它最初由Marklund 专门为超氧化物歧化酹（SOD）而设计，而不是为其他抗氧化剂而设计。近几十年来，由于 其方便性，它还被用于测定其他抗氧化剂，如多酚、酚酸、单宁、黄酮、花青素、慈酿、多 糖，甚至各种营养添加剂和提取物。最常用的抗氧化剂（-COOH）,酯类。它们是敏感的碱性 溶

4、液。因此，在本研究中，原始连苯三酚法对此类抗氧化剂的适用性受到严重质疑。本文研 究了影响连苯三酚法的因素（尤其是pH值），然后描述了一种改进的方法。2 视图132个样品的结构式Tab. 1 pH 7.4和8.2之间34种选定抗氧化剂Qo值的比拟样品 No.资源刻画Tris-HCl缓冲液溶剂IC5O 值(N&mL)pH 7.4pH 8.21外源性，合成 的维牛.素类似物. 水溶性蒸镭水603.005.77a2416.6711.55b2外源性，天然维生素，内酯，酚，蒸储水7.26O.O6a11.63O.55h的水溶的3外源性， 天然的维生素，脂溶的蒸福水69.380.48aIO6.O43.87b4

5、外源性，合成 的酚，脂溶的，抗氧 化剂正丁醇饱和水2516.09135.56a794.78 17.51 b5外源性，合成 的酚，脂溶的，抗氧 化剂正丁醇饱和水8.77+0.39*5.53+0.80 b6外源性, 的天然酚，脂溶的，正丁醇饱和水150.81 31.33 a120.264.86b7外源性, 的天然酚.脂溶的，蒸储水33.332.50a30.351.26a8外源性.的天然酚，脂溶的蒸储水6.730.079a6.340.19;,9外源性, 的天然酚苯丙素蒸储水31.191.78a30.32+0.73 a10外源性, 的天然多酚， 脂溶的蒸储水1045.57139.801171.5751

6、.19h11外源性, 的天然多酚， 脂溶的族谣水46.450.42a25.990.63b12外源性, 的天然单宁， 脂溶的蒸谭水15.35+0.39a8.430.34b13外源性, 的天然酚酸，脂溶的蒸储水7.940.32 a2.320.75b14外源性, 的天然酚酸, 脂溶的蒸镭水309.5010.50a599.6931.77b15外源性, 的天然酚酸， 脂溶的蒸锚水372.221.99aI85l.l8235b16外源性, 的天然酚酸， 脂溶的蒸储水532.6929.46a267.41 7.73 b17外源性, 的天然酚酸， 脂溶的蒸福水12.l30.24a13.100.28b18外源性,

7、的天然酚酸脂， 脂溶的蒸谣水15.350.18a19.120.45b19外源性, 的天然酚酸, 脂溶的蒸懒水13.940.3la15.870.09h20外源性, 的天然酚酸，脂溶的蒸储水73.79 + 7.54 a83.93 12.46 b21外源性, 的天然酚酸， 脂溶的蒸馄水3.290.080a3.96+0.47 b22外源性, 的天然蕙酿, 脂溶的蒸僧水22.670.43a21.51O.llb23外源性, 的天然酿脂溶的蒸储水90.744.60u70.432.15b24外源性,天然蒸储水2I9.335.85;,123.462.96b的脂溶的25外源性,天然 的类黄酮， 脂溶的蒸储水28.

8、71 0.52a24.530.49h26外源性，天然 的类黄酮昔, 脂溶的蒸储水42.030.45a36.930.26b27外源性，天然 的酚，维生素，脂溶 的蒸饱水ll.O4O.I2a10.690.l6a28外源性，合成 的酚，脂溶的蒸饵水ll.931.20aI6.37().98b29Endogenous酚.脂溶的蒸储水712.37 19.60a2224.5 288.6 lb30Endogenous多肽水溶的蒸馈水33.31 1.84 ,42.171.34b31外源性，天然 的脂溶的正丁醉饱和水2l7.928.36aI71.174.27b32外源性，天然 的多糖, 水溶的蒸僧水9232.47

9、 1794.98aNDb33外源性，天然 的提取物， 脂溶的蒸馈水12.03 0.59a12.43 0.2 尹34内源性、天然 的超氧化物歧化酶蒸储水821.85 6.0531201.50 8.44b注：IJo值定义为50%超氧阴离子自由基抑制的浓度，通过线性回归分析计算，并点示为平均值土标准 差5=3）。本文使用Origin 6.0专业软件对线性回归进行了分析。同一行中不同上标的均值显著不同 （P0.05）,而相同上标的均值没有显著差异（p0.05）。ND：无法检测.连苯三酚可以在碱性溶液中自动氧化生成阴离子自由基Co2-）；复杂的机制可以简单地描 述如下：半醍可通过醍反响形成紫色。具有广泛

10、的F共胡很容易被分光光度计检测到， 因此吸光度反映了紫甘蓝和超氧阴离子COW）的生成-）.显然，较低的吸光度说明对.02的 抑制较高-.这是连苯三酚自氧化法的原理。紫红没食子酸最初由Marklund设计，专门用于SOD在早期研究中，选择420nm作为P2的监测波长- 一代然而，紫外光谱在pH 7.4和8.2证明325 nm比420nm更敏感（图2）。在本研究中， 325nm被认为是检测Q2浓度的最正确监测波长图2在不同反响时间（23.8 C）下连苯三酚自氧化的紫外光谱：（A）在pH 7.4下，连 苯三酚浓度为1.00 mM； （B） pH值为8.2时，连苯三酚浓度为0.20 mM.在325nm

11、的监测下，观察到.。2生成在初始阶段快速增加，在到达最大值后下降，然后达 到稳定状态。然而，在不同的pH值下，初始增加阶段从12分钟到7小时不等（图3A）。当 然，只有线性然2 0.99只增加适用于测定咱由基清除活性。在生理pH值为7.4时，线 性（R20.998）增加发生在0-30分钟,而在0分钟内发生-pH值为8.2时为8分钟（图3B）。 因此，生理pH值7.4比pH值8.2更合适和灵活，pH值8.2以前用于测定.02-自由基清除活 性。对温度影响的研究（见支持信息，表1）说明，连苯三酚自氧化的A A325nm值不同于、 27、37和47 J通常，在较低温度（17和27 C）下，连苯三酚自

12、氧化随温度升高而加 速，因此A A325nm值增加。然而，在更高的温度（37和47 C）下，温度升高会产生极端影 响：连苯三酚的自动氧化在最初儿秒钟内几乎完成。此外，高温导致的pKa值的固有变化可 能导致AA32Snm值的降低。因此， A325nm在37和47 C时降低。然而，生理温度F37 C 被认为是测定的最正确温度。在化学动力学中，反响速率总是随反响物浓度增加，但不一定是线性的。我们的数据（见 支持信息，表2）说明，两者之间存在线性相关关系（R=0.970）-0.999）,在A325nm值和连米 三酚浓度为0.077的反响时间之间-pH值8.2时为0.92 mM, pH值为7.4时。，线

13、性关系良好 （R=0.995-1.000）,在连苯三酚浓度范围内观察到-4.80亳米。这意味着在pH值为7.4时， 可以使用更宽的浓度范围进行测量。当然，实际连苯三酚浓度范围可以根据单个分光光度计 进行调整。 0.80.60.40.20.00 48 12 16 20 24 28 32的面/分钟图3.不同pH值（32 C）下0.20mM邻苯三酚自氧化动力学曲线为了定量分析pH值的影响，使用.02-在PH7.4和8.2下测量了 F33选择的抗氧化剂（包 括SOD）的放射性清除活性，并进行了比拟（见支持信息，表3）。表1中列出了活性比， 定义IC50/7.4/ICso,8.2o这些比率说明pH值为8

14、.2时的pH影响程度与pH值为7.4时的pH影响 程度相比。温度值越低，pH值的影响越大。高比值（g1或1）说明pH值为8.2的溶液中只 有微弱或没有pH值影响。1.61.41.21.00.80.60.40.20.024681012pKa值图4.3值和图值之间的相关图，以7.4/爆，8.2。绘制了 pKa值和比值的相关图（图4）。在此图的基础上，通过线性回归分析计算相关系 数（R值）。R值清楚地说明该比值与抗氧化剂的pKa值相关。换句话说，pH值的影响可归 因于抗氧化剂的酸性，并最终归因于酸性基团，如-COOH、酯、内酯和多酚类物质-OH组。 Trolox是一种标准抗氧化剂，就是一个典型的例子

15、。Trolox包含Y00H群，我们假设-COOH 可能会转换为-首席运营官-pH值为8.2的阴离子。负电荷可以给0提供一个电子-H。-通过 感应效应（+I）键，增强0-Ho-键。ArO均裂生成H.因此，H变得更加困难。H-O娘被+1 增强遮应侬奶您幺另一方面，据报道.02,可以通过“供氢（H）”方法清除。因此，提出的P2机制-Trolox清 除自由基的反响如下：ch3均裂 加-o.H/研号+ 2B H3C在这种情况下，生成的H较少导致抗氧化能力较弱,ch3J L-COO- + HO求因此我们发现其在pH 8.2时的ICso值显著高于pH 7.4时的ICso值（p1）。最后,必须强调的是，pH

16、8.2时SOD的图比pH 7.4时低得多（p清除能力计算为吸光度增量：.八325,控制组_ 凶325样品组）二 AA325,控制组 TT 广 T x A325nm，对照是没有样品的混合物在A325nm中的增量，而 A325nm，样品是有样品的混合 物；T=5分钟。值得一提的是：。（1）通常，我们用蒸储水来制备实验用奶昔。然而，在分 析中，一些脂溶性抗氧化剂（例如BHT、麝香草酚、姜黄素和B-胡萝卜素）不溶于水。在这 些情况下，我们使用正丁醇饱和水而不是蒸饰水来制备Tris-HQ溶液。（2）虽然生理温度 37 C被认为是最好的。对于无法保持该温度的实验室，测量温度为15-可以使用37。匚然 而，

17、当温度低于15P时，A325nm/T。（3）如果无法将测定温度严格控制在37。0那么可变 的室温将很容易影响热解反响。在持续数天的测量中，即使是相同体积的连苯三酚溶液也可 能产生不同的02-基质浓度。在这种情况下，我们可以适当调整连苯三酚溶液的体枳，以确 保系统可以产生相同的AA325nm，控制（即基质Q 一的相同初始浓度）-）.该程序保证了改进 方法的准确性和可靠性。这对于比拟测量尤其重要。当然，可以专门设计 A325nm阳MT的值 （通常为分钟-1），根据单个分光光度计。（4）连苯三酚储藏溶液在1 mM HCI 中在室温下保持稳定48小时。为了评估改进的连苯三酚方法的有效性，测量了线性、灵

18、敏度、精密度和再现性，以及原 始连苯三酚和NBT方法的线性、灵敏度、精密度和再现性。通过绘制三次分析的平均值和最终浓度来构建三种方法的线性图。我们的数据（见支持信息， 表4）说明，改进的方法比原法具有更高的R值。换句话说，其剂量响应优于原始连苯三酚 和NBT方法。使用6。值评估该方法的灵敏度。通过改进的连苯三酚法、原始连苯三酚法和NBT法，分 另IJ将毗咯烷酮的 Qo值计算为 603.005.772416.67 11.55 和 692.8888.98 U g/mL。因此， 改进的方法似乎比原始方法和NBT方法更敏感。这可能局部归因于使用了更灵敏的测定波 长 325nm。在我们的研究中，通过测量

19、相对标准偏差值（RSD, n=3）来估计该方法的精度。数据（支 持信息，文件4）说明，改进后的方法比原始方法更精确（p0.05）,满足生物分析测定的要 求（RSDclO%）。16原始方法的精度较低可能是由于测定波长（420 nm）和使用pH 8.2。由 于NBT方法基于测定福尔马松，福尔马松在缓冲液中溶解不好，A560nm读数可变，该方法 精度较低。然而，再现性代表了在数天内相同操作条件下的方法精度，并通过在3天内重复上述“精 密度测定”程序进行检查。改进方法中心值的RSD%为6.09%,而原始方法和NBT方法分 别为35.38%和14.72%。因此，与其他方法相比，改进后的方法重复性更好（p

20、0.05）o 总之，与原始方法和NBT方法相比，改进方法具有更高的线性、灵敏度、精密度和再现 性。改进后的方法只需要分光光度计、pH计、电天平和一些廉价的化学试剂。因此，它被 认为是一种可靠且廉价的超氧自由基清除试验，适用于所有类型的抗氧化剂（包括SOD本 身）。参考文献1 Li, X.C. Improved pyrogallol autoxidation method: a reliable and cheap superoxide-scavenging assay suitable for all antioxidants. J. Agric. Food Chern. 2012, 60, 6418-6424. doi: 10.1021/jf204970r