WB实验步骤(6页).doc

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1、-蛋白电泳（制胶、SDS-PAGE电泳）实验材料：SDS-PAGE凝胶制备试剂盒、电泳缓冲液、提取的蛋白或全细胞裂解液、广谱彩虹预染中分子量蛋白Marker、SDS-PAGE Loading Buffer（还原，5）、G250蛋白快速染色试剂、若干蒸馏水实验仪器、耗材：蛋白电泳仪、制胶仪、水平摇床、15ml离心管、5ml移液器、微量移液器、1.5ml离心管、塑料饭盒（可在微波炉里加热使用）配制溶液：l 配制10%APS溶液：-20度保存0.5g APS + 5ml蒸馏水、2.5g APS + 25ml蒸馏水 l 配制200 ml电泳缓冲液：CW0045 Tris-Glycine SDS（ph8

2、.3,10）20 ml Tris-Glycine SDS + 180 ml 蒸馏水l 配制1 ml loading buffer：200 ul 5loading buffer +800 ul蒸馏水实验步骤：一制胶：1. 参照凝胶模具说明书，装配好凝胶模具。2. 根据分离蛋白的大小配制分离胶和浓缩胶。SDS-PAGE分离胶的浓度与最佳分离范围SDS-PAGE分离胶浓度最佳分离范围6%胶50-150kD8%胶30-90kD10%胶20-80kD12%胶12-60kD15%胶10-40kD 3. 配制10%分离胶：将不同体积的30%Acr-Bis(29:1)、分离胶缓冲液和双蒸水在小烧杯或试管中混合

3、。加入10%APS和TEMED，轻轻搅拌使其混匀，避免产生气泡。配制SDS-PAGE分离胶分离胶浓度凝胶体积所需各组分体积（单位：ml）双蒸水30%Acr-Bis(29:1)分离胶缓冲液（4）10%APSTEMED10%5ml2.081.671.250.050.00210ml4.173.332.50.10.00415ml6.255.03.750.150.00620ml8.36.750.20.0084. 待胶灌至距离玻璃板顶端1.5cm的时候停止灌胶，加入蒸馏水水封。静置40分钟至1小时。5. 待分离胶凝固后（水层胶层中间出现折线），倒掉蒸馏水，用滤纸将水溶液吸干。6. 配制5%浓缩胶： 配制5

4、%SDS-PAGE浓缩胶凝胶体积所需各组分体积（单位：ml）双蒸水30%Acr-Bis(29:1)浓缩胶缓冲液（4）10%APSTEMED2ml1.140.340.50.020.0024ml2.280.6810.040.0046ml3.421.021.50.060.0068ml4.561.362.00.080.0087. 将浓缩胶溶液加至分离胶的上面，直至凝胶溶液到达前玻璃板的顶端。注意：灌胶速度要快，防止凝胶。8. 将梳子插入凝胶内，避免产生气泡。静置20分钟，等待浓缩胶聚合。9. 待凝胶聚合后，小心地拔出梳子，以免破坏加样孔。赶走气泡。二 SDS-PAGE电泳:1. 在电泳槽的内外槽灌至电

5、泳缓冲液。2. 制备样品：1） 蛋白样品：根据植物蛋白或动物组织蛋白定量结果，计算蛋白提取液加入量，制备上样溶液。蛋白提取液 + 5上样缓冲液 + 蒸馏水，上样量为40-60ug。制备的样品，煮沸5分钟，12,000 rpm离心5分钟，取上清，上样。3. 上样：蛋白上样顺序如下： 泳道12345678910样品Marker样品1样品2样品3样品4样品5样品6样品7样品8样品9体积10l20l20l20l20l20l20l20l20l10l4. 电泳：浓缩胶80V，约20分钟，分离胶100V，约1小时。一、 考马斯亮蓝染色 注：将提取的植物蛋白进行电泳，电泳后进行考马斯亮蓝染色。全细胞裂解液电泳

6、后，进行western blot检测。1. 将电泳后的PAGE 胶取出放入容器中，加入适量蒸馏水（以充分覆盖PAGE 胶为 宜），加热至沸腾后5分钟，弃去蒸馏水；2. 加入适量考马斯亮蓝染色液（液面覆盖凝胶即可）加热至沸腾后5分钟，弃染色液；3. 加入适量蒸馏水，加热至沸腾后5分钟，弃蒸馏水，重复此步骤至背景清晰。4. 观察拍照。Western Blot溶液配制：l 配制500 ml 1TBST溶液：50 ml TBST（ph8.3,10）+ 450 ml 蒸馏水l 配制100 ml 5%牛奶封闭液：4度保存5克脱脂奶粉+ 100 ml 1TBSTl 配制100 ml转膜缓冲液（甲醇）：CW0

7、044 Tris-Glycine（ph8.3,10）10 ml Tris-Glycine + 20 ml 甲醇 + 70 ml 蒸馏水 （4度保存）一转膜及染色实验材料：NC膜、滤纸、转膜缓冲液、丽春红染色试剂、水平摇床实验仪器、耗材：转膜仪实验步骤：1. 电泳完成后，小心打开玻璃板，去除浓缩胶，将分离胶剥离后，放入转膜缓冲液中平衡。2. 用剪刀剪相同大小的NC膜及滤纸，放入转膜缓冲液中平衡。3. 转膜：（半干转）1） 将平衡好的3层滤纸平铺于转膜槽底部。滴加转膜液润湿。2） 将胶平铺在滤纸上，赶平去气泡。3） 将平衡好的NC膜平铺在胶上，用玻璃棒赶平，确保膜与胶之间没有气泡。4） 再将3层滤

8、纸平铺于膜上，赶平。5） 盖好转膜槽上盖，压紧。插上电极，50mA/膜，转膜1小时。转膜：（湿转）150mA/膜，转膜1.5小时4. 丽春红染色1） 将转移后的膜完全浸入丽春红染色液中，摇动3-5分钟。2） 蒸馏水漂洗膜2-3次，直至膜上出现清晰条带。3） 再次用蒸馏水漂洗，去除染料。 二封闭实验材料：5%脱脂奶 封闭液实验步骤：用封闭液将膜室温封闭1小时三抗体检测：检测-actin，分子量43KDa实验材料：5%脱脂奶封闭液、抗-actin鼠单克隆抗体、山羊抗鼠IgG（H+L）HRP、TBST实验步骤：1. 在6 ml 5%的脱脂奶中加入2 l抗-actin鼠单克隆抗体（稀释度为1:3000）。2. 将膜浸入到一抗稀释液中，室温孵育1小时，或者4 孵育过夜。3. TBST漂洗7次，每次5分钟。4. 在10 ml 5%的脱脂奶中加入2 l山羊抗鼠IgG（H+L）HRP（稀释度为1:5000）。5. 将膜浸入到二抗稀释液中，室温孵育1小时。6. TBST漂洗7次，每次5分钟。四显影实验材料：DAB显色液实验步骤：1. 将试剂A和B以1:19的体积比混匀后即为DAB显色工作液。2. 将配制好的DAB工作液滴加到印迹膜上，孵育1-5分钟，显色。3. 将膜放入蒸馏水中，终止反应。第 7 页-