不同凝胶对应可分离物质.docx

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1、生物学和凝胶生物分子下游纯化的对象一般包括蛋白、酶、重组蛋白、单抗、抗体及抗原、肽类、 病毒、核酸等。纯化前首先需要测定生物分子的各物理和化学特性，然后通过实验选择出 最有效的纯化流程。L测定分子量、PI当目标蛋白的物理特性如分子量、PI等都不清楚时，可用PAGE电泳方法或层析方法 加以测定。别离范围广阔的Superose HR预装柱很适合测定未知蛋白的分子量。用少量离 子交换介质在多个含不同PH缓冲液的试管中，可简易地测出PL并选择纯化用缓冲液的 最正确PH.2 .选择层析方法假设对目标蛋白的特性或样品成分不太了解，可尝试儿种不同的纯化方法：-使用最通用的凝胶过滤方法，选择别离范围广阔的介质

2、如Superose、Sephacryl HR依据分子量将 样品分成不同组份。二用含专一配体或抗体的亲和层析介质结合目标蛋白。亦可用各种活化偶联介质偶 联目标蛋白的底物、受体等自制亲和介质，再用以结合目标蛋白。一步即可得到高纯度样 品。三体积大的样品，往往使用离子交换层析加以浓缩及粗纯化。高盐洗脱的样品，可 再用疏水层析纯化。疏水层析利用高盐吸附、低盐洗脱的原理，洗脱样品又可直接上离子 交换等吸附性层析。两种方法常被交替使用于纯化流程中。3 ,纯化大量粗品处理大量原液时，为防止堵塞柱子，一般使用sepharose big beads、sepharoseXL sepharose fast flow

3、等大颗粒离子交换介质。扩张柱床吸附技术利用多种STREAMLINE介 质，直接从含破碎细胞或组织萃取物的发酵液中俘获蛋白。将离心、超滤、初纯化结合为 -O提高回收率，缩短纯化周期。4纯化硫酸氨样品硫酸氨沉淀方法常被用来初步净化样品，经处理过的样本处于 高盐状态下，很适合直接上疏水层析。假设作离子交换，需先用Sephadex G-25脱盐。疏水 层析是较新技术，随着介质种类不断增多，渐被融入各生产工艺中。利用Hitrap HIC Test Kit和RESOURCE HIC Test Kit可在八种疏水介质中选择最适合介质及最正确的纯化条件。 低盐洗脱的样品可稍加稀释或直接上其它吸附性层析。5 ,

4、纯水糖类分子固化外源凝订素如刀豆球蛋白、花生、大麦等凝集素，可结合碳水化合物的糖类残 基，很适合用作别离糖化细胞膜组份、细胞、甚至亚细胞细胞器，纯化糖蛋白等。两种附 上外源凝集素的Sepharose 6MB亲和层析介质，专为俘获整个细胞或大复合物，如膜囊 等。6 ,纯化膜蛋白膜蛋白别离常使用去污剂以保持其活性。离子性去污剂应选用与目标蛋白相反电荷 者，防止在作离子交换时和目标蛋白竞争交换介质，籍此除去去污剂。非离子性去污剂可 以疏水层析除去。7,纯化单抗、抗原*单抗多为IgG,来源主要是腹水和融合瘤培养上清液。腹水有 大量白蛋白、转铁蛋白和宿主抗体等。Mabselect Protein G和P

5、rotein A对IgG的Fc区 有专一性亲和作用，能一步纯化各种不同源的IgG.血清互补剂如小牛血清可先用蛋白G预 处理，在培养前除去IgG,重组蛋白A介质Mabselect和rProtein A Sepharose FF对IgG有 更高的载量和专一性，基团脱落更少。脱落的rProtein A用离子交换Q Sepharose HP或凝 胶过滤Superdex 200,很容易去除。*疏水层析Phenyl Sepharose HP亦很适合纯化IgG.宿主抗体和污染IgG可用凝胶过 滤Superdex 200在精细纯化中去除。*纯化IgG抗原最有效的方法是用活化偶联介质如CNBr、NHs acti

6、vated Sepharose FF 偶联IgG,再进一步获取IgG抗原。*HiTrap IgM是用来纯化融合瘤细胞培养的单抗IgM,结合量达5mg IgM.HiTrap IgY 是专门用来纯化IgY,结合量达100mg纯IgY.8,纯化重组蛋白重组蛋白在设计、构建时应已融入纯化构想。样品多夹杂了破碎 细胞或溶解产物，扩张柱床吸附技术STREAMLINE便很适合做粗别离。Amersham biosciences提供三个快速表达、一步纯化的融合系统。-GST融合载体使要表达的蛋白和谷胱甘肽S转移酶一起表达，然后利用 Glutathione Sepharose 4B作亲和层析纯化，再利用凝血酶或因

7、子Xa切开。2.蛋白A融合载体使要表达的蛋白和蛋白A的IgG结合部位融合在一起表达，以IgG Sepharose 6 FF 纯化。二含组氨酸标记（Histidine-tagged）的融合蛋白可用Chelating Sepharose FF螯合 Ni2+金属，在一般或变性条件（8M尿素）下透过组氨酸螯合融合蛋白。HisTrap试剂盒提 供整套His-Tag蛋白的纯化方法。9 ,纯化包涵体蛋白包涵体蛋白往往需溶于6M盐酸胭或8M尿素中。高化学稳定性的Superose 12及 Sepharose 6FF凝胶过滤介质很适合在变性条件下做纯化。变性纯化后的蛋白需要复性至 蛋白的天然构象。Superdex

8、 75 Q Sepharose FF和Phenyl Sepharose FF分另U被发现有助 包涵体蛋白的复性。一般包涵体蛋白样品的纯度越高，复性效果越好。SOURCE 30 RPC反 相层析介质很适合纯化复性前的粗品，并可以lMnaOH重生此方法纯化后的包涵体蛋 白，复性回收率明显提高。10 .包涵体蛋白固相复性*近年许多文献报导将包涵体蛋白在变性条件下固定（吸附） 在层析介质上，一般用各种Sepharose FF离子交换层析介质。去除变性剂后，蛋白在介质 上成功复性，再将复性好的蛋白洗脱下来。固相复性防止了一般复性过程中蛋白质聚体的 形成，所以复性得率更高，而且无需大量稀释样品，并将复性和

9、初纯化合二为一，大大节 省时间及提高回收率。*固相复性方法也被用于以HiTrap Chelating金属螯合层析直接复性及纯化包涵体形式 表达的组氨酸融合蛋白；以HiTrap Heparin肝素亲和层析直接复性及纯化包涵体形式表达 的含多个赖氨酸的融合蛋白。两种亲和层析预装柱均可反复屡次重复使用，比一般试剂盒 更方便、耐用。11 .纯化中草药有效成分中药的化学成分极其复杂。传统中药多是煎熬后服用，有效成份多较为亲水，包括生 物碱、黄酮、葱醍、皂或;、有机酸、多糖、肽和蛋白质。灵活及综合性地利用多种层析方 法。如离子交换、分子筛、反相层析，更容易别离到单一活性成分。Sephadex LH-20葡

10、聚 糖凝胶同时具备吸附性层析和分子筛功能，例：如用甲醇别离黄酮氟，三糖贰先被洗下 来，二糖贰其次，单糖贰随后，最后是贰元。Sephadex LH-20可使用水、醇、丙酮、氯仿 等各种试剂，广泛用于各种天然产物的别离，包括生物碱、贰、黄酮、醍类、内脂、葩 类、留类等。*生物碱在酸性缓冲液中带正电，成为盐，HiTrap SP阳离子交换层析柱可以别离许多 结构非常近似的生物碱。相反，黄酮、慈醍、皂贰、有机酸等可溶于偏碱的缓冲液中，在 HiTrap Q阴离子交换柱上别离效果良好。*一般多糖纯化大多使用分子筛如Sephadex, Sephacryl,假设分子量在600KD以下，并 需更高分辨率，可选择新

11、一代的Superdex,一般植物可能含水溶性、酸溶性、碱溶性多种 多糖。综合利用分子筛及离子交换层析有助进一步获各组份纯品。另外，多糖药物需去除 可引起过敏的蛋白质，传统Sevag方法用丁醇脱蛋白需反复数十次。阴阳离子交换法可以 一、两步快速去除多糖中残存的蛋白质。SOURCES 15、30RPC反相层析也很适合各种中 药有效成分的检测、别离和放大制备。由于中药的成分非常复杂，SOURCE反相层析可用 范围为PH1-14 ,并可用lMNaOH, 1MHCL清洗、再生。比传统硅胶反相层析更易于工 艺优化及在位清洗，寿命也更长。12 .纯化肽类肽类的来源有天然萃取，合成肽和重组肽三种。肽容易被酶降

12、解，但可从有机溶剂或 促溶剂中复性，所以多以高选择性的反相层析如SOURCE 30RPC、SOURCE 15RPC.SOURCE 5RPC 或离子交换 Minibeads、Monobeads 作纯化。Superdex Peptide HR 是专为 肽分子纯化设计的凝胶过滤预装柱，能配合反相层析做出更精美的肽图。肽分子制备可用 离子交换配合凝胶过滤Superdex 30 PG.医学都市多功能13 .纯化核酸、病毒核酸的纯化用于去除影响测序或PCR污染物等研究。核酸可大致上分为质粒DNA、噬 菌体DNA和PCR产物等。病毒也可视作核酸大分子，和质粒DNA一样，可用别离大分子 的Sephacry S

13、-1000 SF、Superose或Sepharoce 4FF凝胶过滤介质去除杂蛋白，再配合离 子交换如Mono Q、SOURCE Q别离核酸。14 .纯化寡核甘酸寡酸昔酸多应用在反义(anti-sense) DNA、RNA测序、PCR和 cDNA合成等研究。合成后含三苯甲基的寡核甘酸以阴离子交换的Mono Q或快速低反压 的SOURCE Q在PH12下可除副产物，并防止凝集和保护基的脱落。载量大大高过反相层 析，可用做大量制备。不含三苯甲基的失败序列可用反相柱ProRPC去除。15 ,脱盐、小分子去除使用凝胶过滤介质Sephadex GIO, G15, G25, G50等去除小分子，效率高，

14、处理量 可达床体积30%,只需在进样后收集首1/3-1/2柱体积的洗脱液，就可以去除该填料别离范 围上限以下的小分子，简单直接。由于只是去除小分子，柱高10cm以上即可。整个过程 一般可于数分钟至半小时完成。Sephadex G25系列介质专为蛋白质脱盐而设计，预装柱 HiTrap Desalting (5ml)可用针筒操作。HiPrep Desalting (26ml)可在数分钟为多至 10ml样品脱盐。16 .疫苗纯化使用凝胶过滤介质Sepharose 4FF纯化疫苗，去除培养基中的杂蛋白， 处理量可大于床体积10%,柱高一般40-70cm,整个过程约半至一小时。目前使用此法生 产的疫苗品

15、种有乙肝、狂犬、出血热、流感、肺结核、小儿麻痹疫苗等。分子量较小的疫 苗可使用Sephacryl S-500HR,如甲肝疫苗等。17 .抗生素聚合物分析中国药典从2000年版起要求抗生素头抱曲松钠需要找出聚合物占产品的白分比，规 定使用Sephadex G10凝胶过滤法测定。18 .纯化-基因治疗用病毒载体SORRCE 15Q19 .纯化-基因治疗用质粒Q Sepharose XL, SOURCE 15Q, STREAMLINE Q, Sephacryl S500, Plasmidselect 在下游纯化中，可应用不同层析技术在纯化生物分子的同时，去除各种污染物。L去除内毒素内毒素又称热原。含

16、脂肪A、糖类和蛋白，是带负电的复合大分子。内毒素的脂肪A部份有很强的疏水性。但在高盐下会凝集，无法上疏水层析。利用疏 水层析试验盒(17-1349-01)可选择结合目标蛋白的介质而去除内毒素。内毒素与阴离子交换介质Q或DEAE Sepharose Fast Flow有较强结合。可在洗脱目标 蛋白后用高盐缓冲液或NaOH去除0利用CNBr或NHS Sepharose FF可偶联内毒素底物如LAL, PMB,自动成亲合层析介 质结合内毒素。内毒素经常是多聚体，凝胶过滤层析可有效地将之去除。20 .去除蛋白中的核酸大量核酸增加样本黏度，令区带扩张，反压增加，降低分辨率和流速。药审和食检对 核酸含量也

17、有严格限制。胞内表达蛋白的核酸问题尤其严重。核酸带阴电荷，在初步纯化时利用阳离子交换介 质如 STREAMLINESP, SP Sepharose Big Beads, SP 或 CM Sepharose FF, SP SepharoseXL结合目标蛋白，可除去大量核酸。核酸在高盐下会和蛋白解离，疏水层析介质很适合用来结合目标蛋白，在纯化蛋白的 同时去除核酸。利用核酸酶将核酸切成小片断，用凝胶过滤做精细纯化时便很容易去除了。21 .去除病毒和微生物病毒和微生物可成为病原，应尽量减除。结合不同层析技术，使用注射用水，用 NaOH定期进行仪器和凝胶的在位消毒和在位清洗，皆可防止污染物增加。病毒大都

18、有脂外壳。可用与目标蛋白电荷相反的S/D (solvent/detergent)处理，使 病毒失活，如Triton和Tween.再用适当的离子交换介质如CM Sepharose FF结合目标蛋 白，去除S/D.其它污染物可以改变pH和离子强度使其从目标分子中解离或失活，凝胶过滤介质 Superdex及多种吸附性介质，SOURCE都是很好的精细纯化介质，可去除多种微量污染 物。凝胶是指颗粒大小在I埃到10埃之间的混合物。高分子溶液和某些溶胶，在适当的 条件下，整个体系会转变成一种弹性的半固体状态的稠厚物质，失去流动性。这种现象称 为胶凝作用，所形成的产物叫做凝胶或冻胶.气凝胶是指分散系为气态的，

19、如：云，雾等，固凝胶有烟水晶等，液凝胶就是呈 液态的胶体，如氢氧化铁胶体。编辑本段举例：食品级葡甘露胶(Gum Konjac-GM)葡甘露胶(又称：魔芋胶)系一种新型多用途微粒状可食用胶。这里推出之葡甘露胶 是以优质魔芋中提取的葡萄甘露聚糖为原料，经脱杂处理后采用先进技术加工而成，其中 添加成分不含任何非食用化学配料或色素。与传统的琼脂、果胶、海藻胶等食品添加剂相 比，葡甘露胶在膨胀率、粘度、增稠、稳定性及使用方便程度上皆显著优于上述胶类，此 外尚具有特殊的优点：无需添加任何凝固剂，在无糖、低糖或高糖条件下，在酸性、中性 或碱性条件下，常温即可凝冻，凝胶性能理想；保持或强化了葡萄甘露聚糖所具有

20、的降 糖、降脂、减肥等保健功能，大大拓宽了魔芋应用的范围；价格低廉、使用方便。葡甘露胶能广泛用于食品、饮料、医药、日用化工、科研等领域，作为琼脂、果胶、 海藻胶等的替代产品，价格低廉，且使用时无需改变原有的设备及工艺，能大幅度降低添 加剂的使用本钱，是一种理想的新型凝胶添加剂。为满足不同产品开发的需要，一、凝胶 （果冻）型：能与各种天然果汁、物料及色素良好混合，作为广谱凝胶赋型剂，是制作果 冻、水晶软糖等的极佳原料，也可作为培养基支持体，且不需再添加其它任何胶类或碱性 成份；凝胶成型条件随意、脱杯完整，凝胶强度高、韧性大。用量：0.70.9%。用法： 在适量温水中溶胀35分钟，煮沸冷至70度左

21、右时加入糖及各种配料，冷却至室温即 成。二、培养基型：用作替代琼脂作为花卉及其它植物进行组织培养的支持体。组培苗根 粗、苗壮，使用效果理想，本钱大幅降低。用量：0.50.6%。用法：在温水中溶胀35 分钟，煮沸后冷却即可。三、果肉（茶）饮料型：作为稳定剂与悬浮剂，替代琼脂和竣甲 基纤维素等，广泛用于粒粒橙、果茶、果汁、豆奶、银耳羹、八宝粥等异相悬浮剂等（或 混合）饮料中，防止沉淀或分层。用量：0.150.25%左右。用法：在适量温水中充分溶 胀后加入物料中。四、冷冻制品型：用于冰棒、冰淇淋等各种冷冻制品，可增大膨胀，减 少冰晶，提高抗热融性，使产品更加爽口。用量：0.150.25%左右。用法：在适量温水 中充分溶胀后加入物料中。五、增稠型：用于果酱、米、面制品中，可增大膨胀率，提高 韧性，改善赋型和口感。是进口洋槐豆胶的理想替代物。用量：0.20.3%左右。用法： 在适量温水中充分溶胀后加入物料中。