双路频分复用荧光共焦显微探测技术研究.docx

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1、双路频分复用荧光共焦显微探测技术研究基金项目：国家自然科学基金青年基金项目（批准号：60801041），上海市科技启明星项目（No.10QA1405100），教育部留学回国人员启动基金，上海理工大学研究生创新基金项目（JWCXSL1022）资助。作者简介：唐平玉（1984），男，在读硕士，主要从事信息光学及聚合物分散液晶等方面的研究。 E-meil:longhuitangjia.导师简介：郑继红（1975），女，副教授，博士，主要从事PDLC材料及电光器件，信息光学等方面的研究。E-meil:Jihongzheng.唐平玉 郑继红* 曹剑炜 张运波 蒋妍梦 黄爱琴 周增军 庄松林（上海理工大学

2、 光电信息与计算机工程学院，上海 200093）摘要 文章报道了结合频分复用技术来提高荧光共焦生物显微探测系统探测能力的实现原理和方法。通过对双路激发光信号的载频调制，将激发光聚焦到生物样品上产生荧光信号，再通过傅立叶变换、滤波和解调制过程，最后将两路荧光信号强度随时间变化曲线进行还原。实验搭建了紫外波段激励光源的双频复用荧光共焦显微成像系统，并成功探测到了老鼠神经海马细胞样品发出的双点荧光信号。频分复用共焦显微成像系统能够实现多通道，实时，快速探测生物细胞荧光信号，并具有较高的时间和空间分辨率，为对生物细胞特别是活体细胞的实时探测提供了一种高效的方法和手段。关键词 共焦显微；频分复用；荧光；

3、细胞探测中图分类号 Q336 Q438 OCIS 180.1790 120.0120 110.0110 110.0180 文献标识码 ATwo-channel Frequencies Division Multiplexed Fluorescence Confocal MicroscopyTang Pingyu, Zheng Jihong*, Cao Jianwei, Zhang Yunbo, Jiang Yanmeng, Huang Aiqing, Zhou Zengjun, Zhuang Songlin(School of Optical-electrical and Computer E

4、ngineering, University of Shanghai for Science and Technology, Shanghai, 200093, China)Abstract This paper presents a setup of confocal fluorescence microscopy system combined with frequencies division multiplexing so that the detection ability of the system is enhanced. In the frequency divided mul

5、tiplexed confocal fluorescence microscopy (FDMCFM) system proposed, fluorescence is excited on the sample (rat neural cell) by two beams of light modulated individually in two arms of the system. Fourier transform, filtration and demodulation are then carried out to restore the fluorescence intensit

6、y signal. The FDMCFM system is experimentally conducted, through which the target cells are detected successfully. The experimental results show that the FDMCFM system is convenient for both multiple-channels and real-time detection of biological cells fluorescence signal. Moreover, it maintains the

7、 high spatial and temporal resolution of confocal microscopy. These characteristics of the system make it an effective solution to the dynamic studies of living biological cells. Keywords confocal microscopy; frequency division multiplexing; fluorescence microscopy; cell detection1 引 言激光扫描共焦显微镜(Lase

8、r Scanning Confocal Microscope，LSCM)是随着光学、视频、计算机等技术的飞速发展而诞生的新一代显微镜，它在研究和分析活细胞结构、分子、离子的实时动态变化过程，组织和细胞的光学连续切片和三维结构重建等方面，是传统的光学显微镜所望尘莫及1-2。频分复用荧光共焦显微镜是把频分复用技术应用到荧光共焦显微镜中，采用对激发光信号的载频调制和对荧光信号的分频解调，实现对生物细胞的多点荧光实时快速探测3。该方法不同于现存的逐点扫描式荧光显微技术，而且不需要昂贵的光电倍增管的探测器阵列，是用来研究活细胞内部变化的有效工具。2 基本原理共焦显微术由Marvin Minsky提出并于

9、1957 年申请了载物台扫描共焦光学显微镜美国国家专利4。在此共焦成像系统中，采用点光源照明样品，并用探测器之前的与光源成共轭关系的孔径来滤去焦外信号，然后利用横向和轴向扫描技术获得整个样品的三维信息，获得了高分辨三维图像。自此以后，共焦显微成像得到人们广泛的关注，新型的共焦成像技术不断涌现。1984年出现了第一台激光扫描共焦显微镜实用产品，真正实现了三维立体成像；1990年美国康奈尔大学的Denk等人提出将双光子激发现象应用到激光扫描共焦显微镜中，产生了双光子激光扫描显微镜5。1992年澳大利亚悉尼实验室的Tim Dabbs和Monty Glass使用单模光纤进行光束传输设计出了反射光纤共焦

10、显微镜6。在过去的十几年里又出现了多种类型的共焦显微镜，例如三维数字共焦拉曼显微镜7、光谱编码共焦显微镜8、光纤耦合多路复用共焦显微镜9以及使用光子晶体光纤产生的超白光作激励光源的彩色共焦显微镜10。这些显微镜的分辨率和反应速度相比之前的显微镜都有很大的提高和改善。近年来，国内在显微术领域也有了一定发展，2009年合肥工大余卿等人提出基于中心扩散法和光强重组法的激光并行共焦显微系统1112，2010年西安工大李恒等人提出基于微透镜阵列和振镜扫描的光谱分辨多焦点多光子显微技术13，这些新技术对提高显微系统探测精度、分辨率和反应速度等都有不少贡献。频分复用荧光共焦显微镜是2006年由美国宾夕法尼亚

11、州州立大学电子工程系Shizhuo Yin教授课题组提出的一种新型的显微镜，基本思想就是将通信原理中的频分复用技术运用到显微测量领域，实现快速多信道测量的目的14。该技术实现了多通道无扫描多点同时探测，能够实时观察生物活细胞的瞬间动态变化。频分复用技术，通常是将用于传输信道的总带宽划分成若干个子信道，每一个子信道传输一路信号，并以并行的方式工作。在荧光共焦显微镜中使用频分复用技术，其基本原理是：将一束激光分为多路，然后这些光束通过光斩波器被调制不同的载波频率（为了在解调的时候能够轻易的将这多路荧光信号区分开，防止多路信号相互重叠，两个相邻信号的载波频率及它们的差必须要大于或等于荧光信号最高频率

12、的两倍，即满足抽样定理）。这样多点激光聚焦在生物样品产生多点荧光，所反射的荧光也具有相应的调制频率，再将反射荧光信号收集输入单像素高敏感光电倍增管，通过傅立叶变换实现荧光信号的解调制，从而区分各点的荧光发射情况。整个过程类似于调频收音机的调制解调。该方法能够有效克服荧光显微镜不能同时多点读取信息的问题。同时还能保持甚至提高荧光显微镜的空间和时间分辨率。根据抽样定理，各信道的时间分辨率主要取决于被调制信号频率的频率，其极限值取决于荧光信号本身的寿命和光电倍增管的反应时间，最快可能达到纳秒的分辨量级。3 实验系统最简单的双光路复用荧光共焦实验系统光路图如图1所示。首先，激发激光通过扩束准直后通过非

13、偏分光棱镜BS1分成两束，每束分别以不同的斩波频率斩波，再用合光棱镜BS2合光后进入二向色镜组，激发激光单方向经过物镜会聚于样品两点，产生双点荧光, 然后再次被物镜收集，并从二向色镜组出射，进入分光棱镜BS3，其中一束经过成像透镜将生物细胞成像于CCD接收，另外一束经过共焦小孔(本实验用单模光纤代替共焦小孔)后被光电倍增管（PMT）接收，然后经过模数转换后，信号经数据采集卡后输入电脑并采集和处理数据，解调单路荧光信号强度变化。在该系统中，光电倍增管检测到的实际强度是两个荧光点所发出的荧光光照强度之和，假设荧光光照强度作为时间函数的两个点分别为为和。通过调制后单路荧光光照强度分别为和。这样光电倍

14、增管检测的强度信号可以被记作为 (1) 信号对应在频域上可表示为。光电倍增管输出的信号经模数转换器，模拟电子信号就被转换为数字信号，被传送到数据采集卡上，数据采集板输出的数字信号被输入电脑，电脑程序对采集到的检测信号进行傅立叶变换，并在频域上使用带通滤波器很容易就把这两路信号分开，最后再通过余弦函数解调制，还原出两点没有被调制的荧光信号。总之，频分复用荧光共焦显微镜是通过对激光光源进行分光调制，然后再对收集到的荧光进行解调来实现对样品的观察和发出荧光的测量，实现并行高速探测。BS3Imaging LensPMTSpecimenDichromatic MirrorObjective Lens L

15、aserBS1BS2Optical ChoppersM1M2CCDPCA/D图1 双路频分复用荧光共焦显微成像光路图Fig.1 Optical system of Frequency Division Multiplexed Confocal Fluorescence MicroscopyFiber coupler PMTBS3LensTriangle prismFiber coupler图2 FDMCF系统光纤耦合共焦实现光路图Fig.2 Confocal section of Frequency Division Multiplexed Confocal Fluorescence Micr

16、oscopy在我们的实验系统中，激发光光源采用了UV波段的405nm的半导体准直激光器（Dream laser 公司提供，功率为20mw），样品是老鼠神经海马细胞切片。激发激光经过准直扩束后产生直径为10mm平行光束，然后经过局部马赫增德光路，在光路的两臂中加入双通道斩波器（南京大学微弱信号公司生产的ND-4型可变频率双参考光斩波器），对激光分别调制到不同的载波频率，记作和，两路频率存在5倍关系，即。在马赫增德光路中，通过调节两个反射镜M1和M2的微小角度变化，调节两束激发光束的夹角，从而控制样品表面所聚焦的双点荧光之间的距离。双路激发激光信号通过UV波段二向色镜组（激发激光为紫外到紫光光源，

17、滤出荧光为520nm540nm的绿色荧光），激发激光再通过显微物镜汇聚到生物样品上形成双点荧光。所选用的是40倍无限远物镜，N.A0.65（二向色镜组和无限远物镜均由上海长方光学仪器有限公司提供）。样品所发出的绿色荧光一部分经过成像物镜后所成的像被黑白CCD或者彩色CMOS摄像接收（由大恒公司提供）另外一部分荧光被高敏感光电倍增管接收（光电倍增管是北京滨松光子生产型号CR186，波长范围位于300nm650nm，峰值波长为420nm）。荧光信号从BS3棱镜分光后在进入PMT探测之前，通过了光纤耦合共焦部分，光学系统结构如图2所示。由于聚焦到样品上的荧光两点之间距离很小（在微米量级），出射双路荧

18、光首先经过长焦距300mm的傅立叶消色差透镜聚焦，在透镜的频谱面上两聚焦荧光点距离分离至1mm3mm，然后采用三角光楔棱镜（直角棱镜）将两荧光信号彻底分开（两束光分开的角度约为65），再分别通过光纤耦合器。耦合器采用40倍聚焦透镜聚焦荧光信号后输入单模光纤，然后将光纤出射端双路信号直接送入PMT探测。在实验中光纤的直径只有25微米左右，相当于小孔的共焦作用。PMT探测后的信号通过数据采集卡完成模数转换（北京阿尔泰科技公司提供的USB2816），再将数据传送到Matlab软件进行滤波和还原。4 结果与讨论 在成像观察部分，由于采用了无限远物镜，平行的荧光光束经过成像透镜聚焦在焦距附近，因此摄像头

19、在成像透镜的焦距附近调节，得到清晰的成像图片。通过对成年老鼠神经细胞样品的成像观察，可以得到不同倍率情况下的细胞成像图3。图片中，老鼠海马细胞的轮廓清晰可辨，根据常用的分辨率公式，横向分辨率表示为： (2)其中，为所激发出的荧光的波长，NA表示显微物镜的数值孔径。样品所激发出的荧光中心波长为530nm，显微物镜的数值孔径NA为0.65，则横向分辨率为。40倍无限远显微物镜的焦距约为3.3mm，光学系统的放大倍率为所采用的成像透镜的焦距同显微物镜焦距的比值，再经过CCD成像系统的接收平面的放大可以得到更大的放大倍率。因而，采用相同的CCD采集器件，成像透镜焦距越大则系统放大倍率越高。图3（a）和

20、（b）采用焦距为250mm，通光孔径40mm的透镜拍摄。 图3（c）采用焦距为100mm，通光孔径为25.4mm的成像透镜拍摄。图3（d）采用焦距为120mm，通光孔径为70mm的大数值孔径（N.A.=0.583）成像透镜，具备更强大的荧光聚集能力，图3（d）中可以看到箭头所标识的两个明显成像聚焦点。10myx(a) F=250mm, 40mm10myx(b)F=250mm, 40mmyx25m(c) F=100mm, 25.4mmyx (d) F=120mm, 70mm40mm20m(a)(c)(d)(b)图3 采用不同成像物镜拍摄的老鼠神经细胞显微图Fig. 3 Rat neural ce

21、ll pictures taken by FDMCF system with different imaging lens对于共焦探测部分，其横向分辨率同上述描述一致，轴向分辨率用公式表示为： (2) 这里为所激发出的荧光的波长，NA表示显微物镜的数值孔径。样品所激发出的荧光中心波长为530nm，为所探测样品的有效折射率，这里考虑到70的生物细胞成分是水分子，因此取值为1.3。显微物镜的数值孔径NA为0.65，则系统的轴向分辨率可以表示为向分辨率为。 用该系统实现对两路荧光信号分别以某一载波频率调制后，对生物样品实现双点荧光探测功能。实验中采用了198Hz和990HZ调频信号为例。PMT采集到

22、的应为两路调频信号的叠加。图3是双路调频荧光信号的模拟和实验结果图。图3（a）是利用Matlab软件作出的模拟的198Hz和990Hz的正弦和频信号，图3（b）是PMT实际测量的荧光强度图。通过比较可以看到，由于机械振动和PMT等噪音信号，实际探测的荧光强度变化与理想强度形状基本一致，只是略有不同。然后对所采集的双路荧光信号进行傅立叶变换，得到频率域的频谱分布如图5（a）所示。从图中可见，198Hz和990Hz的频谱信号明显，在198Hz的三倍频600Hz左右的位置可见其倍频信号，在其它频谱位置可见一些干扰信号的频谱信号。将采集到的双路荧光信号进行滤波后在滤波后再进行傅立叶变换，得到频率域的频

23、谱分布如图5（b）。从图中可见，频谱信号在去除噪声后更加明显。经过对所需要频率信号的挑选滤波，然后做反傅立叶变换，得到198Hz和990Hz调频位置处的双点荧光强度随时间变化曲线如图6所示。上面一根蓝色曲线是调制频率为198Hz的荧光信号解调的结果，下面一根红色曲线为调制频率为990Hz的荧光信号的强度波形。从图中可见两条荧光变化曲线幅度不同，但是两点荧光信号强度变化很小。事实上，荧光强度与细胞中激发光聚焦点所在位置的某种蛋白质浓度有关。在激发激光能量相同和共焦光纤耦合效率相同的情况下，不同的荧光细胞，甚至同一细胞不同位置，只要该种荧光蛋白质浓度存在差异，就会产生荧光强度的不同。假设FDMCF

24、系统中分光棱镜是严格等幅度分光的，则图6反应出198Hz荧光点处荧光蛋白浓度比990Hz聚焦点处稍高。另外，老鼠神经细胞样品是死细胞，198Hz和990Hz两条曲线所反应出来荧光强度变化都只出现了小幅度起伏，但整体强度变化趋势平缓，这符合荧光变化的实际。如果是活细胞实验，例如探测老鼠心肌细胞内的Ca离子浓度随时间的变化，多点探测将反应出细胞上各个地方荧光点强度的变化，因此探测将更加有意义。(a)(b)图4 (a) 对PMT采集信号的模拟 (b) 实际采集的信号Fig.4 (a) Simulation of signals collected by PMT (b) Signals collect

25、ed in experiment图5(a)采集信号的傅立叶变换频谱图（198Hz和990Hz）；(b)采集信号经滤波后的傅立叶变换频图（198Hz和990Hz）Fig. 5(a) Detected signals in Frequency Domain (198Hz and 990Hz); (b) Filtered signals in Frequency Domain (198Hz and 990Hz)(a)(b)图6 解调后的双点荧光图谱Fig.6 Demodulated curves of Fluorescence intensity vs. time 总之，双路FDMCF实验系统不仅拍

26、摄了老鼠神经海马细胞的荧光显微图片，同时还将样品上聚焦两点位置处的荧光能量量化指标随时间的变化用曲线体现出来。图3拍摄了不同形态的海马细胞，反应了不同形态的细胞核形貌，如锥形的，圆球型的，叠加在一起的，弥散分开的等等。而图6则是调制解调得到的两根曲线，分别代表198HZ和990HZ加载频率的双点所发出的荧光强度随时间变化曲线。根据抽样定理，实验系统中单个信道的时间分辨率为分别为10.1ms和2.0ms。5 结论及探讨频分复用荧光共焦显微镜结合了频分复用技术的优势，能实现多信道并行探测，有效提高荧光共焦显微系统的工作效率。但是，在目前最简单的双通道的实验系统中，仍然存在一些可以改进的地方。例如，

27、显微物镜采用提高数值孔径, N.A.最大可以达到1.4左右，可以有效提高分辨率；将由棱镜分光改成光纤分光和光纤集光可以更轻松实现多路分光，有利于荧光信号的收集和处理，并有利于系统的小型化和集成化。对于多光束激发激光的频率调制如果采用电控调频代替机械式光斩波，将有利于提高调制和控制的精度。总之，频分复用荧光共焦显微成像技术有望为荧光细胞特别是活体细胞的实时探测提供一种高效的方法和手段。参考文献1. Paul Davidovits，M.David EggerScanning Laser MicroscopeJNature ，1969，223：831.2. Pawley, J. Handbook o

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