辣椒育种.doc

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1、摘要：本文简要介绍了辣椒主要的几种育种技术与应用。概述了辣椒原种育种的田间管理以及种子采收的过程。辣椒的分子育种主要讲述了SSR标记育种技术，除此之外还有辣椒航天诱变育种与展望、花药离体育种与单倍体培养、基因工程育种等，并提出了辣椒未来育种的展望。关键词：辣椒；SSR标记；航天诱变；基因工程；花药培养辣椒( Capsicum annuum L.)作为我国一种主要的蔬菜，在四季蔬菜市场上都占有一定比例，对于蔬菜的周年供应起到重要的调节作用。过去的五年，辣椒在我国的栽培面积相对稳定，每年约130万hm2，给农民带来经济效益的同时，其相关产业也产生了巨大的经济效益。自上世纪60 年代生物技术被引入辣

2、椒的遗传育种研究以来, 在组织及器官培养、分子标记和基因工程等方面取得了较大的突破。“十一五”期间辣椒遗传育种研究被列入了国家“863”、国家科技支撑等项目及其他一些国家、部委的重要项目，重点支持研究领域包括：保护地辣椒遗传育种、加工辣椒遗传育种、分子标记辅助育种、多基因聚合育种、单倍体育种、雄性不育的研究和利用等。经过广大科研工作者的努力，辣椒遗传育种在资源的鉴定评价、分子育种、雄性不育机理研究和应用、材料创新和新品种选育等方面都取得了一定进展。1 辣椒原种育种技术辣椒采种田的栽培管理基本上与商品生产田相同。有一点不同的是采种的辣椒必须达到生理成熟才能采摘。这对于大果、辣味淡的品种尤为重要。

3、这里主要讲辣椒种果的田间管理以及采收和处理。1.1田间管理辣椒定植后,中耕除草要跟上。很多地区在不覆地膜情况下,提倡连铲三遍以提高地温,促进发根发苗。追肥浇水是秧苗早发育重要环节,还应采用铺地膜达到保墒和提高地温的措施,使辣椒迅速生长发育,早发育早封垄,为后来多开花、早结果赢得时间。这对于大型甜辣品种特别有利。能达到早熟、丰产的目的,能明显提高种子产量。整枝打杈对小型果实品种一般不采用。对于大型果实品种要注意整枝,只留第一花以下的一个分枝,其它下部侧枝及早摘除以保证养分供给采种果实的需要。根据不同品种结合气象条件,在植株生长旺盛时期留种果。而种果成熟期以安排在雨涝期前后为好。这样既可收到充分表

4、现品种特征的优良果实, 又免得种果遇雨霉烂。一般大型甜椒早期以第23层果实为好。进入后期也可在45层处留种果。霜前采收种子。小型品种的特征特性、标准性状,选留无病虫植株。坐果后应选留果型正、色鲜的作为种果,摘除其它花蕾和不正果实。选株时还要摘除杂株、弱株。1.2种果采收与处理辣椒种果成熟后,果皮变为红色、黄色或暗红色,将种果带柄摘下或剪下。凡辣椒皮薄品种,可将果柄扎起来挂起风干留种。面积大不宜用此法。厚皮品种如甜椒、半辣型、大型品种,采摘后不要马上切开剥籽,必须堆积起来后熟七天再切开剥籽,以提高种子发芽率,如随摘随采种未经一段后熟芽率就会降低。采摘种果必须在霜前采摘。后熟期间应防止冻害,保证种

5、子品质。经过后熟的种子,将种果切开,剥出种子。这样种子清洁,不用冲洗。晾晒时要放在通风阴晾处当天晾干,薄薄一层风干为好。晾晒时不要放在塑料布、水泥地、石板或金属器皿上,以免烫伤种子。最好在席子、尼龙纱或麻袋上晾晒,干燥后即可收藏。晾晒时防雨淋,防堆积过厚。优良的种子,经过严格采种后应具备纯度高、饱满、发芽势强、发芽率在85%以上,无病虫、无杂质,色泽纯正、净度高,表现固有颜色等特点。2 SSR标记在辣椒遗传育种中的应用2.1SSR标记的技术原理和技术特点 SSR标记也称徽卫DNA(microsatellite DNA)标记,是近年来发展起来的建立在PCR基础上的第二代分子标记。SSR是一类短的

6、串连重复序列基序(1一6个核苷酸)组成的简单重复序列,均匀地分布在整个真核生物基因组中,侧面有保守的单拷贝序列。根据两侧的保守序列设计引物,对基因组DNA进行PCR扩增,扩增产物采用高浓度的琼脂糖凝胶或聚丙烯酞胺凝胶电泳检测,便可显示出不同品种间SSR重复次数的差异1。2.2SSR技术在遗传多样性上的应用辣椒的种质资源丰富,遗传多样性分析是辣椒种质资源利用与保护的基础。分子标记的出现为遗传多样性分析提供了更深层次的技术,其中SSR标记因其具有高度多态性而成为遗传差异研究的主要工具。SSR标记的等位基因变异来源于基因组DNA复制时滑动,从而引起重复序列数目的变化,而不是单碱基突变或插人缺失造成的

7、,因此表现出高度的多态性。罗玉娣2等利用21对SSR引物对辣椒属种质资源进行鉴定,聚类分析结果表明,在相似系数为0.7 处把它们分成5类: 第一类只包括20号一个材料,第二类由17份材料组成,第三类包括一个材料,第四类有9份材料,第五类有5份材料。第五类的辣椒材料之间的亲缘关系最近。结果将辣椒果实类型一样的种质基本都聚在一起,说明用SSR标记来区分辣椒种质资源是可行的。2.3SSR技术在亲缘关系研究中的应用 作物育种实践中,杂种优势的利用是提高作物产量的重要手段。随着分子生物技术的不断发展,SSR标记技术在辣椒杂种优势利用中得到了应用。和传统的基于表现型的分析方法相比,基于SSR分子标记的分析

8、技术更具优势,它是基因组DNA水平的直接反映,不受环境因素的影响,数量几乎无限,且具有较高的多态性。利用SSR标记可以确定亲本间的遗传差异和亲缘关系,从而确定亲本间的遗传距离,进而划分杂交优势群体,以便合理地选配杂交组合,提高杂交育种的效率。杜晓华3等研究了国内外10份尖椒的遗传差异性,结果表明:10个辣椒自交系基于SSR标记的平均遗传距离为0.495,来自湖南的2号自交系和来自河南的10号自交系的遗传差异最小遗传距离为0.133,来自美国的3号自交系分别与来自湖南的6号自交系和来自安徽的8号自交系的遗传差异最大,遗传距离为0.737。在SSR聚类图上,在相似系数为0.6处可将10份自交系分为

9、3类:其中6号为一类,3号和9号为一类,其余聚为一类,这个分析结果和辣椒杂种优势育种实践相一致。可见,从遗传距离相对较大的类间选择亲本进行组配,可望获得较大的杂种优势。2.4构建辣椒遗传连锁图谱和基因定位构建辣椒遗传图谱及寻找与目标性状紧密连锁的分子标记是进行分子辅助选择育种的基础。所以,遗传图谱既是遗传研究的重要内容,又是作物资源、育种及分子克隆等研究的理论依据和基础。SSR标记作为重复性好的共显性标记,可以填补连锁图谱上较大的间隙,自其被发现以来,逐渐受到人们的重视。在其他作物如玉米、水稻、大豆及小麦等农作物的遗传图谱构建中得到广泛的应用。但是,利用SSR标记进行辣椒遗传连锁图谱构建及重要

10、农艺性状基因定位的研究报道却相对较少。Kang等和Lee等4,5分别用SSR标记技术构建了两个分子遗传图谱,总图距1320CM和1720CM。安静6等应用AFLPRAPD和SSR标记构建了辣椒的分子遗传连锁图谱,并进行了辣椒抗疫病基因的QTL定位。他们构建的辣椒分子遗传连锁图谱包括12个连锁群,70个标记位点,其中AFLP标记54个,RAPD标记巧15个,SSR标记1个,覆盖长度为4 29.02CM,平均图距为6.13CM,连锁群长度为4.30-85.85CM。在第4连锁群上检测到抗疫病基因的两个QTL位点:一个QTL位点的LOD值为2.89,在连锁群上的支持区域是O-7.2CM,距离最近的标

11、记E 41M 53-7仅0.4cM;另一个QTL位点的LOD值为4.18,在连锁群上的支持区域是13.6-35.6CM,距离最近的标记E 41 M 52-6为7.0CM,两个QTL可解释表型变异的贡献率分别为9.5%和16.4%。3 航天诱变在辣椒育种上的应用3.1辣椒航天诱变现状 目前，世界上只有中国、美国和俄罗斯掌握卫星返回技术，但美国、俄罗斯两国的研究重点在载人航天及太空环境上（Merkys&Laurinavichyus，1991）。蔬菜航天诱变育种方面，在20世纪80年代初，美国将番茄种子送上太空长达6个月之久，在地面试验中得到了变异植株7。中国自1987年以来，在国家“863”计划和

12、重点攻关等项目的资助下，科学工作者多次利用返回式卫星和神舟飞船搭载植物种子、菌种、试管苗等进行航天诱变育种研究，同时也取得了一系列开创性研究成果，在航天诱变育种领域我国处于国际领先地位8。目前，从事辣椒航天诱变育种工作的单位主要有甘肃省航天育种工程技术研究中心和黑龙江省农业科学院等。黑龙江省农业科学院将龙椒2号种子经卫星搭载后又经地面多代选育，获得了太空椒87-2新品系9，育成辣椒新品种宇椒1 号和宇椒2 号及系列新品种4 个10；甘肃省航天育种工程技术研究中心利用选出的太空诱变优良材料为亲本现已培育出9 个辣椒杂交新品种11。目前在辣椒育种中航天诱变育种作为一种新型育种手段，其研究方法尚处于

13、摸索阶段，并没有一个成熟的研究体系。3.2空间诱变育种在辣椒中的应用 辣椒是重要的蔬菜作物，根据辣味的有无可以分为甜椒和辣椒。辣椒含有人体必需的多种维生素、矿物质元素、纤维素、碳水化合物、蛋白质、有机酸等,深受人们的喜爱。根据市场需要培育出早熟、高产、优质、抗病品种是辣椒育种主要目标。辣椒属于果菜类,单株产量取决于花数、座果数、采收期,同时还受株型、叶量、光合效率以及对环境条件的适应性和抗病性等因素的制约,因此,选育时要进行多方面的综合考虑。太空育种是近年来开创的一种新的诱变育种模式, 太空环境中诸多因素(宇宙辐射、微重力、高真空水、弱地磁场)综合作用,打破了生物体内固有的统一平衡,激活作物种

14、子内在因素,使作物的形态特征、经济性状、生育性状等发生变异。邓立平12等将青椒干种子搭载于科学返地卫星上, 种子在空间特殊条件下运行,返回陆地后,测定种子发芽率、幼苗同工酶及后代植物学性状、抗性、产量; 进行果实营养分析等。经多代选育,获得优良青椒新品系“卫星87-2”。且“卫星87-2”于2002年通过黑龙江省农作物品种审定,命名为“宇椒一号”成为我国首次通过航天诱变育种新途径培育成的青椒新品种。该品种特性:果大(单果平均重200g最大可达400g),质佳(Vc及可溶性固形物含量分别比对照提高20%以上),抗病(高抗疫病、耐毒病),适于露、棚两用栽培,更适于保护地栽培。在大棚种植,株高可达1

15、.0m以上,产75000kg/hm2以上。至今在全国各地已累计推广1.3万hm2。郭亚华13等通过航天诱变与常规育种,杂种优势利用相结合的育种新途径,表型标记与生化标记,及分子标记相结合的植物育种新技术,创造聚优质、多抗、高产等优良性状为一体的辣椒新品种(品系)建立了辣椒航天诱变高效育种新体系。裴孝伯14等研究了航天诱变辣椒品种及搭载材料在玻璃温室中的生育和产量表现,结果表明:航天辣羊角椒616生长势强,平均单果重为76g左右,单株总产量为44019g,可以用于现代温室栽培。 总之,空间处理具有变异幅度大、有益变异增多、有利于加速育种进程和改进品质等特点,并有希望从中获得传统育种方法较难获得的

16、、对产量和品质等重要经济性状产生重大影响的罕见种质材料,成为培育突破性品种的有效途径之一, 为作物育种开拓了一个新的边疆。3.3航天诱变技术的展望目前关于航天诱变育种的机理尚不清楚，理论体系尚未完善，这严重影响和制约空间育种向纵深方向发展。因此，亟需加强航天诱变育种的应用基础研究，创建航天诱变育种理论体系，进一步指导辣椒航天诱变育种实践。4 辣椒花药培养与单倍体育种 利用植物花药或未授粉子房培养获得单倍体植株,再经染色体加倍形成纯合二倍体,是应用生物技术进行新品种选育的一种有效方法。同时,辣椒的花药培养也是获得无毒种苗的途径之一。在蔬菜作物中,辣椒是最早进行花药培养并取得成功的实例之一。早在1

17、973年,王玉英等利用“跃县小辣椒”单核靠边时期的花药,通过花粉胚状体途径首次获得了单倍体植株。之后,在辣椒花药的培养方法、培养基的组成和培养条件上不断有新的改进。虽然现阶段辣椒花药培养可以在一些品种中获得一定比率的单倍体植株,但是还存在以下几方面的问题:一是基因型影响显著。对于一些新材料的花药培养往往需要对花药培养条件、培养基成分进行研究,筛选出适合的条件。并且不同基因型的材料,花药诱导率不同。Mityko等15在试验中发现,花药的诱导率最高可达178.2%,最低仅为1.0%,有些材料甚至对培养基没有反应。二是培养基成分和培养条件的相互作用关系并不清楚, 培养方法没有得到普遍的最优化。尽管近

18、些年来在培养基的组成及培养方法上有不断改进,但是目前在较多的研究中仍采1981年Dumas建立的方法,即利用SNGM培养基进行诱导,MS培养基促进胚状体发育16。在进行花药培养过程中, 为提高诱导率往往会进行各种预处理, 如离心、低温、高温等17。三是花药培养诱导单倍体植株的发育调控的机理尚不明确。有关控制辣椒花药培养中胚发生率的基因及其遗传规律的研究尚未见报道。花药培养的另一重要意义是采用该方法建立双单倍体(double-haploid,DH)群体。同时,因DH群体具有遗传上的纯合基因组,它也是建立RAPD、RFLP、SSR等分子标记和基因图谱的理想材料。5 基因工程育种 基因工程育种有利于

19、打破种间生殖隔离,实现异源基因重组,进而创造辣椒新种质或新品种。自1990年Liu等首次报道通过根癌农杆菌介导成功地转化辣椒以来,有关辣椒转基因及转化体再生的研究日渐增多,主要包括抗病、抗虫、抗除草剂、品质改良等方面的研究。5.1抗病在辣椒基因工程中,据Murphy报道,用电激法转化将peppermottle potyvirus(辣椒斑驳病毒)和CMV病毒外壳蛋白基因转入Numex Rnaky等五个辣椒品种的原生质体,成功获得了转基因辣椒18。近年来,利用农杆菌介导的叶圆盘转化法先后将抗病的黄瓜花叶病毒外壳蛋白基因(CMV cp)、烟草花叶病毒外壳蛋白基因(TMV cp)、核糖失活蛋白(RIP

20、 gene)基因以及昆虫抗菌肽(Cecropion)基因等外源基因导入辣椒,获得了抗病抗虫的转基因辣椒19,20。5.2抗虫培养抗虫植物是基因工程的另一个重要应用领域。目前经常使用的抗虫基因主要有三种,一是从微生物苏云金杆菌分离出的苏云金杀虫结晶蛋白基因,简称Bt基因。二是植物凝集素基因(lectin gene)。三是从植物中分离出的昆虫的蛋白酶抑制剂基因,其应用最为广泛的是豇豆胰蛋白酶抑制剂基因(CpTI)。柳建军等21将豇豆胰蛋白酶抑制剂(CpTI)基因转入辣椒, 并在对转基因植株进行抗虫性研究后发现,R1代植株对棉铃虫(Heliothis armigera Hubner) 表现出一定的抗

21、性,但不同转化体之间的抗性存在差异。杨广东等22将修饰的豇豆胰蛋白酶抑制剂基因(sck)导入甜椒杂种中获得了转基因植株,室内离体叶片饲虫和田间自然抗虫性鉴定表明,转基因植株对棉铃虫具有一定抗性。5.3抗除草剂除草剂能有选择性地有效控制杂草,从而降低了除草的劳动强度,极大提高了农业劳动的生产效率,因而在现代农业生产中得到了广泛的应用。可是,使用除草剂受其选择范围小、种类不多等不利因素的影响,限制了它广阔的应用前景。选育耐除草剂的农作物品种自然也就成了当代作物育种工作者的一大新课题。目前仅Tdaftais等报道,将带有pat基因的质粒pKB16.41导入红甜辣椒,获得了对除草剂PPT(Phosph

22、inothricin,膦丝菌素)的耐受力有显著提高的转基因再生植株。影响辣椒遗传转化发展的原因之一是辣椒外源基因导入的方法比较单一,主要采用农杆菌介导法(且多为根癌农杆菌),较少利用基因枪、电激法、子房注射、花粉管通道法和超声波法等。迄今仅有Murphy等23采用电激法介导辣椒的原生质体进行转化和郭亚华等13采用花粉管通道法将外源DNA导入辣椒的报道。另一阻碍辣椒遗传转化发展的原因是转化频率太低。董春枝等24在将CMV卫星RNA互补DNA导入甜椒中,转化率仅为1%, 而最近毕玉平报道的转化率虽有所提高,但也仅有2.6%25。影响转化频率的因素除了植株再生困难外,还与农杆菌侵染能力、材料基因型和

23、转化条件等因素有关。因此,进一步完善辣椒离体再生体系,优化转化方法,拓展转化途径和外源基因来源谱是今后辣椒的遗传转化研究的工作重点。6 辣椒育种展望6.1加强分子育种研究 “十一五”期间分子标记辅助育种技术得到了快速发展，生物技术向传统育种方法渗透的步伐加快，在开发与重要性状连锁的分子标记、克隆重要性状的相关基因方面取得了较大进展，有的单位开始把分子标记应用到实际育种工作中，但是存在少数重复研究现象，分子标记应用还不广泛。同时国外在辣椒基因组学、基因克隆、分子图谱、分子标记方面发展很快，在应用上甚至将分子标记辅助选择技术作为育种公司里的常规技术使用。今后仍需要在分子育种方面加大投入，促进分子育

24、种的更快发展和提高分子育种的实用性。6.2种质创新、自主品种的研发是重点国家从战略层面提出了科技创新，在育种中，种质创新、应用基础方面的研究尤其重要。目前品种的同质化严重，尽管培育的品种很多，但市场上的辣椒品种性状相近、同物异名的现象屡见不鲜。育种家通过基因的引进、聚合，注重种质和育种材料的创新，将对辣椒产业持续发展提供强有力的支撑。6.3育种目标应更具前瞻性 育种目标应走在市场和生产的前面。应密切注意栽培模式、生产区域、市场的变化及辣椒生产者和消费者对辣椒品种需求的趋向。由于育种工作的周期长、市场和生产需求变化快，应加强基础性研究，包括新基因的挖掘、抗逆抗病性的鉴定方法、非流行新病害的检测鉴

25、定技术等。 参考文献1 周岚，陈殿元.SSR分子标记技术及其在玉米种子鉴定上的应用J.中国种业, 2005:51-52.2 罗玉娣,李建国,李明芳.用SSR标记分析辣椒属种质资源的遗传多样性J.生物技术通报,2006.3 杜晓华,巩振辉.辣椒优良自交系间遗传差异的分子分析J.西北植物学报,2006,26 (12):24452552.4 Kang B C,Nahm S H Huh J H , et al.An interspecifie(Capsicum anuum x C.chinens) F2 linkagemap in pepper using RFLP markers. Theor. A

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