乳品抗生素残留的免疫学快速检测技术及研究进展.docx

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1、目录摘要1关键词1Abstract1Keyword2前言21、乳品中抗生素残留的原因32、乳品中抗生素残留的危害43、抗生素残留现状44、抗生素残留的主要检测方法54.1微生物检测法54.2理化检测方法54.3免疫法65、免疫学快速检测方法65.1 放射免疫法65.2 酶联免疫吸附法75.3酶联免疫受体法75.5胶体金免疫层析法76、新型免疫学快速检测方法86.1 免疫传感器86.2蛋白芯片96.3表面等离子体共振96.4快速检测试纸条97、结束语108、参考文献119、致谢13摘要：近年来，随着食品工业的不断进步，各类食品层出不穷。但食品安全问题却频频发生，特别是乳品抗生素残留问题，引起了广

2、大消费者的热切关注。如何快速检测乳品中抗生素，降低抗生素残留，消除抗生素对消费者带来的健康威胁，成为乳品企业关注的焦点问题。因此，我们要尽快开发或引进先进的抗生素检测方法，从源头杜绝抗生素，保障乳品的安全。本文归纳了抗生素残留的原因及危害，详细的介绍了有关乳品抗生素残留免疫学快速检测方法，对乳品抗生素残留的前景进行了展望。关键词：乳品 抗生素残留 免疫学 快速检测方法Abstract: In recent years, along with the advance of the food industry, all kinds of food. But food safety problems

3、 occur frequently, especially the milk antibiotic residues, caused the earnest attention of consumers. How to quickly detecting antibiotics in milk, reduce antibiotic residues, eliminating antibiotic threat to the health of consumers, become the focus of the dairy companies. Therefore, we should dev

4、elop as soon as possible or the introduction of advanced detection method of antibiotics, antibiotic and eradicate the source, to ensure the safety of dairy products. This paper summarizes the reasons and harms of the antibiotic residues, detailed introduces the related rapid immunological milk anti

5、biotic residues detection method, the prospects of antibiotic residues in milk productsKeyword：The dairy Antibiotic residues immunology Rapid detection methods前言随着经济的发展，人民生活水平的提高，乳品在人们膳食结构中所占的地位越来越重要，人均占有量已达到21.7 kg1。乳品营养素种类齐全，除含有全部的必需氨基酸和丰富的蛋白质外，还含有部分重要的维生素和必需的微量元素，易被人体吸收。其含有的活性物质能提高人体的免疫力、增强人体体质，被

6、公认为大自然赐予人类最理想、最接近于母乳的完美天然食品在我国，随着乳制品工业的迅速发展，畜牧业也发展迅猛，-内酰胺类、氨基糖苷类、四环素类、大环内酯类、氯霉素类、磺胺二甲基嘧啶等抗生素在乳畜饲养业中作为饲料添加剂和动物药物在预防和治疗动物疾病方面的广泛应用，造成乳品中抗生素的残留，给消费者健康带来了威胁， 特别是近年来出现的一系列乳品安全问题，严重打击了消费者对乳品的信心，抗生素残留则是乳品安全问题中较为突出的一个，已成为公众关注的焦点。2 因此，寻求快速、安全的抗生素残留检测技术成为我国关注的焦点问题。1、乳品中抗生素残留的原因 我国的奶牛饲养主要以自营牛场模式为主，农户饲养奶牛管理意识低下

7、以及经济条件所限，造成奶源质量低、污染物残留量高，同时，兽药管理不严格，使得奶牛乳房炎和其它感染性疾病都明显高于发达国家，因此我国的乳品的抗生素残留问题就格外严重。乳品中抗生素的来源最终要追寻到原料生产及其流通过程。其中造成乳品中抗生素残留的原因有：美国食品和药品管理局（FDA）调查结果表明，对泌乳期奶牛用药不当是造成乳中抗生素残留的重要原因。3违反国家规定，长期小剂量添加抗生素到饲料中。此类抗生素在动物体内需要一段时间才能完全排除体外，极易在动物体内蓄积，因此造成抗生素残留。给患病奶牛使用过的挤奶工具和贮奶设备，未经彻底清洗和消毒就用于其他健康牛只，造成牛奶中抗生素的交叉污染。个别饲养户和经

8、营商, 为了防止牛奶酸败变质而非法在其中掺入抗生素, 以使牛奶通过验收而保证其经济利益。利用抗生素治疗乳牛临床型、隐性型乳房炎和子宫内膜炎，其中乳管注药法就是让药物直接注入乳房，通过乳腺管进入某个已感染区进行消炎，乳牛在接受这种治疗后，乳中的药物残留期可延缓到停药35d后。42、乳品中抗生素残留的危害虽然抗生素对人类疾病的预防和治疗以及兽医临床中发挥了巨大的作用，但长期饮用残留有抗生素的乳品，可造成药物积累，当其达到一定浓度后，就会对人体产生毒副作用。抗生素对人体会产生以下毒副作用：长期饮用含有抗生素乳品的人易产生耐药性，一旦患者再使用同种抗生素治疗将很难奏效。若消费者长期饮用含有抗生素的乳品

9、，等于长期服用小剂量的抗生素。对抗生素有过敏体质的人服用残留有抗生素的牛乳后,会发生过敏反应。正常人体内寄生着大量菌群，如果长期饮用含有抗生素的乳品，极易导致微生物平衡破坏，人与动物易发感染性疾病。其他危害有，链霉素可引起肾损害和听力神经受损，四环素引起肝损害，氯霉素残留会对人造成致命后果，引起再生障碍性贫血等；5一些性质稳定的抗生素被排泄到环境中会造成环境污染，破坏生态平衡。 抗生素可严重影响干酪、黄油、发酵乳的起酵和后期风味的形成。6抗生素的残留会导致乳品品质降低，降低产量和质量，给生产者带来巨大的经济损失。3、抗生素残留现状一项对我国几个大城市如西宁、南宁、广州、杭州、泉州、北京等城市乳

10、制品质量的检测调查结果显示，在近八百份乳品采样中，抗生素残留超标居不合格项目第一位。7从超标的情况看，超标率达 10%以上的药物有10 种，超标率达 20%以上的药物有 8 种。乳品中残留的抗生素主要为青霉素类药物和磺胺类药物，其中CEPA 和 PEN-V 残留最为严重，检出率达35%以上。 其次是 A 肝、PEN-G、CIF、SD 和 SMZ，检出率达20%以上。8我国过去对乳品中抗生素残留卫生指标无明文规定，直到2001 年 10 月，农业部发布实施了无公害食品生鲜牛乳行业标准，对新食品安全鲜牛乳的卫生指标明确了抗生素不得检出。9 但对于这一行业标准，我国目前并没有严格执行，致使乳品中抗生

11、素残留问题一直未能得到解决，以致引起人们对乳品安全问题的担忧，并成为越来越受关注的焦点。从以上情况可以看出，我国乳品中抗生素残留现状并不乐观，有关部门应加强对乳品生产的管理，并对乳品中的抗生素等药物残留进行检测和监控，以保证人们饮用乳品的卫生和安全。4、抗生素残留的主要检测方法目前，国内外用于检测乳及乳制品中残留抗生素的方法很多，按照检测原理和使用的仪器可分为：微生物检测法，理化检测法和免疫检测法等。104.1微生物检测法微生物检测法是较为广泛应用的最经典方法，测定原理是根据抗生素对微生物的生理机能、代谢的抑制作用, 对样品中抗生素残留进行定性或定量检测。其优点是操作简单，可靠，费用低，无需高

12、级实验设备，一般实验室及养殖场都能使用。因为牵涉到微生物的培养，所以检测时间相对较长，不能实现定量检测，不能满足某些抗生素最低限的检测。微生物检测法主要有TTC 法（氯化三苯基四唑氮法）、BSDA 法（嗜热脂肪芽孢杆菌纸片法）、PD 法 （纸片法） 及 STOP法（拭子法）等114.2理化检测方法理化检测方法是根据抗生素分子理化性质对其进行分离和检测的方法，如色谱法、荧光法、毛细管电泳、色谱质谱联用技术等，理化检测方法分离速度快、效率高和自动化程度高，能检测抗生素的具体含量，敏感性较高，结果准确，但待检样品需经一系列的预处理，繁琐费时，还必须有相应的价格昂贵的仪器设备。一般在大型实验室使用，适

13、合于精确测定。4.3免疫法免疫分析法的基本原理是以抗原或半抗原和抗体特异性结合为抗原抗体复合物的免疫反应为基础的生化测试技术。这种检测方法可以具体分析是哪种抗生素，因为抗体除了可以针对某类抗生素所共有的结构产生特异抗体外，也可以针对共有结构上的不同修饰基团 （即不抗生素） 而产生特异性抗体。免疫分析技术最突出的优点是操作简单、速度快、分析成本低。另外，有些抗生素，如磺胺类抗生素由于采用微生物检测方法缺乏灵敏度和特异性，所以只有用免疫法才能实现对其快速检测。125、免疫学快速检测方法免疫学快速检测是基于抗原-抗体特异性反应的检测方法。其分类方法不一而足,一般可分为放射免疫分析、酶免疫分析、荧光免

14、疫分析、发光免疫分析、胶体金免疫分析、仪器免疫分析和无标记免疫分析等。1959年建立的放射免疫分析被认为是免疫分析的建立标志13,并获得了1977年的诺贝尔生理学或医学奖。5.1 放射免疫法（RIA）放射免疫法是一种应用放射性同位素的敏感性和抗原抗体反应的特异性结合而成的体外微量分析方法。RIA 法的优点是灵敏、特异、简便易行、用样量少等，常可测至 pmol。缺点是使用放射性物质有一定污染，但由于只是在测试样品时才加入标记的同位素示踪物，且示踪物的放射性强度极低，因此一般不会对试验者造成辐射损伤。该方法特异性强，且与其他多种抗生素均无交叉反应。因此，该法能达到牛奶中四环素类抗生素残留的检测要求

15、。5.2 酶联免疫吸附法（ELISA）ELISA 法是将待测目标物通过固定的抗体或抗原的特异性捕捉而结合于固相支持物表面，再将酶标记的抗体或抗原与之反应，利用酶在液相反应中催化底物显色来达到测定待测目标物含量的目的。最常用的标记酶为辣根过氧化物酶和碱性磷酸酶。ELISA 方法把抗原抗体免疫反应的特异性和酶的高效催化作用有机地结合起来，目标物既可是抗原，也可是抗体。虽然 ELISA 法是目前研究较多的抗生素筛选检测方法，具有敏感性高，特异性强，检测量大，无需复杂的样品前处理等优点。但也存在一些问题，如因其载体的材质和包被技术的局限，在其包被载体孔内（一般为 96 孔酶标板），需要大剂量的抗原或抗

16、体，才能达到良好的包被效果 ；且对显色时间要求较高，结果只能一次性判读等。14ELISA 试剂盒是日前奶牛场和牛奶公司使用最广泛 、快速、灵敏的检测青霉素类抗生素残留的方法。5.3酶联免疫受体法（ELRA）免疫受体法是目前国际法规认可的一类专利检测法。免疫受体检测法是酶联免疫分析（ELISA）的一个变换形式，基本原理是将特定抗生素类作为靶子，让固定在一定基质上的受体捕捉。大多数检测法利用竞争性原理，使样品内的抗生素与内置抗生素标志物竞争结合受体，然后进行冲洗和显色。该方法的检测限和灵敏度均与 ELISA 方法相当。5.4 荧光免疫法（FIA）荧光免疫法是一种利用抗体标记的荧光素在特定激发波长下

17、发出的荧光来进行检测抗原抗体结合信号的技术。该方法的优点是信号特异性好、灵敏度高、线性范围宽、操作简便 ；不足是扫描设备价格比较昂贵，难以进行普及应用。该法的优点是可以快速同时测定 18 种不同的磺胺类抗生素，可用于样品的初筛试验。缺点是在实际样品测定时，加样回收率偏低，且部分样品中的精密度偏差。5.5胶体金免疫层析法胶体金免疫层析试验的原理是采用柠檬酸三钠还原HAuCl4聚合成金颗粒,由于金颗粒之间的静电作用和布朗运动,使其保持水溶胶状态,胶体金富含电子和强大的给电子能力。在胶体溶液pH8.2条件下,胶体金以非共价键与兽药小分子抗体结合形成金标抗体(Ab-Au),将金标抗吸附于玻璃纤维棉上,

18、一端与固定有兽药小分子蛋白质偶连物(检测线)和二抗(质控线)的硝酸纤维素膜(NC)膜相连,另一端与样品垫相连。而后连同其他所需的吸水纤维、支撑材料、覆盖材料等按照设计工艺进行制作和组装,制成快速检测试纸。检测样品中不含兽药小分子,金标抗体就会与兽药小分子蛋白质偶连物反应而被部分截获,金颗粒富积而出现明显直观的红色条带,未完全结合的金标抗体至质控线时同样会出现红色条带;检测样品中含有兽药小分子,兽药小分子与兽药小分子蛋白质偶连物竞争性结合金标抗体,检测线不出现或出现很弱的红色条带。快速检测试纸检测小分子物质残留,检测时间仅需数分钟。胶体金快速诊断技术凭借其方便快捷、灵敏度高、稳定性强等特点，在兽

19、药残留检测领域中被迅速推广，是牛奶抗生素检测商业化应用较广泛的一种检测方法。胶体金免疫层析技术是近些年发展起来的一项新型的检测、 诊断技术， 属于根据免疫反应原理开发的检测手段中的一种。 但与其他免疫分析法不同的是， 其他多数的免疫检测方法往往需要昂贵的分析设备和仪器， 并且要配备专业人员操作检测。 虽然这些检测方法具有很高的灵敏度和特异性， 但却因为检测设备价格昂贵、 操作复杂、 专业性强等原因， 而无法满足现场大规模检测的需求。 而胶体金免疫层析分析技术除了采用免疫反应原理外， 还结合了色谱层析的优点， 有效突破了上述其他免疫检测方法的不足， 具有快速、 灵敏、 简单、 方便等特点。6、新

20、型免疫学快速检测方法6.1 免疫传感器免疫传感器是生物传感器的一种，近年来已取得迅速发展15-17。传感器的生物敏感层与复杂样品中特定的目标分析物之间通过抗体与抗原之间的识别反应，产生一些物理化学信号的变化，这些变化通过不同原理的传感器转换成第二信号（电信号），经放大后显示或记录。利用兽药与特异性抗体结合反应特性研制出的免疫传感器，检测灵敏，携带方便，可用于相应兽药的快速定性定量检测。6.2蛋白芯片蛋白质芯片又称蛋白质微阵列（protein microar-ray）是在基因芯片之后发展起来的，其原理是在固相支持物表面高密度排列蛋白质探针，可特异地捕获样品中分子，然后用 CCD 相机或激光扫描系

21、统获取信息，最后用计算机进行定性定量分析。该方法在检测牛奶中抗生素残留上有潜在的巨大作用，可以实现样品用量少，无需样品前处理，高通量，快速检测的目的。6.3表面等离子体共振（SPR）表面等离子体共振（SPR）是一种物理光学现象。SPR 对金属表面电介质的折射率非常敏感，不同电介质其表面等离子体共振角不同，同种电介质，其附着在金属表面的物质的量不同，则 SPR 的响应强度不同。基于这种原理的生物传感器通常将一种具特异识别属性的分子即配体固定于金属膜表面，监控溶液中的被分析物与该配体的结合过程。在复合物形成或解离过程中，金属膜表面溶液的折射率发生变化，随即被 SPR 生物传感器检测出来。该方法优点

22、是无需对样品进行标记处理，可真正实现无标记，在线检测。6.4快速检测试纸条日前，一项新型食品安全快速检测技术乳制品及畜禽组织中关键抗生素残留快速检测卡问世，让消费者面对乳、畜禽制品等食品的时候能更加放心。该项目填补了国内多种类抗生素类药物同时检测的技术空白，总体达到国际先进水平。18据介绍，该项目是通过应用单克隆抗体技术和胶体金免疫层析技术自主开发出了-内酰胺类&四环素类抗生素快速检测试纸条、-内酰胺酶快速检测试纸条、氟喹诺酮类快速检测试纸条和磺胺类快速检测试纸条共四项技术成果。科研人员表示，该项成果的创造性在于：采用特异性的抗原抗体反应与免疫层析分析技术相结合，大大提高了检测方法的特异性。-

23、内酰胺类&四环素类试纸条产品的开发，满足了市场上对头孢类、青霉素类和四环素类同时检测的需求，实现了一卡对多类药物的检测，使产品检测能力从原来的只能检测单一药物到检测一类药物，一直发展到现在的可以同时检测几类药物。此外，该成果检测牛奶样品的试纸条全部采用裸条进行检测，并配有微孔条，不同于传统的胶体金试纸条。由于微孔条的孔面积比较大，微孔中的金标抗体试剂与被检测的牛奶样品能够充分反应，能明显提高对样本检测的灵敏度。该项成果已通过国家食品质量监督检验中心、中国检科院综合检测中心、北京市兽药监察所、北京出入境检验检疫局以及北京市理化分析测试中心等检测机构复核验证。其实际样本检测后采用仪器方法进行确证，

24、阳性符合率为 100%。7、结束语乳品中抗生素残留是涉及人类健康的公共卫生问题。 为了保障人们的身体健康，增强我国乳制品的国际竞争力。首先，我们要重视和加强检测工作，研发快速、便携、简单和经济的并能对多种抗生素残留进行检测的分析技术，以提高国产试剂盒的研制能力19，其次，要修订、制订乳制品标准，在将抗生素的检测纳入国标体系的基础上，进一步与国际标准接轨，在防控奶制品抗生素残留过程中，食品安全监督关口同样要严把商品准入市场关，严格食品质量报备制度，20杜绝不符合标准的奶流入市场，提高我国奶品的质量，符合WTO的质量技术要求，促进我国奶业向国际化方向发展。寄希望于通过对牛奶中抗生素残留的检测而保证

25、乳制品的安全只是“治标”，应从抗生素残留产生的源头加以控制，从而实现对牛奶中抗生素残留的“标本兼治”。 可从以下几个方面着手。 发展高效、低残留的动物专用饲用抗生素是大势所趋。研发替代抗生素的绿色饲料添加剂，如寡糖、微生态制剂、中草药制剂。在乳制品生产中应用危害分析与关键控制点（HACCP）技术。HACCP 体系是用来保证产品在整个生产过程中免受可能产生的生物、化学、物理因素的危害，主要控制目标是产品的安全性， 由对最终产品的检验转化为控制生产环节中潜在的危害，从而保证产品的安全性。8、参考文献1骆承庠.我国液态奶现状和存在的问题G.第三届中国乳业大会论文集，2006(3): 9-10.2 V

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31、, 51（3）: 587-593 18 魏云霞. 乳制品抗生素残留实现快速检测J. 中国食品安全报,2011(7)A-0419 沈永聪，李守军，杨林.牛奶中抗生素残留检测技术进展J.畜牧兽医科技信息，2006（5）：87-89.20 WU C C, LIN C H, WANG W S.Development of an enrofloxacin immunosensor based on label -free electrochemical impedance spectroscopyJ.Talanta,2009,79(1):62-679、致谢经过几个月的忙碌，本次毕业论文已经接近尾声，作为一名专科生，由于缺乏经验，难免有许多考虑不周全的地方。这次论文的顺利完成，首先要感谢我的论文指导老师岳峰，是他的悉心指导与帮助才能让我顺利的完成本文。期间，岳老师给我提出很多建议，让我能集思广益。老师渊博的知识及谦逊宽厚的处事态度必让我受益终生。另外，要感谢大学三年传授给我知识的老师们，是他们的教育让我懂得很多最终写下本文，最后感谢学校给我们提供的资源，让我可以参考。 最后，感谢我的同学们三年来对我的帮助，感谢我的亲人对我的支持。在此论文完成之际，谨向所有关心我支持我的老师、同学和亲人表示我最诚挚的感谢！